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병원실습 조직병리파트

Part 1. 조직병리Ⅰ. 실습 설명 및 목적- 병리과는 세포 병리와 조직 병리로 나누어져 각각의 역할을 담당하고 있다. 조직 병리의 경우 환자로부터 채취한 생검 검체, 수술 검체가 대부분으로 요나 혈액, 객담과 같은 체액이 아닌 인체의 세포 및 조직으로 구성된 것들이 검사 요소들이다. 병리과에서는 수술 또는 위 내시경, 피부 생검 등 외과적 시술을 통하여 얻은 검체를 절취 과정(Gross)을 통하여 적당한 크기나 형태로 조직편을 잘라낸다. 도중 육안 관찰이 있으며 이 소견을 기록, 이후 절취한 조직들을 고정이나 포매 등의 과정을 통해 광학현미경적 관찰이 필요한 단계로 나아간다. 절취 과정(Gross)의 경우는 세포 병리 파트 실습 시(8.14~17)에 자세히 공부할 수 있게 된다.- 조직 병리실의 전체적인 흐름이 어떻게 되어 가는지를 알고 이에 따른 실험 목적과 방향을 공부하고 숙지하는 것이 주된 목적이다.- 무엇보다도 조직검사를 행하는데 있어서의 중요점은 ‘신속, 정확, 안전’ 이다.Ⅱ 실습 내용1. Gross에서 넘어온 후: 조직 관찰을 위해 포매 블록을 만든 후 얇은 절편으로 제작하여 염색을 통하여 세부적인 관찰이 이루어지게 된다. 제작한 슬라이드와 포매 블록의 경우, 환자의 정보 보호 및 장기적인 치료, 연구 등을 위해 영구적 보관 실시하게 된다.: Gross에서 넘어올 시엔 고정된 조직, 또는 동결 조직이 넘어오게 되는데 동결 조직의 경우는 신선 조직으로 응급, 신속 검사, 조직화학적 검사가 요구되는 경우가 많다. 또한 포르말린 용액의 고정엔 살균 과정이 존재하지만 동결 조직엔 고정 과정이 없어 감염 확률이 높아 이에 대해 주의가 요구된다.① 절편 제작 기본 과정 10단계: 고정 ? 수세 ? 탈수 ? 투명 ? 침투 ? 포매 ? 삭정 ? 박절 ? 염색 ? 봉입→ 기본적인 염색 (H&E stain)을 통하여 1차적 검진을 한 후, 요청이 들어올 경우 특수 염색 또는 2차 절편 제작 과정 등이 들어간다.? 제작 과정 각 10단계의 주요 목적고정조직의 자가 융해 및 부패방지포매조직표본 제작수세고정액 제거삭정제작한 블록 다듬기탈수조직 내 수분 제거박절절편 채취투명탈수제 제거염색조직 내 이상점 관찰침투조직 내 형태 유지봉입장기적 보관 및 관찰, 손상 방지, 부패 방지, 굴절률 완화[사진 1] A. 파라핀 포매 장치 B. 회전식(rotary) 박절기? 고정시엔 포르말린 고정을 주로 이용하며 큰 조직과 같은 경우엔 고정액의 침투가 느려 좀 더 오랫동안 고정시킨다. 수분은 2~4% 정도로 유지하며 수분이 과다할 경우 침투율이 저하된다. 또한 지방 조직의 경우, 지질이기 때문에 고정 과정에서 침투가 잘 되지 않아 절편 제작시에 고르지 못한 단면적이 만들어지기도 한다.? 박절 과정은 칼의 장착, 칼의 각도, 박절 두께 등에 따라 영향을 받는다.- 칼의 각도: 회전식 박절기?90°, 활주식(slide) 박절기?45°- 보통 3~4 μm정도로 박절이 이루어지며 신장 조직의 경우 2 μm로 조절.? 박절기(Microtome) 종류와 차이점- 회전식 박절기(rotary microtome): 칼 교환이 쉬우며 리본을 형성하여 연속 절편 형성이 가능하다.- 활주식 박절기(sliding microtome): 얇은 조직을 얻기 쉬우며 간단한 블록 cutting 과정이 이루어질 수 있으나 연속 절편을 얻기가 힘들다.- 이밖에도 동결 박절기와 초미세 박절기가 존재한다.- 병리과의 경우, 다량의 검체를 취급하며 연속 절편 형성과 쉬운 채취를 할 수 있어 대부분 활주식 박절기를 이용한다. (*사진 1-B 참고)? 박절한 절편은 45℃의 부유온수조(flotation bath)에 올려 절편을 펴준 후 슬라이드의 중심에 올려둔다. 이후 60℃의 신전기(slide warmer) 위에 올려 약 30~40분 정도의 건조 시간을 가진다. 건조의 목적은 파라핀을 녹여 슬라이드 위에 조직편을 고정시키기 위함이다. 신전기의 온도는 파라핀의 융점 온도보다 높게 유지한다.+ 연질 파라핀 융점: 52~54℃, 경질 파라핀 융점: 56~58℃+ 신전기에 올리기 전, 온수조 때문에 젖은 슬라이드를 잠시간 건조시키는 일이 있는데 이는 작거나 얇은 절편이 수분이 많은 채로 신전기 위에 놓일 경우 물이 기화 되면서 조직의 형태가 일그러지는 것을 방지하기 하기 위함이다.? 슬라이드의 종류에는 일반 슬라이드(무코팅)과 코팅 슬라이드로 나눠진다. 대부분 일반 슬라이드가 이용되며 코팅 슬라이드의 경우엔 점도가 떨어지거나 절편이 얇아 잘 말리는 경우, 또는 딱딱한 조직이 있을 경우에 사용한다. 또한 특수 염색 시에 이용되기도 하나 이 중, Giemsa 염색의 경우엔 슬라이드의 종류에 구분 없이 사용되기도 한다.2. 기본 염색① H&E 염색(Hematoxylin and Eosin staining)- 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)의 이중염색으로 가장 일반적으로 사용되는 염색법이다. 