결과레포트1. 제목: 식물 절편조직으로부터 캘러스 및 기관분화 유도2. 목적: 식물 조직 절편으로부터 캘러스 및 기관분화 유도 과정을 통하여 배지의 조성, 호르몬의 종류 및 농도, 배양 환경 등의 중요성을 살펴본다.3. 재료 및 방법:[실험재료]까마종, 무균대, 비이커, 시험관, 피펫, 핀셋, 메스, 여과지, 파라필름, 세제액, 70% 에탄올, 1% 하이포염소산나트룸(NaOCl), 증류수, 멸균수[실험방법]1)멸균작업1. 조별로 식물로부터 자엽, 상배축, 하배축, 잎, 뿌리 등을 선정한다.2. 선정한 식물체 조직을 퐁퐁물 속에 담궈 10분간 살균시키고, 증류수로 2～3회 세척한다.3. 70% 에탄올에 30초간 담근 후 증류수로 2～3회 세척한다.4. 1% 하이포아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 10분간 담그고 증류수로 3회 세척한다.5. 0.1% 염화수은(HgCl2) 용액에 4분간 담그고 멸균수로 5회 세척한다.*멸균수로 세척하는 단계부터는 무균대 내로 옮겨 무균 상태에서 수행한다.2)배양1. 멸균 배지가 들어있는 △flask를 무균대 내로 옮긴다.2. 멸균작업을 실시한 식물의 종자가 담긴 △flask를 무균대로 옮기고 식물조직을 꺼낸다.3. 여과지가 깔린 접시 위에서 살균한 시료를 1 ㎝ 정도의 크기로 자른다.4. △flask의 입구를 봉하고 있는 알루미늄호일을 벗겨내고, 절단한 조직(잎 또는 줄기) 절편 3~4개를 한천 배지 위에 얹혀 놓아 배지와 접촉이 잘 되도록 한다.5. △flask의 입구를 다시 알루미늄호일로 봉하고 파라필름으로 재차 봉한다. 식물명, 시료의 종류, 날자, 배지의 종류, 호르몬의 조성 등을 라벨링한다.6. △flask를 배양실로 옮겨 배양한다. 배양은 16hr light/8hr dark의 일주기 조건하에서 온도 28±1℃, 광도 1,500 lux에서 수행한다.7. 1~2 개월 동안 관찰하면서 곰팡이나 세균의 감염 여부 및 호르몬 농도에 따른 갤러스 형성, 기관분화 등 치상한 조직의 발달양상을 알아본다.** 실험이 끝나면 1) 차후의 .0/0.2를 보면 잎부분의 변화가 거의 없어 잎부분은 죽은줄 알았으나 점차 갈색으로 캘러스화 되는 것을 볼 수 있다.0/1을 보면 처음에는 뿌리가 발달되지 않았으나, 3주차부터 뿌리가 자란 것으로 확인되고, 25개의 플라스크 중 캘러스분화가 가장 잘 된 플라스크이다.그리고 0.1/0.05와 1/0.05를 보면 같은 종류로 보이는 곰팡이가 노랗게 폈는데, 이는 배지가 곰팡이가 살기 제일 좋은 환경이기 때문에 조금만 오염이 되어도 곰팡이가 핀다. 그래서 플라스크와 파라필름 그리고 은박지를 확인해 보았지만, 아무런 손상도 없었다. 그래서 식물 절편을 접종 할 때 멸균이 제대로 이루어지지 않아 오염되어 곰팡이가 피었다고 생각한다.그리고 세로축인 BAP의 처리농도가 높은 것은 슈트가 발달하고, 가로축인 NAA의 처리농도가 높은 것은 뿌리가 더 발달한다.이를 근거로 하여 위의 결과를 보면 BAP의 처리농도가 더 높은 1/0, 0.2/0, 0.1/0, 0.2/0.05, 1/0.05, 1/0.1을 보면 곰팡이가 핀 1/0.05를 제외하곤 모두 파랗게 슈트계가 발달한 것을 관찰할 수 있다. 그리고 0.2/0을 보면 줄기와 잎을 포함하여 슈트계가 제일 잘 발달하였는데, 이는 심은 곳의 간격이 충분히 넓고 관찰할 때마다 이슬이 제일 많이 맺힌 것을 보아 광합성을 제일 활발히 일으킨 것으로 추측하여 가장 활발하게 생장을 한 것으로 판단한다. 