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항체 제조 & western blotting analysis

Abstract이번 실험에서는 면역반응(immune response)을 이용하여 쥐(Mus musculus)에 항원(antigen)으로작용할 eGFP를 접종해서 면역반응을 유도하여 투여한 GFP에 특이적인 항체(an..

리포트| 2019.10.28| 10페이지| 3,000원| 조회(257)

항체, 면역반응, 항체 제조 & western blot

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Genomic DNA analysis from plant cells, Total RNA analysis from various plan organs, 식물의 막 지질의 추출 및 분리 평가A+최고예요

Genomic DNA analysis from plant cells, Total RNA analysis from various plan organs, 식물의 막 지질의 추출 및 분리Abstract이번 실험은 총 3주간 진행된 실험이었으며 첫번째 실험에서 애기장대의 잎과 뿌리에 존재하는 DNA를 DAPI로 염색하여 핵을 관찰하고 다른 형광의 빛을 내는 물질을 찾았다. 또한 다양한 조직에서 cell lysis를 한 뒤에 순수한 DNA만을 분리하여 서로 다른 조직에 존재하는 DNA의 양을 housekeeping gene을 이용해 발현량을 확인했다. 두번째 실험에서는 애기장대의 silique, 꽃, 줄기, 잎, 뿌리 조직으로부터 분리한 RNA를 추출하여 이를 각각 비교하여 ribosomal RNA가 가장 많이 발현되는 것을 확인했으며, mRNA를 RT-PCR을 사용해 cDNA로 합성하고 다양한 housekeeping gene을 이용해 각 조직에서 발현되는 양을 비교해봤다. 마지막 주차의 실험에서는 애기장대의 다양한 조직에서 DNA, RNA의 추출법과 다른 방법을 사용하여 순수한 lipid를 추출하였으며 이를 TLC를 사용해 분리시켰으며 PE와 MGDG를 external standard로 하여 분리된 lipid를 서로 비교해 보았다.Introduction세포에서 핵을 관찰하기 위해선 핵을 염색하여 관찰해야 한다. 이때 쉽고 간단하게 사용할 수 있는 시약으로는 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)가 있다. 이는 DNA를 염색함으로써 핵, chromatin의 morphology 등을 확인하거나 세포에서 핵으로의 permeability를 light intensity를 통해 비교하는 것에 사용된다. DAPI는 DNA의 minor grove에 있는 adenine과 thymine rich regions에 강하게 결합하는 푸른색의 형광을 띄는 형광 염색약으로 DNA에 특이적으로 결합하는 probe이다. DNA를 염색하기 위해서 세포 내부로 염색약을 침투로 나중을 위해 제거해야 한다. DEPC는 half-life가 30분 정도 되며 산물이 EtOh와 CO2이므로 autoclave로 쉽게 제거 가능하다. DEPC를 처리한 용액에서 향긋한 냄새가 나는 경우가 있는데, 이는 부산물인 에테르 때문이다. DEPC를 처리하는 방법 외에도 autoclave, baking, RNA work 만을 위한 용기를 사용하는 등의 방법으로 RNase로부터 RNA를 보호할 수 있다. DEPC는 발암물질로 추정되므로 DEPC를 다루는 실험에선 언제나 조심스럽게 다루어야 한다.