기본적인 현미경 진단에 쓰인다.- 헤마톡실린의 경우 주로 핵과 핵의 염색질 등을 청색으로 염색되며 에오신은 세포질을 적색으로 염색한다. 두 색의 대조를 통하여 조직을 관찰한다.- 병원에서는 주로 퇴행성 염색을 실시하며 Gill’s 헤마톡실린을 사용한다. Gill’s 헤마톡실린의 경우 goblet cell 등 작은 세포까지 염색이 가능하여 가장 많이 이용되기도 한다.+ 진행성 염색: 핵만 염색+ 퇴행성 염색: 과염색 후 탈색- 검사실에서는 대부분 염색 자동화가 이루어지는 기기를 이용한다.[사진 2] 자동 염색 기기? 퇴행성 염색 기본 과정: 자일렌-에탄올(고농도→저농도)-수세-헤마톡실린-수세-1% HCl-수세-암모니아수-수세-에오신-에탄올(저농도→고농도)-자일렌+ 기기는 H&E염색만 할 수 있는 게 아니라 기본적으로, 그리고 대다수로 이루어지는 염색법이기 때문에 가장 대표적으로 설정을 해두었다.+ 기기 제조 회사, 또는 지정 설정을 통하여 반복적인 단계의 횟수가 줄여지거나 늘려지기도 한다.Q. 헤마톡실린의 염색 후엔 수세 과정이 존재하는데 왜 에오신의 염색 후엔 수세 과정이 존재하지 않는가?A. 에오신의 성분 중 95% 알코올이 구성되고 있어 수세 과정을 딱히 가질 필요가 없다. 95%의 알코올의 과정에 washing과 탈수 효과가 함께 들어 있으며 슬라이드를 오래 담글 시엔 탈색되어 시간 설정에 주의를 요한다.3. 특수 염색- 특수 염색의 목적은 명확한 병리 판정을 위해 기본 염색 이상의 과정으로 특수 물질을 이용하여 세포 내 특이 물질을 포착하여 이를 염색하기 위함이다. 특수 염색에는 면역 화학적 방법을 이용한 염색이라거나 특수 염색액을 이용한 염색법(ex. PAS, 마손 삼색, 고모리 세망섬유 염색 등)이 있다.- 또한 이러한 염색법을 통하여 보다 상세한 암 진단 또는 항암제 처방, 암 전이 등 보다 정확한 치료법을 제시할 수 있다.① 면역 염색? 면역조직화학(immunohistochemistry : IHC)은 조직 내의 특정 물질을 항원-항체 반응을 이용하여 특이적으로 검출하는 방법이다.? 기본적으로 면역이란 체내에 들어온 항원에 대하여 몸 안에서 생성 된 항체가 반응하는 하는 것으로 이로 인한 인체 방어 과정이 이루어지는 것을 말한다. 이러한 항원-항체 반응은 항원에 대한 항체의 결합이 매우 특이적이어서 이를 이용한 검사법은 검출 민감도가 대단히 우수하다.? 면역조직화학은 이용하는 항체에 따라, 또는 표지자에 따라 분류된다.? 기본적인 고정-절편 과정을 이용하여 염색을 하거나 또는 이러한 과정 없이 염색하는 경우(ex. 동결절편)가 있는데 기본적인 포르말린 고정-파리핀 포매 과정을 이용하게 되면 알데하이드 고정으로 인한 결합이나 변형에 의해 항원에 다른 물질이 붙거나 항원이 수축 또는 손상되어 항원-항체 반응이 원활하게 이루어지지 않는 경우가 있다. 이러한 요소를 처리하기 위해여 ‘항원 부활(antigen retrieval)’ 과정을 거치기도 한다.- 항원 복원에는 heating, protinase, TRIS buffer 등이 이용된다.- 세포는 de-paraffin 과정을 거친다.? 암 종류의 상세 판정에도 이용된다. (ex. CD marker, 종양 표지자, DAB 등)? 항체를 섞는 액에는 sodium aldehyde가 이용된다.? 기기에는 다양한 항체가 들어갈 수 있으며 세부적인 조작을 통하여 요구 검사법을 적용할 수 있다.ex. DAB(diaminobenzidine): 발색제, 양성반응 시 갈색p53: 돌연변이 유전자 인식KI67: 자궁경부암, 자궁 및 태반 관련CRB2: 유방암 항암제 처방 관련EGFR: 항암제 관련? 항암제는 종양 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 알아봄으로써 존재하는 항원에 대한처리를 기본적으로 요구한다. 여기에는 유전자적 치료도 존재하며 항암 백신, 알맞은 항암제의 이용 등 다양한 작업을 위한 목적이 존재한다.② 특수 염색액을 이용한 특수 염색? 특수 염색액을 이용한 염색법은 인체 내의 각 부위, 가령 신경 조직, 근육 조직, 섬유 조직, 간 조직, 병원 미생물, 세포 내 탄수화물 등의 화학 물질 등을 특이적으로 염색하는 염색이다.[ 사진 3 ] 특수 염색 기기? 제일 많이 쓰는 염색은 PAS, Giemsa 염색이다.? 기기에 각각의 염색법에 다른 protocol이 존재하여 이를 컴퓨터로 설정 후, 알맞은 염색 시약을 loading 한 다음 고유 인식을 할 수 있는 바코드를 이용하여 확인 및 염색 과정에 들어가게 된다. 이 기기에서는 염색 시약을 25개까지 loading 할 수 있는데 설정 또는 시약의 개수에 따라 두 가지 이상의 염색법을 한꺼번에 실시할 수 있다. 또는 넣을 수 있는 slide의 개수에 따라 할 수 있는 염색법의 수가 제한되기도 한다. 이러한 횟수는 기기마다 다르며 쓰는 염색법에 따라 시약이 달라진다. 또한 기본적으로 이용되는 염색의 라인은 같으나 병원의 의사나 연구 등의 목적, 보다 효과적인 염색법의 실시를 위해 염색 시간 등이 아주 소량으로 조정될 수 있따.