그리고 NAA의 처리농도가 더 높은 0/1, 0/0.1, 0/0.2, 0.05/0.2, 0.05/1, 0.1/1의 식물을 보면 캘러스 분화도 아주 잘 진행되었고, 0/0.2를 제외한 모든 플라스크에서 뿌리가 나온 것을 볼 수 있었다. 그리고 사진으로는 잘 안보이지만 하얀 솜털 같은 것이 보이는데, 처음에는 곰팡이 인줄 알았으나, 식물이 안 죽고 잘 분화되어, 계속 관찰을 더 해본 결과, 뿌리가 발달한 것으로 확인했다.6. 논의*배지의 조성은 식물의 생장에 필요한 필수원소가 모두 충족되고 있는가? 식물 종에 따라서 추가로 첨가해야 되는 원소들은생장, 뿌리끝의 발육과 작용에 반드시 필요하며 결핍하면 뿌리나 눈( 芽 )의 생장점이 붉게 변하여 죽는다. 토양중에 석회가 과다 하면 마그네슘, 철, 아연, 코발트, 붕소 등의 흡수가 억제된다.* 마그네슘마그네슘 ( Mg ) 은 엽록소의 구성원소로서, 잎에 많다.체내이동이 용이하며, 부족하면 낡은 조직에서 새조직으로 이동한다.광합성 . 인산대사에 관여하는 효소의 활력을 높이고 종자 중의 지유( 脂油 )의 집적을 돕는다.결핍하면 황백화 현상이 일어나고 줄기나 뿌리에 있는 생장점의 발육이 나빠진다.체내의 비단백태질소가 증가하고, 탄수화물이 감소되며, 종자의 성숙이 나빠진다.석회가 부족한 산성 토양과 사질 양토의 경우 또는 칼리, 염화나트륨, 석회 등을 과다하게 사용한 토양에서 결핍현상이 나타나기 쉽다.* 황황 ( S ) 은 단백질 . 아미노산. 효소 등의 구성 성분으로 엽록소의 형성에 관여한다.결핍하면 단백질의 생성이 억제되고, 생육억제와 황백화가 일어 나며, 세포 분열이 억제 되기도 한다.체내 이동성이 낮고, 결핍 증세는 새 조직에서 먼저 일어난다.콩과 작물에서는 뿌리혹박테리아에 의한 질소 고정이 감소한다.황의 요구도가 크고 함량이 많은 작물은 양배추, 양파, 파, 마늘, 아스파라거스 등이다.* 철철 ( Fe ) 은 호흡효소의 구성성분으로 엽록소의 형성에 관여한다.결핍하면 어린잎 부터 황백화 하여 엽맥사이가 퇴색한다.니켈, 구리, 코발트, 크롬, 아연, 몰리브덴, 망간, 칼슘 등의 과잉은 철의 흡수. 이동을 방해하여 그 결핍상태를 초래한다.토양중의 철의 농도가 높으면 인과 칼륨의 흡수가 억제된다.벼가 과잉 흡수하면 잎에 갈색의 반점이나 무늬가 나타나고, 이것이 점차 확대되어 잎의 끝부터 흑변하여 고사한다.* 망간망간 ( Mn ) 은 여러가지 효소의 활성을 높혀서 동화 물질의 합성 및 분해, 호흡작용, 엽록소의 형성등에 관여한다.결핍되면 엽맥에서 먼 부분이 황색으로 변하며, 화곡류에서는 세로로 줄무늬가 생긴다.생리작용이 왕성한 부위에 많이 함유되어 있고, 체내 이나트륨은 기능면에서는 칼륨과 배타적 관계이지만, 제한적으로 칼륨의 기능을 대신 할 수 있으며 C4 식물에서 요구도가 높다.식물생장조절제식물체의 조직이나 기관에서 생합성된 후 체내를 이행하면서 다른 조직이나 기관에 대하여미량으로도 형태적,생리적인 특수한 변화를 일으키는 화학물질을 식물호르몬(plant hormone, phytohormone)이라고 한다.옥신류천연 : IAA, IAN, PAA합성 : NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, PCPA, MCPA, BNOA지베렐린류천연 : GA2, GA3, GA4-7, GA55시토킨류천연 : 제아틴, IPA합성 : 키네틴, BA에틸렌천연 : C2H4합성 : 에세폰생장 억제제천연 : ABA, 페롤합성 : CCC, B-9, phosphon-D, AMO-1618, MH-30*조직배양시 배지 내에 설탕과 유기첨가물을 공급하는 이유는 무엇인가?