Western blot 이란 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 이용하여 분리하고, 니트로셀룰로오스 membrane에 옮긴 후 찾고자 하는 단백질의 항체(1차 항체)와 결합시킨 후 이 항체와 반응하는 2차 항체를 이용하여 밴드를 형상화 하는 것이다. Western blot 기술은 3가지 요소를 사용하여 복합체에서 특정 단백질을 분리하는 작업을 수행한다. 즉, 크기별 분리, 단백질을 고체 지지체로 이동, 1차 및 2차 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하여 시각화 한다. 특정 표적 단백질을 인식하고 결합 하는 동물 유래 항체 ( 1차 항체 로 알려짐 )가 생성된다. 1차 항체를 인식하고 결합하는 2차 항체가 추가된다. 2차 항체는 염색, 면역 형광 및 방사능으로 특정 표적 단백질을 간접적으로 검출할 수 있다. 다른 관련 기술에는 도트 블롯 분석, 정량적 도트 블롯, 면역조직화학 및 면역세포화학이 포함되며, 여기서 항체는 면역염색 및 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 조직 및 세포의 단백질을 검출하는 데 사용된다.<중 략>생리학적 pH에서 Glycine은 쯔비터 이온으로 존재한다. running buffer에 첨가된 Glycine의 Pi는 6.2이며 낮은 pH에서 양전하를, 높은 pH에서는 음전하를 띈다. stacking gel의 pH는 6.8로서 glycine은 약한 음전하를 가진다. Glycine, 단백질, Cl-는 모두 음 전하를 띄어 전기영동에서 (+)극으로 이동하게 된다. Cl-은 항상 음이온이며 분자량이 아주 작기 때문에 가장 빨리 이동하게 된다. Glycine은 stacking gel(pH 6.8)에서 거의 중성에 가까운 – charge를 띄기 때문에 매우 느린 속도로 이동한다. 때문에 Cl-와 glycine간의 이동속도 차이가 생기게 된다. 또 두 이온사이의 높은 전위차로 glycine은 본래보다 빠른 속도로 Cl-이온을 뒤따르게 된다. 이때 이동속도는 glycine<단백질<Cl-이다.
이번 실험은 추출 및 TLC를 통해 액체 감기약의 해열성분을 알아내는 것이었다. 시중에서 구할 수 있는 다양한 해열진통제 (아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 슈도에피드린 등)를 준비했다. 액체 감기약인 부루펜과 판피린은 추출을 통해 준비했다. 분액 깔대기에 넣고 EA를 넣어준 후 흔들고 고리 클램프에 걸어놓으니 밀도 차에 의해 층 분리가 되었다. 우리가 원하는 성분은 EA(밀도 0.9g/ml)에 있으므로 아래 물 층을 버리고 EA유기 층을 플라스크에 받았다. 타이레놀과 아스피린은 막자 사발에 곱게 빻아서 EA에 녹여 용액으로 만들어 준비했다. 이지엔6(이부프로펜)은 주사기를 통해 캡슐 내에 있는 내용물을 뽑아내려 했는데 잘 되지 않아서 조교님의 지시에 따라 구멍만 내고 EA를 첨가해 준비했다. 녹은 용액 부분만 유리모세관으로 TLC판에 살짝 찍어 묻게 했다. 육안으로 묻은 건지 확인이 안되어서 제대로 된 건가 싶었는데 결과를 보니 제대로 찍혔던 것 같다.
1. 실험 결과-한계반응물malonic acid는 3.1g, 즉 30mmol을 첨가했고 benzaldehyde 는 3ml 를 첨가했으므로3ml x 1.044g/ml x 1mol/106.12g = 29.5 mmol 이므로 한계반응물은 benzaldehyde이다, -Cinnamic acid 수득률Cinnamic acid의 이론적 수득량은 0.0295mol x 148.16g/mol = 4.37g이다.실제수득량은 38.186g-35.542g = 2.644g 이므로수득률은 2.644g/4.37g x 100(%) = 60.5%이다.-Knoevenagel reaction mechanism & Doebner modification mechanism2. 고찰이번 실험은 Cinnamic acid의 합성 및 재결정을 통해 Knoevenagel 반응을 익혀보았다.
NMR Spectroscopy (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) 는 구조 결정에 사용되는 많은 분광학적인 기술 중에서 가장 가치 있는 분광학적 기술이다. 1H 그리고 13C와 같은 자기성 핵이 강한 자기장에 놓였을 때, 이들의 스핀은 외부 자기장에 대해 같은 방향 또는 반대 방향으로 배열한다. 라디오파의 조사에 의해서 에너지가 흡수되고 핵은 낮은 에너지 상태에서 높은 에너지 상태로 스핀 젖혀짐을 일으킨다. 이 라디오 주파수 에너지의 흡수를 검출하고 증폭시켜 핵 자기공명 스펙트럼으로 나타낸다.분자 내 서로 다른 종류의 1H나 13C 핵은 서로 다른 세기의 외부 자기장에 의해 공명을 일으키고 서로 다른 흡수 신호를 나타낸다. 각 흡수 피크의 정확한 위치를 화학적 이동이라고 한다. 화학적 이동은 전자가 작은 국소적인 자기장을 형성하여 이웃한 핵을 외부 자기장으로부터 가로막아 일어난다.