의/약학| 2018.01.10| 6페이지| 1,000원| 조회(519)

병원, 실습, 조직병리, 병원실습

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간염 레포트

REPORT실습 날짜 :학번 :이름 :HBsAg test (ICA)1-1.실험목적 및 소개간염의 가장 흔한 원인인 바이러스의 혈청학적 검사이다. 바이러스성 간염의 과정은 다음 4가지 형 중 하나로 첫째는 황달을 동반하는 전형적인 간염 형태인 급성간염, 둘째는 간질환의 병력이 없는 건강한 사람에게서 간기능 손상으로 인한 최초 증상 발생 후 8주 이내에 급격히 간성뇌증으로 진행하는 경우, 혹은 황달이 생긴지 2주이내 간성뇌증으로 진행하는 경우인 전격성 급성간염, 셋째는 혈청속에 항체가 증명되며 간염의 과거력은 없는 황달없는 준임상적 감염, 넷째는 간염증과 괴사를 동반하며 최소 6달 이상 지속되는 만성 간염이 있다. 만성간염과 간암을 유발하는 바이러스는 HBV, HCV 가 있다. ICA를 이용하여 사람의 혈청 또는 혈장 중에 들어있는 B형 간염 바이러스 표면항원 (HBsAg)을 1회조작으로 검사한다.1-2.실험재료환자의 혈청, HBsAg kit, Dropper, 혈청분리관1-3.실험 방법① 채혈 후 tube를 원심분리한다.② 혈청분리관으로 혈청을 분리해낸다.③ 준비된 kit에 혈청을 100μL씩 취하여 타원형의 검체 점적부위에 떨어뜨린다.④ 검사 개시 후 20분이 지나면 결과를 판독한다. (20분 후에 나타나는 결과는 위양성으로 판정)*결과 판독 - 대조선 (C)와 검사선 (T)에 모두 밴드가 나타나는 경우 양성- 대조선 위치에만 밴드가 나오면 음성1-4.실험결과-결과 : 음성Anti-HBs test : 수신 적혈구 응집반응 (ICA)2-1.실험목적 및 소개ICA를 이용하여 사람의 혈청 또는 혈장 중에 들어있는 B형 간염바이러스 표면항원을 1회조작으로 검사한다. Nitrocellulosemembrane 중 검사선 영역에 HBsAg가 코팅되어 있고, 발색물질인 gold conjugate에 접합되어 있는 monoclonal mouse anti-HBsAg 와 검사하고자 하는 시료 중의 HBsAg가 반응하여 immunochromatographic 원리로 이동하여 검사선 영역에서 항원-항체 복합체를 형성하여 검사선(T)에서 보라색으로 발색한다.2-2.실험재료Anti-HBs Kit, Dropper, 환자의혈청, 혈청분리관2-3.실험방법① 채혈 후 tube를 원심분리한다.② 혈청분리관으로 혈청을 분리해낸다.③ 준비된 kit에 혈청을 100μL씩 취하여 타원형의 검체 점적부위에 떨어뜨린다.④ 검사 개시 후 20분이 지나면 결과를 판독한다. (20분 후에 나타나는 결과는 위양성으로 판정)*결과 판독 - 대조선 (C)와 검사선 (T)에 모두 밴드가 나타나는 경우 양성- 대조선 위치에만 밴드가 나오면 음성2-4.실험결과-결과 : 양성-결과: 음성Anti-HCV Immunochromatographic assay3-1.실험목적 및 소개ICA를 이용하여 사람의 혈청 또는 혈장 중에 들어있는 C형 간염바이러스에 대한 항체 (anti-HCV)를 1회 조작으로 검사한다. Nitrocellulosemembrane 중 검사선 영역에 monoclonalmouseHCV Ag가 코팅되어 있고, 발색물질인 gold conjugate에 접합되어 있는 monoclonal mouse HCV Ag 와 검사하고자 하는 시료 중의 anti-HCV IgG가 반응하여 immunochromatographic 원리로 이동하여 검사선 영역에서 항원-항체 복합체를 형성하여 검사선(T)에서 보라색으로 발색한다.3-2. 실험재료환자혈청, Anti-HCV ICA kit, micropiepett, 혈청분리관3-3. 실험방법① 채혈 후 tube를 원심분리한다.② 혈청분리관으로 혈청을 분리해낸다.③ 준비된 kit에 혈청을 100μL씩 취하여 타원형의 검체 점적부위에 떨어뜨린다.④ 검사 개시 후 20분이 지나면 결과를 판독한다. (20분 후에 나타나는 결과는 위양성으로 판정)*결과 판독 - 대조선 (C)와 검사선 (T)에 모두 밴드가 나타나는 경우 양성- 대조선 위치에만 밴드가 나오면 음성3-4.실험결과-결과 : 음성Alpha-fetoprotein, AFT test4-1.실험목적 및 소개AFP는 태아의 간 및 난황막에서 생산되는 태아성 단백의 하나로 분자량은 약 65000~75000 Da이다. 4%의 탄수화물이 포함된 당단백으로 태아의 혈청, 양수 등의 체액에 높은 농도로 존재하고 이외의 정상성인에서도 흔적 정도의 농도로 존재한다. 동물의 간암 때 혈중에서 나타나는 것을 발견한 후 같은 물질이 사람의 간암에서도 발견된다고 보고하여 암태아성단백으로서 주목된 이래 간세포암의 진단 마커로서 널리 이용되고 있다. 신생아에서는 혈청 AFP가 높아 출생직후 약 10~100μg/mL, 생후 약 1년에 성인과 비슷한 10 ng/mL이 되며 분만 후 급속히 감소한다. 임신 중 혈청 AFP 측정은 임신 경과의 지표로서의 의의가 있다.4-2. 실험재료환자혈청, AFP kit, micropiepett, 혈청분리관4-3. 실험 방법① 채혈 후 tube를 원심분리한다.② 혈청분리관으로 혈청을 분리해낸다.③ 준비된 kit에 혈청을 100μL씩 취하여 타원형의 검체 점적부위에 떨어뜨린다.④ 검사 개시 후 20분이 지나면 결과를 판독한다. (20분 후에 나타나는 결과는 위양성으로 판정)*결과 판독 - 대조선 (C)와 검사선 (T)에 모두 밴드가 나타나는 경우 양성- 대조선 위치에만 밴드가 나오면 음성4-3.실험결과-결과 : 음성5. 고찰이번 실습은 HBsAg, Anti-HBs, Anti-HCV, Alpha-fetoprotein 의 유무를 확인하는 실험이었습니다. 먼저 HBsAg 검사는 간염의 원인인 바이러스를 검사하는 것이었는데 A,B,C 등 여러가지 종류의 간염 바이러스 중 B형 간염 바이러스의 표면항원 (HBsAg)을 검사하는 것이었습니다. 이 B형 간염 바이러스의 항체의 유무를 검사하는 방법이 Anti-HBs test였습니다. 초등학생 시절 B형 간염 바이러스 항체 주사를 접종했다는 어머니의 말씀을 듣고 제 혈액 내에 B형 간염 바이러스 항체가 있을 것으로 예상했으나 실습 결과 제 혈청 내에는 B형 간염 바이러스에 대한 항체가 존재하지않는 것으로 나타났습니다. 저는 이번 겨울방학동안 병원 실습을 갈 예정이라 실습 후 급히 보건소에 가서 항체를 주사할 수 있게 되어 다행이었습니다. 또한 B형 간염 바이러스의 항체는 우리나라 인구의 60%가 가지고 있다고 합니다. 실습 결과 저희 조 8명 가운데 ( 조원의 혈액 체취가 힘들어 김지연 교수님의 혈액으로 대체하였습니다.) 3명에게서만 항체가 있는 것으로 나타나 저희 조에서는37.5%만이 항체를 가진 것으로 나타났습니다. 너무 적은 인원이라 %(퍼센트)로 따지기 애매한 수치이지만 3학년 전체인 49명의 항체 유무를 조사한다면 60%인 30명 정도가 항체를 가지고 있지 않을까 생각됩니다. 그 다음 실습인 Anti-HCV, Alpha-fetoprotein test 들 또한 각각 C형 간염 바이러스 , 간암 진단의 마커 였는데, B형 간염 바이러스의 항체 접종을 위해 보건소에 방문하였을때 기본건강검진서에 이 검사들이 있어서 우리가 실생활에 밀접한 검사를 실습한 것이었구나 라는 생각이 들어 놀라웠던 경험이었습니다.6. Reference-임상 혈청학 Handout (김지연 교수님-2017년 2학기 강의록)

의/약학| 2018.01.10| 7페이지| 1,000원| 조회(170)