설탕을 공급함으로써 이차대사산물의 생산성을 향상시키고 배양기간을 단축시키고 수경재배시에는 자연광을 조사하는 것이 원칙이므로 식물체는 스스로 광합성을 통하여 탄수화물을 만들 수 있지만 조직배양에서는 인공광을 쓰는데 이때 사용되는 인공광의 조도는 일반적으로 식물로 하여금 광합성을 일으키게 하는데는 충분하지 않으므로 결국 식물생장에 필요한 탄수화물을 배지에 넣어주게 되며 3% 정도의 설탕이 주로 이 목적에 쓰이게 된다.*기관분화 유도시 NAA와 BAP를 대체할 수 있는 호르몬들에는 어떠한 것들이 있는가?Auxins세포의 신장 및 분열을 도모하며, 특히 뿌리부분의 성장을 유도한다.일반적으로 뿌리부분을 성장시키기 위해 사용한다.높은 농도의 Auxin은 callus 형성을 유도할 수 있다.2,4-D, IAA, IBA, NAA, picloram, 2,4,5-T 등이 있다.Cytokinins세포의 분열을 촉진하며 세포의 노화를 지연시키는 역할을 한다.형성층, 영양기관의 말단부, 어린잎등 세포분열이 많은 부분에서 다량 발견된다.Auxin과 함께 작용하면 마디와 잎의 신장을 유도하며, auxin이 많암세포와 같이 분화기능이 없고 탈분화 한 상태이다. 캘러스는 정기적으로 이식하여 배양하면 그대로 무한 증식할 수 있으나 어떤 조건하에서는 배양하면 싹, 뿌리, 배 또는 완전한 식물체까지 재분화시킬 수 있다. 배지에는 고체(한천)배지, 액체 진탕배지가 이용되어지나 때로는 옥신이나 시토키닌(cytokinin) 등의 식물호르몬을 필요로 한다. 액체 배지에서 배양하면 단세포로 분리되기 쉽고 배지나 세포밀도를 조절하면 단일세포 유래의 세포 집단(clone)을 얻을 수가 있는 것이다. 캘러스로부터 기관분화를 얻기 위해서는 식물의 세포, 조직 또는 기관을 분리하여 적당한 기내 조건하에서 생장, 증식, 분화를 유도해야 한다. 식물은 하나의 독립된 세포로부터 완전한 식물체로 분화할 수 있는데, 전체 형성능을 가지기때문에 세포나 조직을 무균 상태의 적당한 배양 조건에 두면 세포분열이 일어나 생장을 하고 기관분화가 일어나 줄기, 뿌리, 잎을 가진 완 전한 개체로 재 분화될 수 있다. 식물조직배양 기술은 육종에서 변이의 확대와 선발의 효율성 제고를 위해 활용되고 있으며 우량한 유전자형의 증식효율을 높이는 데에도 적용되고 있다.*식물 조직배양 기술은 어떻게 활용될 수 있는가?1) 영양계식물의 급속한 대량번식조직배양기술이 가장 크게 기여한 분야중 하나는 영양계 식물의 대량번식이다. 그중번식률이 낮은 난과식물의 생장점을 배양함으로써 단기간에 대량의 묘를 생산할 수 있게된 것이 가장 대표적인 응용의 예라고 할 수 있다.MOREL(1960)은 Cymbidium의 생장점을 이용한 조직배양에서 형성된 의 재생과 분할증식을 이용하여 유전적으로 균일한 묘를 대량 증식시킬 수 있는 기술을 발전시켰다. 이 획기적인 육묘기술에 의하여 1개의 생장점에서 산술적으로 1년에 대략 400만개 이상의 식물을 생산할 수 있게 되었지만, 실제 응용시 1개의 생장점에서 2만개 정도 생산하는 것이 가장 바람직하다.이렇게 난과식물에서 대량번식이 성공할 수 있었던 가장 큰 이유는 다른 식물의 증식에서는 볼 수 없는 원괴체 감염