[Figure 4. DEPC 화학 구조]이렇게 분리한 total RNA중 mRNA는 cDNA로 만들어 RT-PCR (Reverse Transcription PCR)을 이용하여 증폭시킬 수 있다. RT-PCR은 일반적인 PCR과 다르게 RNA를 cDNA로 만들고, 만들어진 cDNA가 기존의 PCR방식과 같은 방식으로 증폭되는 기술이다. cDNA(complementary DNA)는 mRNA를 주형으로 하여 reverse transcriptase와 DNA polymerase에 의해 합성된 DNA를 의미하고 mRNA로부터 reverse transcript된 DNA이므로 exon으로만 이루어져 있다.우선 cDNA로 만들 때 Oligo-dT, GoScript 5X reaction buffer, MgCl2, dNTPs, GoScript reverse transcriptase, DEPC water이 사용된다. 여기서 Oligo-dT는 thymine이 반복되는 서열로 구성되어 mRNA 3’에 존재하는 poly-A tail에 붙어 primer의 역할을 하게 되며, GoScript 5X reaction buffer는 reverse transcriptase에 최적의 환경을 제공해주어 cDNA로 합성될 때 효율을 높여주고 MgCl2는 cofactor으로 polymerase가 작동하기 위해 필요로 하는 양이온을 제공해 준다. 이러한 조건을 맞춰주고 25℃ heat block에서 5분간 an. primuline 화학 구조]Materials and Method-DAPI staining-먼저 DAPI을 만든 뒤에 1.7ml의 microtube에 DAPI 용액을 1ml씩 넣고 호일로 감싼다. DAPI 용액은 5㎕/ml in PBS로 한다. 그리고 3주에서 4주 된 애기장대 식물의 잎을 준비하여 1cm2의 크기로 핀셋과 가위를 사용해서 자른다. 그 다음 DAPI 용액에 넣고 5분동안 상온에서 암처리를 하여 반응시킨다. 그리고 PBS 용액으로 3회~5회 씻어낸다. 그 다음 슬라이드 글라스 윗부분이 잎의 뒷면이 오도록 하여 PBS로 mounting하고 cover glass로 덮는다. 그리고 형광신호는 형광 현미경의 UV 필터를 사용해서 관찰한다.-Genomic DNA analysis from plant cells-[Table 1. CTAB buffer의 조성]Final concentration100ml3% (w/v) CTAB3g (with heating)1.4 M Nacl (MW. 58.44)5M Nacl = 28ml20mM EDTA0.5M EDTA (pH 8.0) = 4ml20mM Tris-HCl (pH 8.0)1M Tris-HCl (pH 8.0) = 10ml2% (w/v) Polyvinyl pyrrolidone (PVP; MW. 40)2g (with heating)멸균해서 보관하며 사용 직전에 사용할 양을 계산하고 넣는다.0.2% (w/v) β-Mercaptoethanol1㎕ RNase A (10 mg/ml) solutionWater bath를 미리 60℃로 맞추고 어린 애기장대 식물체 조직 부위별로 1cm3가량 sampling 하여 200㎕의 CTAB buffer를 넣은 tube에 넣고 pestle과 micromoter를 사용해 분쇄한다. 그 뒤에 추가로 100㎕의 CTAB buffer를 넣고 60℃의 water bath에서 30분 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 tube에 300㎕의 chloroform을 넣고 5~6회가량 inverting을 하고 1sample buffer 조성]MixtureVolumeFormamide10㎕37% formaldehyde3.5㎕10x running buffer1㎕10x loading buffer2㎕RNA sample3.5㎕EtBr1㎕total21㎕그 다음 RNA를 loading하기 위해 위 table의 조성으로 buffer을 만든 뒤에 70℃의 heat block에서 10분간 반응을 한 뒤에 ice에서 5분간 식힌다. 