면역, B형간염, 임상병리, 면역혈청학, 혈청, c형간염, 면역혈청, AFP

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PAS masson

Periodic Acid Sciff (PAS) reaction & Masson trichrome실습 일자 : 2017.11.06 (화)실습자 :1.Introduction-실습 목적 : PAS 염색법과 Masson trichrome을 사용하여 고정해둔 rat의 장기 (간, 콩팥, 뇌, 폐, 대장 등)들을 염색하여 관찰하고 염색의 방법 및 특징을 숙지한다.-Periodic Acid Sciff (PAS) reaction : PAS 염색은 적색과 청색(흑청색)으로 염색된다. 적색은 관찰하고자 하는 대상을 염색시킨 결과이고(양성), 당이 ferriodiz acid로 산화되어 생성되는 알데히드기가 sciff와 반응하여 적색을나타내는 것이다. 청색(흑청색)은 hematoxylin이 세포의 핵을 염색시켜 나타난 결과이다. PAS 염색은 특히 기저막에 당이 존재하는 신장이나 주성분이 당으로 구성된 효소가 존재하는 점액을 가진 대장 표본을 염색하기에 좋다.-Masson trichrome : MT 염색은 분자량의 차이로 조직을 염색하며 교원섬유를 관찰하기에 적당하여 간, 신장, 폐의 조직 염색에 많이쓰인다. MT 염색은 청색, 적색, 흑청색으로 염색되며, 청색은 교원섬유, 적색은 세포질과 근육, 흑청색은 세포의 핵이 염색된 결과이다.2. Methods & Meterials- 준비물 : 조직 표본(간, 신장, 폐, 뇌, 대장, 위), 혈청분리관, 염색판, 수세틀, xylene, alcohol(80, 90, 100 %), 1% acid alcohol?Periodic Acid Sciff reaction : bouin solution, P.T.A-P.M.A, 1% acetic acid, Biebrich scarlet-acid fuchsin, Aniline blue, harris hematoxylin,?Masson trichrome : 0.5% periodic acid, sciff reagent, harris hematoxylin , 1% HCl alcohol*참고) 시약제조- 0.5% periodic acid : D.W 100 mL + picric acid 0.5 g- sciff reagent : D.W 192 mL + basic fuchsin 2 g + Conc. HCl alcohol 8mL + sodium sulfite 5 g- bouin solution : picric acid 375 mL + formaldehyde 125 mL + Glacial acetic acid 25mL- P.T.A-P.M.A : Phosphotugstic acid 12.5 g +Phosphomolybdic acid 12.5 g + D.W 500 mL- 1% acetic acid : Glacial acetic acid 5 mL + D.W 495 mL- Biebrich scarlet-acid fuchsin : 1% Biebrich scarlet 2.7 g + 1% acid fuchsin 0.3 g + acetic acid 3mL + D.W 300 mL- Aniline blue : Aniline blue 12.5 g + D.W 500 mL + Glacial aceticacid 5mL-Periodic Acid Sciff reaction순서방법소요시간11harris hematoxylin 염색5분1탈파라핀 (xylene) 1회1분121% HCl alcohol로분별 후 중화10분2탈파라핀 (xylene) 2회1분13흐르는 물에 수세5분3탈파라핀 (xylene) 3회1분14탈수 ( 알코올 80%)7분4함수 ( 알코올 100%)1분15탈수 ( 알코올 90%)1분5함수 ( 알코올 90%)1분16탈수 ( 알코올 100%)1분6함수 ( 알코올 80%)1분17투명 (xylene) 1회1분7흐르는 물에 수세3분18투명 (xylene) 2회1분80.5% periodic acid으로 산화15분19투명 (xylene) 3회1분9Sciff 시약으로 발색15분~30분20봉입1분10흐르는 물에 수세5분-Masson trichrome순서방법소요시간13흐르는 물에 수세5분1탈파라핀 (xylene) 1회1분14과량의 염색액 제거 후P.T.A-P.M.A 용액으로 처리15분2탈파라핀 (xylene) 2회1분15수세 (dip)5분3탈파라핀 (xylene) 3회1분161% acetic acid로 감작10분4함수 ( 알코올 100%)1분17Aniline blue 용액으로 염색5분5함수 ( 알코올 90%)1분18흐르는 물에 수세3분6함수 ( 알코올 80%)1분19탈수 ( 알코올 80%)1분 30초7흐르는 물에 수세3분20탈수 ( 알코올 90%)1분 30초8bouin solution에 slide 넣고 65 ºC 부란기에서 매염25분21탈수 ( 알코올 100%)1분 30초9흐르는 물에 수세10분22투명 (xylene) 1회1분 30초10harris hematoxylin 핵염색3분23투명 (xylene) 2회1분 30초11흐르는 물에 청색화5분24투명 (xylene) 3회1분 30초12Biebrich scarlet-acid fuchsin용액으로 염색5분25봉입3. ResultsPAS - 간MT - 간PAS - 뇌MT - 뇌PAS - 폐MT - 폐PAS - 신장MT - 신장PAS - 대장MT - 대장PAS - 위MT - 위4. Discussion이번 실습은 PAS와 MT 염색법에 대한 것이었다. 짧게 얘기하자면 PAS 염색은 적색 - 관찰 대상과 청색(흑청색) - 으로 염색되며, MT염색은 청색 - 교원섬유, 적색 - 세포질과 근육, 흑청색 - 세포핵으로 염색된다. 이 두 염색법의 공통점은 헤마톡실린을 사용하여 세포핵을 염색한다는 점이고, 차이점은 PAS는 주로 당 성분을 가진 조직, 장기를 염색한다는 것과 MT는 주로 교원 섬유와 같은 섬유 조직을 염색시킨다는 점 이었다. 이러한 특징들을 가지고 위 결과를 본다면 두 염색법의 차이를 관찰 할 수있다. 예를 들어 간이나 폐조직의 경우, MT 염색법이 훨씬 더 관찰이 용이한 염색법임을 알 수 있다. 이처럼 조직의 구성 성분이나 특성마다 관찰에 필요한 염색법이 다 다름을 알 수 있었다. 조직들을 PAS 염색법으로 염색하는 도중에 실수가 한 가지 있었다. 원래의 순서대로 였다면 1% HCl alcohol 용액으로 분별 후 10분간 중화시키고 나서 흐르는 물에 수세 했어야 했는데 중화시간의 착오로 10분이 아닌 5분 동안만 중화를 하게 되었고 조직이 마를까 바로 흐르는 물에 수세를 하려고 했었다. 수세틀에 슬라이드 글라스들을 다 끼워 넣고 나서 수세를 하러 실습실 싱크대에 가기 직전에 다시 한 번 검토한 결과 중화 시간이 짧았음을 깨달았다. 중화 시간이 분명히 부족했을 것이기 때문에 짧은 시간 물에 담근 상태임에도 불구하고 수세틀에서 슬라이드들을 다시 꺼내어 1% HCl alcohol 용액을 다시 분주하고 부족했던 5분을 더 기다린 후에 다음 단계들로 진행하였다. 물론 중화 시간을 잘못 지킨 것부터가 큰 실수였지만 조원들과 상의 끝에 빠르게 판단하여 다시 중화 과정을 거칠 수 있어 다행이었다. 이번 실습에서의 가장 큰 실수였기 때문에 모두가 당황하여 아무런 결정도 내리지 못하여 시간도 오래 걸리고 과정도 복잡한 염색을 처음 부터 다시 시행해야 할 뻔 했지만, 이런 실수를 통해 조직검사학 뿐만 아니라 다른 과목들의 실습 시간에도 Protocol을 충분히 숙지하고 정확한 반응 시간을 지키게 된 것이라고 생각한다. 실습 과정에서의 세 가지 아쉬운 점이 있다면 확실히 다른 조에 비해 PAS염색이 흐린 것이 눈에 보인다는 것과, 어차피 흐리게 나올 조직들이었다면 중화시간을 5분 밖에 거치지 않은 슬라이드들을 일부 남겨두고 나머지 일부의 슬라이드들만 다시 5분 중화를 거쳐 각각 5분, 5분 + 5분의 시간 동안 중화 시킨 슬라이드들을 비교해볼 걸 하는 생각이 들었고, 처음에 중화 시간이 틀린 것을 알았을때 조원들끼리 정하지 않고 조교님께 여쭤 보아 염색에 가장 지장이 없는 방법을 택할 걸 하는 아쉬움이 있었다. 또한 학교에 구비된 현미경들의 상태가 썩 좋지 않아 매번 작동하는 현미경을 고르고 골라서 실습에 사용하는데, 이번 실습에 사용된 현미경의 렌즈에 이물질이 묻어 조직 관찰 사진에서 흐릿한 검정색의 이물질들이 보여 관찰에 혼란이 있었다. 이번 실습은 여러모로 아쉬움이 많이 남는 실습이었지만 그만큼 배울 점이 많았다고 생각되는 실습이었다.