결과보고서1. 제목 : Western Blotting2. 목적-단백질을 크기 별로 분리하는 기술. 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다.-sample(Total protein)을 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, 이 단백질을 membrane에 옮기는 과정을 거쳐 항원-항체 반응을 시켜 발광을 유도함으로써 검출한다.3. 실험방법Electophoresis Tool Assembly & Running1) SDS-polyacrylamide gel을 만든다.2) Gel에서 comb를 제거하고 전기영동 장치에 장착 후 1x running buffer를 넣는다.3 Well에 단백질 시료 또는 protein standard를 주입한다.4) (+)(-) 전극 위치 확인 후 뚜껑을 덮고 100~110V, 60~90분간 전기영동을 실시한다.5) Standard 전개 정도를 확인하고 전기영동을 종료한다.Antibody Treatment1)Blocking buffer 20 mL에 1차 항체(β-actin)를 넣어 1차 항체 용액을 준비한다.2)Blocking이 끝난 membrane을 1XTTBS로 1회 세척 후 1)의 1차 항체 용액을 넣고 shaker를 이용해 상온에서 한 시간 반응시킨다.3)1차 항체처리가 끝나면 1차 항체용액을 제거하고 1XTTBS를 넣어 shaker위에 올려둔다. 1XTTBS는 10분마다 교체하며 총 3회 세척한다.4)Blocking buffer 20mL에 2차 항체(anti-mouse)를 2ul 넣어 2차 항체 용액을 준비한다.5)3)의 세척이 종료되면 2차 항체 용액을 넣고 shaker를 이용해 상온에서 한 시간 반응시킨다.6)2차 항체처리가 끝나면 2차 항체용액을 제거하고 1XTTBS를 넣어 shaker위에 올려둔다. 1XTTBS는 10분마다 교체하며 총 3회 세척한다.Blocking1) 1XTTBS에 탈지분유를 5%농도가 되도록 녹여 blocking buffer를 준비한다.2)Transfer종료 후 membrane을 꺼내어 용기에 넣고 1XTTBS로 2회 세척 후 blocking buffer를 채워준다. (membrane이 잠길 정도, 약 25mL)3)shaker를 이용해 상온에서 한 시간 반응시킨다.(option) Shaking on 4℃ overnightDetection1)암실에 4개의 용기를 준비하고 현상액-물-고정액-물 순으로 넣어둔다.2)ECL 용액을 1:1로 섞고 증류수로 적절하게 희석시킨다.3)항체처리가 끝난 membrane을 편평한 접시 위에 올려두고 2)의 용액을 membrene위에 골고루 뿌리고 1분 반응시킨다.4)Membrane을 현상용 cassette에 넣고 암실로 이동한다.5)암실에서 필름을 잘라 현상용 cassette내의 membrane위에 올려 감광시킨다. 이때 감광시키는 시간을 1분, 5분, 10분 등 다양하게 해본다.6)감광된 필름을 핀셋을 이용하여 1)에서 준비한 4개의 용액 중 현상액에 넣어 나타나는 변화를 관찰한다.7)Band가 보일 경우, 1)에서 준비한 나머지 3개의 용액에 순차적으로 넣었다 꺼내는 과정을 반복한다.SDS_PAGE-시약 제조4.결과5.고찰Western blot은 다른 말로 immunoblot이라고 하는, 항체를 이용해 목표물이 되는 단백질을 잡는 실험 기법을 말한다.위의 결과를 보면 43kda 값으로 1열로 나열되어 있어야 하는데, 그 범위를 벗어나서 밴드가 2개가 형성되어 실험을 실패했다고 볼 수 있다. 그 이유는 단백질의 blocking이 제대로 되지 않아 membrane에 쓸데없는 단백질이 붙어서 band가 두 개로 형성된 것으로 추측한다.
식물 절편조직으로부터 캘러스 및 기관분화 유도 결과레포트 A+ 자료입니다