그 다음 1x running buffer를 만들고 electrophoresis tank에 채워 electrophoresis를 하여 RNA의 양을 확인한다. 그 다음 새로운 tube에 RNA 5㎕, DEPC water 95㎕를 넣고 tapping을 하여 잘 섞어준다. 그리고 cuvette에 용액을 넣고 spectrophotometer를 이용해 RNA의 순도와 농도를 측정한다.RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해 밑 Table의 조성으로 mixture을 만들어 섞고 spin down하여 거품을 제거한다.[Table 5. cDNA 합성을 위한 mixture 조성]MixtureVolumeRNA (2㎍)1.7㎕Oligo-dT (100 pmol/reaction)1㎕DEPC water2.3㎕Total5㎕그 다음 70℃의 heat block에서 5분동안 반응을 시키고 ice에서 최소 5분동안 식힌다. 그 다음 아래 Table의 조성으로 만들어 섞고 spin down시켜 거품을 제거한다.[Table 6. cDNA PCR mixture]MixtureVolumeGoScript 5x reaction buffer4㎕MgCl22㎕dNTPs4㎕GoScript reverse transciptase1㎕DEPC water4㎕Total15㎕그리고 25℃ heat block에서 5분간 anneal 반응을 하고 42℃ heat block에서 60분간 extend 그리고 마지막으로 70℃ heat block에서 15분간 inactivate reverse transcriptase를 진행한다. 그 다음키울 때 agarose gel에서 키우게 되는데 이때 묻은 agarose로 인한 것이다. DAPI solution을 준비한 sample에 넣고 상온에서 5분간 암처리 하는데 이는 장시간의 빛을 받게 되어 형광의 빛을 내는 에너지가 약해지기 때문이며 5분 이상 반응시키면 DNA 외의 물질에도 비특이적인 결합을 하게 된다. Fig11과 Fig12를 통해 핵은 뿌리조직 보다 잎에 더 많음을 알 수 있다. DAPI는 워낙 염색이 잘 되는 물질이어서 실험을 하면서 큰 문제가 없었다.genomic DNA를 추출하는 실험에서 DNA를 추출하고 이의 순도와 함량을 알기 위해 Table8의 값을 구했다. 이 결과를 바탕으로 뿌리 DNA 농도가 다른 것에 비해 굉장히 낮게 나왔음을 알 수 있으며 어느 정도의 contamination이 된 것을 알 수 있다. Fig14는 housekeeping gene인 PP2A를 이용해 추출한 genomic DNA를 PCR로 증폭시킨 뒤에 서로 다른 조직에서 발현된 량을 확인한 것이다. Fig 14에서 줄기, 잎, 꽃에서 발현된 것을 확인할 수 있으며 silique와 뿌리에서는 나오지 않은 것을 볼 수 있다. 이러한 이유는 silique와 뿌리는 상대적으로 PP2A를 적게 보유하고 있기 때문에 확인하기 힘들다. 하지만 그렇다고 해서 band가 생기지 않는 것은 아니므로 실험 과정에서 문제가 발생한 것을 알 수 있다. 우선 뿌리의 DNA 농도가 굉장히 낮게 나와 band가 생성되지 않았으며, silique 또한 농도가 비교적 적어서 나오지 않았다. 이러한 농도 차이로 인해 줄기에서 가장 밝고 두껍게 band를 형성하였다.total RNA를 추출하는 실험에서 발현량을 확인하기 위해 1% RNA agarose gel을 만들어 전기영동을 하였는데, 이때 formaldehyde를 첨가하게 된다. 그 이유는 RNA는 single strand여서 밑으로 내려가는 과정에서 상보적인 결합을 하여 방해를 받을 수 있기 때문이다. formaldehyde는 RNA가0