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조직학, 염색, 조직검사학, PAS, Masson, 탄수화물염색, massontri..

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Hand E stain

H&E stain실습 일자 : 2017. 10. 10 금실습자 :1.Introduction-실습 목적 : HE 염색법을 사용하여 고정해둔 rat의 장기 (간, 콩팥, 뇌, 폐, 대장 등)들을 염색하여 관찰하고 염색의 방법 및 특징을 숙지한다.-H&E stain : hematoxylin & eosin. 조직 관찰을 위한 가장 흔한 일반적인 염색이다. 염색 표본에서 핵은 hematoxylin에 의해 청색으로, 기타 세포질은 eosin에 의해 적색이나 분홍색으로 염색되어 세포핵과 세포질의 구분을 확실하게 관찰 가능하다.2. Methods & Meterials-재료 : 조직 표본, 혈청분리관, 염색판, 수세틀, xylene, alcohol(80, 90, 100 %), harris hematoxylin, 1% acid alcohol, eosin Y, ammonia water*참고) 시약제조 – Eosin Y : eosin Y 1g + ethanol 80mL + D.W 20mL + acetic acid 0.5mL- 1% acid alcohol : D.W 300mL + alcohol 700mL + HCl 10mL- ammonia water : D.W 1000mL + ammonia water 3mL순서방법소요시간11수세2분1탈파라핀 (xylene) 1회1분 30초12ammonia water30초2탈파라핀 (xylene) 2회1분 30초13수세2분3탈파라핀 (xylene) 3회1분 30초14eosin Y 세포질 염색7분4함수 ( 알코올 100%)1분 30초15탈수 ( 알코올 80%)1분 30초5함수 ( 알코올 90%)1분 30초16탈수 ( 알코올 90%)1분 30초6함수 ( 알코올 80%)1분 30초17탈수 ( 알코올 100%)1분 30초7흐르는 물에 수세2분18투명 (xylene) 1회1분 30초8hematoxylin으로 핵염색5분19투명 (xylene) 2회1분 30초9흐르는 물에 수세3분20투명 (xylene) 3회1분 30초10Acid alcohol (3회 dip)21봉입-염색3. Results염색 표본대장대장간간폐폐뇌신장신장4. Discussion이번 실습의 주제는 임상병리학과 입학 후 꽤 자주 듣고, 배운 H&E 염색이었다.H&E 염색은 앞서 Introduction 에서 말했듯이, hematoxylin & eosin의 줄임말로 조직 관찰을 위한가장 흔한 일반적인 염색이며 염색 표본에서 핵은 hematoxylin에 의해 청색으로, 기타 세포질은 eosin에 의해 적색이나 분홍색으로 염색되어 세포핵과 세포질의 구분을 확실하게 관찰 가능하다. 또한 원래 핵질은 염색되지 않는데, 만약 염색이 되었다면 핵질이 과염색 된 것이라고 볼 수 있다. 또한 acid alcohol 로 분별하는 과정이 너무 오래 걸리지 않도록 주의해야 한다.염색의 대상은 지난 학기 조직검사학 실습 시간에 해부한 Rat의 장기들로, 대장, 간, 폐, 뇌, 신장이었으며, 고정 후 박절까지 마친 상태였다. 약 21 단계의 염색 과정 후, 각 장기들을 현미경으로 관찰한 결과는 위의 사진과 같았다. 대장표본은 대장의 특징인 융모를 관찰 할 수 있었고, 폐 표본에서는 수많은 폐포들로 인한 공기 방울 같은 조직을 관찰 할 수 있었던 것 같이 각 장기마다의 특성을 관찰할 수 있었다. 하지만 몇몇 표본에서는 염색 과정 중 시간을 정확히 지키지 못했는지, 아니면 염색 시약들이 적절하게 분주돼지 못했는지 모르겠지만 조직을 뚜렷하게 관찰 할 수 없는 표본도 있었다. 몇몇 표본이 염색이 잘 되지 않아 현미경으로 관찰하는 과정에서 답답한 부분도 있었지만 그 표본들 덕분에 염색 과정에서 시간을 잘 지켜야 한다는 것을 다시 한 번 명심하게 되었고, 해부, 고정, 박절에 이어 염색까지 이어지는 실습이었기 때문에 조직검사학에 대한 이해도는 물론 흥미와 성취감까지 얻을 수 있는 유익한 실습이었다.5.Reference-고려의학-조직검사학-위키백과