자연과학| 2019.10.28| 23페이지| 3,000원| 조회(205)

Genomic DNA analysis, Total RNA analysis ..

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Cell migration

Abstract이번 실험은 immortalized human keratinocyte cell line인 HaCaT(Human, Adult, low, Calcium, High Temperature) cell을 계대배양하여 이를 12 well plate와 35mm culture plate에 각각 배양하여 scratch assay를 통해 wound healing 과정에서 cell migration을 관찰하였다. 계대배양한 5일차에 12 well culture plate에 배양시킨 세포의 F-actin을 관찰하였는데, 이때 세포의 위치를 확인하기 위해 DNA를 염색하는 시약인 DAPI를 사용하였으며, F-actin과 결합하여 안정시키는 Phalloidin을 FITC와 conjugation시켜 이를 direct immunocytochemistry를 이용하여 형광현미경으로 관찰하였다. 또한 35mm culture plate에 scratch assay를 하여 scratch 직후, 24시간 뒤, 48시간 뒤를 관찰하여 세포가 치유되는 과정을 관찰하였다.Introduction세포이동은 동물의 성장 및 생리 활동 등을 하기 위해 필수적인 역할을 하는 과정이다. 세포의 이동은 크게 비집단적 이동(non-collective migration)과 집단적 이동(collective migration)으로 나눌 수 있다. 비집단적 이동이란 주어진 자극에 빠른 반응을 보이는 비집단적인 이동으로 대표적으로 항원으로의 면역세포의 이동을 예로 들 수 있다. 집단적 이동은 neural tube 발달이나 epithelium tissue의 상처 치유 과정에 주로 일어나는 이동으로 서로간 신호를 주고받으면서 같이 이동하는 현상이다. 이는 다른 종류의 세포와 접촉이 일어난다. 집단적 이동의 대표적인 예로는 keratinocyte의 피부상처 치유 과정, 암세포의 metastasis, 외배엽성 세포의 neural tube로의 발생 등을 들 수 있다. 세포의 집단적 이동은 크게 두가지 특징이 존재한다. 첫번째 위해선 형광물질을 이용해 관찰하고자 하는 것을 염색한 뒤에 형광 현미경으로 관찰할 수 있다. 이때 핵을 관찰하고자 할 때 자주 사용하는 염색 시약은 DAPI (4’, 6-diamidino-2-phenylindole)과 PI (Propidium iodide)가 있으며 단백질을 관찰하고자 할 때는 주로 항체를 이용하게 된다. 단백질을 관찰할 때 immunocytochemistry (ICC)를 이용하여 세포에 존재하는 특정 단백질이나 항원을 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 볼 수 있다. ICC는 세포 내 존재하는 특정 단백질 또는 항원이 세포 내부 어디에서 발현하는지 또는 어느정도 발현하는지를 확인할 수 있다. 또한 ICC는 direct ICC와 indirect ICC의 두가지 방식이 존재하는데 direct ICC는 1차 항체에 형광물질을 붙여 direct로 관찰할 수 있는 방법이고, indirect ICC는 1차 항체를 인식하는 2차 항체에 형광물질을 붙여 관찰할 수 있는 방법이다. 이번 실험에선 F-actin과 결합하는 Phalloidin에 형광물질인 FITC를 결합하여 관찰하므로 direct ICC 방법을 사용한다. Phalloidin은 버섯으로부터 추출한 독성물질로 이는 F-actin에 붙어 actin을 안정화하고 actin filament에서 (-) end의 depolymerization을 방해하여 결국 actin dynamics를 방해하게 되는데, 이러한 특성으로 인해 F-actin을 관찰하고자 할 때 많이 사용된다. Phalloidin은 형광물질이 아니기에 관찰할 수 없으므로 형광물질인 FITC (fluorescein isothiocyanate)를 부착하여 관찰한다. FITC의 최대 흡수파장은 495nm이며 최대 형광의 파장은 520nm으로 녹색의 형광을 낸다.[Figure 4. Phalloidin FITC reagent]ICC를 통해 세포 내 단백질을 관찰하기 위해선 fixation과정이 필요한데, 이는 단백질이 변하지 않도록 하며 주로 formax 105 cell에 해당되는 cell suspension 부피를 계산하여 그 부피만큼의 cell suspension을 12 well culture plate 2개의 well에 각각 분주해준다. 그리고 3일간 37℃의 CO2 incubator에서 키운다.[Media change]2일에서 3일 기간에 old media를 suction으로 제거한 뒤에 새로운 media를 넣어준다.[Scratch assay]4일차에서 cell confluency가 가득 차게 되면 old media를 suction해 제거하고 1x PBS로 wash를 한다. 그 뒤에 1%의 FBS DMEM을 35mm culture dish에 2ml, 12 well plate 각 well에 1ml씩 넣어준다. 하룻밤이 지난 5일차에서 old media를 suction하여 제거한 뒤에 cell의 표면에 yellow tip을 사용해 scratch를 낸다. 