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조직, 조직학, 조직검사학, 병리, He, H&E, hematoxylin, Eosin

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한냉응집소검사임신반응검사

REPORT실습 날짜 :학번 :이름 :한냉 응집소 검사(Cold agglutinin test) & 임신 반응 검사(Pregnancy test)실습일 :2017. 11. 08실습자 : 2015105018 안윤정1. 실험 목적한냉 응집소 검사와 그와 관련된 부가적인 실험(채혈, 적혈구 부유액 제조, 계단 희석법)을 이해함과 동시에 실험 기술을 익혀 임상병리사의 소양을 갖추고, 관련 질환과 임상적 의의를 이해한다.임신 반응 검사의 종류 및 방법, 임신 시 산모 신체의 변화와 검사 결과의 의의를 이해한다.2. 실험 소개1) 한냉 응집소 검사 : 한냉 응집소는 주로 혈청중의 IgM (드물게 IgA) 으로 적혈구 표면에 있는 glycoprotein의 polysaccharide인 I antigen ( I antigen, Pr antigen) 과 저온에서 반응하여 응집하며, Anti-I body 라고 불린다. Mycoplasma pneumoniae에 의한 primary atypical pneumoniae 환자의 혈청속에서도 나타나며 혈액형과는 관계없이 냉장온도에서 어느 형의 혈액형과도 응집반응을 일으킨다. 한냉 응집소 검사는 흉막폐렴 환자의 혈청내에 존재하는 한냉 응집소와 사람의 O형 혈구나 환자자신의 적혈구와 냉장온도 (4 ˚C) 에서 반응시켜 응집을 관찰한다.2) 임신 반응 검사(Pregnancy test) : 태반 친화성 세포 (cytotrophoblast cells)에서 분비되는 당단백인 HCG를 측정한다. HCG는 임산부의 요에서 분비되며 정상 분만 후 24~72 시간 후 급격히 떨어져 검출되지 않고, 임신 중 HCG 검사 시 음성일 경우 태아의 사산을 의미한다. HCG는 혈구 응집 저지 반응, 혈구 응집 반응, RIA 등의 방법으로 진단 가능하다.3. 실험 재료 및 방법1) 한냉 응집소 검사-실험 재료 : 원심 분리관, 원심 분리기, 채혈 도구, SST tube, EDTA tube, 시험관대, saline, 2% 적혈구 부유액, pipette, 냉장고, 혈청 분리관, 항온기,-실험 방법(1) 적혈구 부유액 제조① 15 mL 용량의 원심분리관 또는 시험관에 0.6 mL EDTA 혈액을 넣는다.② 약 10 Ml 정도의 0.85 % 생리식염수를 채우고 수회 완전 혼합하여 혈구를 부유 시킨다.③ 2000 RPM/5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 다시 식염수를 첨가하여 혼합한다. (3회 반복)④ 3회 세척 후, 상층액을 제거하기 전에 농축 혈구의 양을 기록한 후 상층액을 제거한다⑤ 알고 있는 농축 혈구의 양에 식염수를 가해 주면 원하는 농도의 혈구 부유액이 된다.* total volume = 100%(2) 계단 희석- 항체의 존재 여부 및 정확한 양을 확인하고자 할 때 사용한다.- 혈청학적 검사에서 혈청 중 항체의 역가 확인에 이용되며 양성반응을 나타낸 최종 시험관 희석율의 역수(희석 계수)로 표시한다.- 항원-항체의 비가 최적비를 이룰 때 가장 잘 일어나므로 항체를 정량적으로 측정하기 위해 항체를 2배 단계 희석한 각 희석 혈청에 일정량의 기지항원을 반응시킨다.시험관 번호12345678910생리 식염수(mL)0.80.50.50.50.50.50.50.50.50.5혈청(mL)0.2각 희석액 0.5ml씩을 다음 tube으로 옮기고 마지막 0.5ml는 버린다.5102*************01280희석도(1: )5102*************012802560혈구 부유액0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5반응 용량(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0최종 희석도(1: )102*************************** 10번 시험관까지 희석 후 10번 시험관에서 0.5 mL를 취해서 버린다.(3) 한냉 응집소 검사① 채혈된 시험관은 즉시 37 ˚C 항온수조에 방치 후 혈청 분리한다.② 계단 희석을 실시한다.③ 잘 혼합 후 parafilm 으로 막아 4 ˚C 냉장고에서 하룻밤 둔다.④ 다음날 냉장고에서 시험관을 꺼내 흔들어 보아 응집 여부를 관찰한다.⑤ 다시 37 ˚C에서 반응시켜 응집이 용해되는 경우, 응집이 일어난 최대희석배수를 역가로 한다.⑥ 보고 방법 ▶ Positive : 혈구 응집 덩어리가 크고 풀어지지 않는 경우▶ Negative : 혈구 덩어리가 풀어져 곱게 흐르는 경우▶ Trace : 혈구가 비교적 풀려져 있으나 약간의 응집 덩어리가 있는 경우⑦ Trace 전 단계의 최고 희석배수로 보고한다.* 정상치 : Negative (1:8)시험관12345678910생리식염수(mL)1.51.01.01.01.01.01.01.01.01.0혈청(mL)0.5각 희석액의 1.0 mL씩 연속적으로 배수 희석대조혈청2% 혈구 부유액-0.050.050.050.050.050.050.050.050.05최종 희석배수(1: )*************65121024‘2) 임신반응 검사- 실험 재료 : 혈청 또는 요 검체, HCG kit- 실험 방법① 검체와 반응판을 실온에 꺼내 둔다.② 측정하고자 하는 요 검체를 반응판의 적하창에 2~3 방울 떨어뜨린다.③ 요 검체가 반응판의 끝부분까지 확산될 때까지 기다린다. (3~5분)④ 결과 판정 ▶ 음성 : 대조선 ©에 한 개의 띠만 보이고, 검체선 (T) 에는 색이 보이지 않는 경우▶ 양성 : 대조선 © 와 검체선 (T) 가 각각 색띠를 보일 경우4. 실험 결과(1) 적혈구 부유액원심분리 전원심분리 후(2) 계단 희석10개의 시험관에 계단 희석 한 모습(3) 한랭 응집소 검사한랭 응집소 검사 전(냉장고에 넣기 전)냉장고에서 꺼낸 직후혈구들이 가라앉아 있다시험관을 흔든 후뭉친 혈구들이 풀어졌지만응집은 일어나지 않았다(4) 임신 반응 검사대조선에는 1개의 띠, 검체선에는 띠가 보이지 않았으므로 음성인 것을 알 수 있다.5. 고찰3학년 2학기 임상 혈청학의 첫 실습은 한냉 응집 검사와 임신 반응 검사였다. 한냉 응집 검사의 경우 검사를 위해 필요한 부가적인 실습으로 혈구 부유액 제조와 계단 희석이 있었다. 혈구 부유액 제조의 과정은 그리 복잡하진 않았지만 여러 개의 조가 순서 없이 원심분리를 해야 했기 때문에 기다리는 시간이 필요했던 실험이었다. 혈구 부유액을 제조하는 과정에서는 EDTA tube에 채혈한 혈액을 0.85% 생리식염수와 혼합하여 원심 분리 한 후, tube에서 상층액을 제거해야 했는데, 상층액을 다른 tube에 따라 버리면 될 것 같아 확 따라내 버렸더니 원심분리 하여 가라앉았던 혈구들이 풀어지며 상층액과 섞여 버리는 일이 발생했다. 그래서 다시 채혈을 하고, 0.85% 생리식염수를 섞은 후 다시 원심분리를 하여 tube를 가져와서 혈청 분리관을 사용하여 천천히 상층액을 제거하고, 남은 농축 혈구를 0.1 mL 덜어낸 후, 생리식염수 4.9 mL 와 혼합하여 2 % 혈구 부유액을 완성 할 수 있게 되었다. 이론으로만 들었을 때에는 살짝 헷갈리는 과정이었지만, 직접 해보니 이해가 완벽히 되었다. 실수는 계단 희석한 식염수와 혈청의 혼합액에 혈구 부유액을 혼합할 때 5번째 시험관에 혈구 부유액이 모자라 다른 9개의 시험관 보다 0.1 mL의 혈구 부유액이 덜 들어갔다. 혈구 부유액을 만든 후 용량을 확인했을 때에는 5 mL 의 정확한 양이 있는 것을 확인 했었는데, 막상 혈구 부유액을 분주 할 때 부족하게 되어 조원들 모두가 당황했었다. 이유를 추측 해보면, 파이펫팅이 미숙하여 혈구 부유액을 분주할 때 낭비가 있었지 않나 생각이 들었다. 혈구 부유액이 부족하다고 하여 마지막 실험 결과가 크게 오차가 있던건 아니었지만, 임상병리사로 취업했을 때 병원이든 회사든 검체나 진단에 큰 문제가 될 수 있기 때문에 앞으로 더 주의해야 겠다고 생각했다. 이번 실습은 실습법들이 이론으로만 들었을 때에는 살짝 헷갈리는 과정이었지만, 직접 해보니 이해가 완벽히 되어 아주 유익한 실습이었다.

의/약학| 2018.01.10| 7페이지| 1,000원| 조회(622)

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