그리고 1x PBS로 wash를 진행한다. wash가 끝나면 2%의 FBS DMEM을 35mm culture dish에 2ml, 12 well plate 각 well에 1ml를 넣어준다.[12 well plate experiment]6일차에 old media를 suction으로 제거한 뒤에 12 well plate 각 well당 1ml의 1x PBS로 3번의 wash를 한 뒤에 각 well에 ice cold 4% PFA 1ml를 넣어 상온에서 15분동안 fixation을 진행한다. 그 뒤에 4% PFA를 제거하고 각 well에 1ml의 1x PBS로 3번의 wash를 한다. wash가 끝나면 각 well에 0.2% Triton X-100 in PBS 1ml를 넣어주고 상온에서 30분동안 permeabilization을 한다. permeabilization이 끝나면 0.2% Triton X-100 in PBS를 제거하고 각 well을 1ml의 1x PBS로 3번 wash를 진행한다. wash가 끝나면 Phalloidin-FITC staining soluticratch assay를 통해 세포의 이동과 wound healing을 관찰하였다. 처음 HaCaT cell을 계대배양 하기 위해 기존 culture dish 바닥 전체에 Trypsin-EDTA를 분주하게 된다. Trypsin은 세포와 세포사이, 그리고 세포와 배양용기 사이에 존재하는 adhesion protein을 분해하는 효소로 adherent cell을 표면에서 떼어주는 역할을 하게 되며 여기서 EDTA는 2가 양이온 chelator으로 효소의 cofactor로 작용한다. 그 뒤에 complete media를 넣어 Trypsin을 inactivation을 시키는데, 여기서 complete media에는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 10% FBS(Fetal Bovine Serum), Penicillin-streptomycin이 존재한다. Complete media에 들어있는 FBS에 Trypsin inhibitor이 존재하여 기존에 분주했던 Trypsin-EDTA의 활성을 억제하여 세포가 더 이상 손상을 입지 않도록 도와준다. FBS는 단순히 부착세포의 부착을 도와주는 역할만을 하는 것이 아니라 세포의 성장에 필수적인 여러가지 growth factor, cytokine, protein들이 포함되어 세포가 자랄 수 있도록 도와준다. 이때 FBS는 heat inactivation 시킨 것을 사용하는데 그 이유는 complement protein이나 동물에 존재하는 미생물인 Mycoplasma를 제거하고 serum의 component에 보체 단백질이 존재하는데 이는 antigen이 존재하면 구멍을 뚫기에 heat inactivation을 하지 않을 시 실험에 사용되는 cell에 구멍을 뚫게 된다. 하지만 이 과정으로 인해 다른 유용한 amino acid, vitamins, growth factor도 파괴가 될 수 있다.HaCaT cell을 계대배양 하기 위해 cell number을hemocytometer을 이용하여 형광 빛을 띠게 된다. DAPI와 FITC를 이용해 촬영한 결과는 Fig7.이며 이는 F-actin을 관찰하기 위해 촬영하였으며 상처가 있는 부위와 상처가 없는 부위를 촬영했다. 여기서 Phase contrast를 통해 상처가 있는 부위와 상처가 없는 부위의 세포 모양이 다름과 상처가 있는지 없는지를 확인할 수 있다. DAPI의 형광파장을 촬영한 사진은 핵 내부에 존재하는 DNA를 보여주며 이것으로 세포의 위치를 확인할 수 있다. 마지막 FITC에 해당되는 형광 파장을 촬영한 사진은 Phalloidin이 결합되어 있어 F-actin의 위치를 알 수 있다. 여기서 상처가 없는 부위는 Phalloidin-FITC와 결합된 F-actin이 적으며 F-actin이 세포 내부에 전체적으로 분포 되어있는 것을 확인할 수 있다. 반면 상처가 있는 부위에서는 Phalloidin-FITC와 결합된 F-actin의 양이 상대적으로 많은 것을 확인할 수 있고 상처부위 방향으로 미세하게 leading edge가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 통해서 상처가 발생하였을 때 wound healing을 하기 위해 F-actin이 상처가 없을 상태보다 많이 형성된다는 것을 알 수 있다. 또한 가장자리 부분에서 녹색의 형광을 관찰할 수 있는데, 이러한 이유는 actin은 세포의 구조를 지지하며 cell migration으로 인해 leading edge가 형성되어 F-actin이 분포되어 있는 것을 알 수 있다.이러한 wound healing을 촉진시키는 방법으로는 ECM의 주요 성분인 Hyaluronan을 사용하면 되는데, 100~300kDa 정도 되는 hyaluronan fragment가 wound closure을 증가시키며 epithelia의 tight junction에서 발현되는 CD44와 ZO-1의 발현양을 증가시키며 P2X7 receptor을 activation 시킨다. P2X7 receptor의 activation은 세포의 proliferation과 woun)

자연과학| 2019.10.28| 13페이지| 3,000원| 조회(235)

세포, 이동, Cell migration, 세포이동

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Site-directed Mutagenesis & DNA sequencing

Abstract이번 실험은 site-directed mutagenesis의 방법 중 하나인 whole plasmid mutagenesis를 통하여 특정한 plasmid의 DNA에 돌연변이를 유도하여 이를 관찰하는 실험이었다. whole plasmid mutagenesis의 첫 번째 과정인 mutagenic PCR을 하면 mutation된 plasmid와 mutation되지 않은 original template DNA가 존재하게 되는데, 이러한 original template DNA는 두 번째 과정인 DpnⅠ digestion으로 제거할 수 있다. 사용한 plasmid으로는 크기가 3337bp이고 ampicillin resistant gene을 포함하여 원하는 mutation된 plasmid만을 선택하게 해주며, UV에 자극받게 되면 많은 형광 빛을 내는 GFP variant가 있는 pGFPuv를 사용하였다. GFP는 26.9kDa이며, 총 238개의 아미노산으로 이루어져 있고 11개의 beta-sheet 구조가 beta barrel을 이루고 있다. 실험은 Y66H mutation을 한 것, Y66H/Y145F로 mutation 시킨 것 그리고 wild type을 구하여 UV를 통해 관찰하였다. 결과인 [Fig 6.]를 보면 가장 왼쪽 wild type은 정상적인 녹색의 형광이 빛나는 것을 확인할 수 있고, 중간의 colony는 Y66H mutation시킨 것으로 파란색의 형광이 빛나는 것을 볼 수 있으며, 마지막으로 가장 오른쪽은 Y66H/Y145F mutation은 중간의 Y66H mutation시킨 것보다 더 밝게 빛나는 것을 볼 수 있다. 또한 Y66H mutation시킨 것의 colony가 가장 많은 것을 확인할 수 있다.Introduction이번 실험은 site-directed mutagenesis를 통해서 특정한 plasmid의 DNA에 돌연변이를 유도하여 이를 관찰하는 실험이었다. 우선 GFP(green fluorescent protein)는 자포 생명체들은 DNA에 존재하는 strand에서 5’-GATC-3’을 읽고 Dam methylase가 A(adenine)에 methylation시킨다. Dam methylase는 이러한 방법으로 외부로부터 온 DNA와 자신의 DNA를 구분할 수 있게 만들어 주며, mismatch로 인해 repair을 할 때 복제된 DNA와 template DNA를 구분할 수 있게 도와준다. dsDNA 양방향에 methylation되어있는 상태에서 replication이 진행되면 한쪽의 strain에만 methylation되어있는 hemimethylate된 상태가 되는데, type Ⅱ endonuclease인 DpnⅠ은 양방향에 methylation 되어있는 DNA는 절단하고 복제되어 hemimethylate된 DNA는 절단하지 못한다. 이러한 특성을 이용하여 새로이 만든 mutation된 plasmid는 보존되고 기존 original template DNA를 포함하고 있는 plasmid는 절단되어 원하는 mutation된 plasmid만을 얻을 수 있다.이렇게 선택적으로 mutation 시킨 plasmid를 얻으면 competent cell에 transformation시키는데 이 과정이 세 번째 과정이다. 많은 Competent cell이 존재하는데 이번 실험에서 사용한 cell은 BL21이다. BL21은 E. coli의 B strain에서 수정하여 만든 것으로 이는 많은 단백질을 발현시킬 수 있으며, 쉽게 유도되고 높은 밀도로 자란다. 이러한 cell은 재조합 단백질을 생산하기에 최적화 되어있는데, protease인 Lon과 OmpT의 결함으로 인해 재조합 시킨 protein을 digest하지 않으므로 protein을 얻고자 하는 실험에서 흔하게 사용된다. 하지만 plasmid DNA의 생산으로 사용되기에는 적합하지 않다.과거 실험에서 competent cell로 많이 사용된 DH5α는 E. coli의 k strain에서 수정하여 만든 것으로 이는 recA1 mutation으GC-3’Y66H Reverse5’-GCA TTG AAC ACC ATG GCT GAA AGT AGT GAC AAG TGT TGG-3’Y145F Forward5’-GGA CAC AAG CTT GAG TAC AAC TTT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC-3’Y145F Reverse5’-GAT GTA TAC ATT GTG TGA GTT AAA GTT GTA CTC AAG CTT GTG TCC-3’우선 [Table 1.]로 되어있는 primer을 준비한다.[Table 2. Mutagenic PCR mixture]ReagentVolumeFinal Concentration10x Pfu reaction buffer5㎕10mM dNTP mix (각각 2.5mM)4㎕Forward Primer (10 pmol/㎕)Reverse Primer (10 pmol/㎕) mix2㎕0.4μM0.4μMTemplate1㎕60ngPfu Plus DNA polymerase (5 unit/㎕)0.5㎕2.5unitDIW37.5㎕Up to 50㎕Total50㎕그 뒤에 PCR tube의 안에 [Table 2.]의 조성으로 시약을 만든다. 여기서 Pfu DNA polymerase는 과정의 마지막에 냉장고에서 꺼내 넣는다. 시약을 제조할 때 총 3개의 tube를 준비하는데, 여기서 1번 tube는 pGFPuv DNA + Green primer이며 2번 tube는 pGFPuv DNA + Y66H primer이고 마지막 3번 tube는 Y66H DNA + Y145F primer이다. 그리고 [Table 3.]의 조건으로 Thermal cycler를 사용하여 PCR reaction을 실행한다.[Table 3. PCR cycle]Pre-denaturation95℃30secDenaturation95℃30secRepeat 18 cyclesAnnealing55℃30secExtension72℃4minPost-extension72℃10minHold4℃∞2. DpnⅠ digestionPCR이 끝나면 PCR CAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGHindⅢAGCTGTACAAGTAA/AGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTC[Figure 8. Open reading frame][Fig 8.]은 data1의 서열을 정리한 것이며, 제한효소로 cutting한 장소를 노란색으로 표시했으며, start codon과 stop codon을 빨간 글씨로 나타낸 것이다.Met R I D S A A T Met V S K G E E L F T G V V P I L V E L D G D V N G H K F S V S G E G E G D A T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W P T L V T T F A Y G L Q C F A R Y P D H Met K Q H D F F K S A Met P E G Y V Q E R T I S F K D D G N Y K T R A E V K F E G D T L V N R I E L K G I D F KGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGGGGGCGGTATTATCCCTATTGACGCGGGCAGAACAACTCGGTCGCGCATACCTATTCTCAAATGACTGGGTGAGACTCACCGTCCCAAAAACATCTTACGGATGCTGACGGAAAGAATATGCAGGGTGCCTAACCTGAGGAAACCTGCGGCACTTATTTTGAAACGATGGAGGACCAAGGACTACCCTTTTTGCCAAAGGGGGGACAGGAACCCCTTATCTTGGGAACGGACTAAAAACCTCCAAAAA~727

자연과학| 2019.10.28| 22페이지| 3,000원| 조회(222)

실험, site-directed mutage, GFP

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P19 세포의 배양과 분화 유도, 분화 표지 유전자 발현 확인

Abstract이번 실험은 C3H/He strain의 7.5일이 된 생쥐 embryo를 다른 생쥐의 정소에 이식하여 발생된 다양한 세포와 조직들로 이루어진 teratoma를 분리한 세포로부터 구축된 embryonic carcinoma cell인 P19 cell line의 pluripotency를 이용하여 3배엽으로 만든 뒤에 Retinoic acid를 이용하여 P19 cell를 뉴런으로 분화를 유도하였으며 이를 RA 처리하지 않은 negative control과 marker gene인 Pax6 발현 차이를 비교하였다. 처음 P19 세포를 petri dish에 배양하여 Embryoid body가 형성되도록 만들었으며 중간 기간에 media change를 하였다. 그 뒤에 이를 tissue culture dish에 배양하여 어느정도 분화를 시켰으며 8일차에 RNA extraction을 진행하였다. 순수한 RNA만을 추출한 뒤에 이를 RT-PCR로 cDNA를 합성하였으며 최종적으로 electrophoresis를 통해 분리하였다.Introduction정자와 난자가 결합해 수정란이 되고 하나의 세포로 시작되는 수정란은 cell division을 하여 여러 개의 세포로 이루어진 blastocyst가 된다. Blastocyst 안쪽에는 inner cell mass라 하는 세포 덩어리가 존재하는데, 이 세포 덩어리는 cell division을 거쳐 embryo를 형성하게 되고 embryo는 하나의 개체로 발생하게 된다. 이러한 과정에서 inner cell mass의 세포들이 뼈, 피부, 혈액, 간 등의 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화하게 되는 것이다. 이런 inner cell mass의 cell을 blastocyst로부터 분리해 특별한 환경에서 배양하면 더 이상의 division은 일어나지 않지만 분화할 수 있는 능력은 보유하고 있는 상태의 세포를 만들 수 있는데 이런 세포를 embryonic stem cell이라 한다. Embryonic stem cell은 모든 king 단계를 거치고 primary antibody, secondary antibody를 붙이는 과정을 통해 목표로 하는 단백질의 발현을 확인할 수 있다. 또 다른 방법으로 ICC (Immunocytochemistry) or IHC (Immunohistochemistry)가 있는데 이는 세포 or 조직의 내부 어디서 단백질이 발현하는지를 확인할 수 있는 방법이다. 처음 세포를 고정시키는 fixation 과정을 거치게 되며 그 다음 물질이 세포 내부로 이동할 수 있도록 만드는 permeabilization 과정이 필요하다. 그 다음의 과정은 blocking으로 차후 western blot의 방법과 동일하다.이번 실험에서 All-Trans Retinoic acid를 이용해 P19 cell을 뉴런으로 분화한 것을 확인하기 위해 marker gene을 사용하였으며 사용한 gene으로는 Pax6이다. 이는 transcription factor이고 ectoderm 형성의 표지 유전자이다. 뉴런은 ectoderm에서 유래되므로 ectoderm marker gene으로 확인 가능하다. 이를 확인하기 위해서 세포로부터 RNA를 추출해야 하는데, RNA, DNA, 단백질의 개별적 층을 형성시켜 각각 추출할 수 있는 Acid Guanidinium thiocyanate Phenol Chloroform (AGPC) 방법이 있다. 여기서 세포 혹은 조직에 Trizol 용액을 넣어주어 homogenization 시킨 뒤에 chloroform을 가하고 centrifuge를 하면 3개의 층으로 나눌 수 있다. 이 방법에서 acid는 sodium acetate(pH 4.0)를 사용하며 이는 RNA를 DNA, 단백질로부터 분리시켜주는 역할을 한다. 산성 pH에서 단백질은 침전하게 되고 DNA 주변에 H+가 둘러싸게 되어 DNA의 net charge가 0이 되어 interphase에 존재하게 되며 RNA는 노출된 염기가 (+)charge를 띄어 물에 녹아 있을 수 있다. Guanidinium 조심스럽게 확인한 다음 사진을 촬영하고 다시 CO2 incubator에 넣는다.Day 3- EB media의 changepetri dish를 CO2 incubator에서 꺼낸 뒤에 살살 돌려 EB가 가운데로 모이게 한 뒤에 dish 가운데로 모인 EB를 pipet aid를 사용하여 모은 뒤 15ml conical tube에 넣는다. 그리고 EB가 중력으로 인해 가라앉도록 10분간 기다리고 10분뒤에 상층액을 micropipette을 이용하여 제거한 뒤에 500nM의 RA가 포함된 새로운 media 3ml를 넣는다. 그 뒤에 원래의 각 petri dish에 pipet aid를 사용하여 조심스럽게 EB를 넣고 세포가 한쪽으로 몰려 있지 않도록 dish를 돌려 세포가 퍼지게 만든다.Day 5- petri dish에서 EB를 tissue culture dish로 옮기기CO2 incubator에서 petri dish를 꺼내고 돌려 EB가 가운데로 모이도록 만든다. 그리고 이를 pipet aid를 사용해 모은 뒤에 15ml conical tube에 넣는다. 그리고 EB가 중력을 인하여 가라앉도록 10분간 기다린다. 그리고 60mm cell culture dish 2장을 준비하여 negative control, RA를 labeling하고 10분 뒤에 상층액을 micropipette으로 제거하고 RA가 포함되지 않은 media 3ml를 넣는다. 그 뒤에 각 cell culture dish에 EB를 옮기고 cell이 한쪽에 몰리지 않도록 dish를 돌려 cell이 퍼지도록 만든다.Day 6-7 – EB media change1일에서 2일 간격으로 media를 change해준다. 이때 cell이 바닥에 붙어 자라므로 suction을 하고 새로운 media를 넣으면 된다.Day 8- RNA extraction and RT-PCR1. RNA extraction우선 60mm cell culture dish 2장의 media를 suction해서 제거하고 PBS 1ml로 wash를 한다인]Fig11은 spectrophotometer을 이용해 추출한 RNA의 순도와 농도를 확인한 것으로 A260/A280의 값이 1.17, 그리고 A260/A230의 값이 0.68이 나온 것을 확인할 수 있다. 모두 적정 범위에 들어가지 못했다.[Figure 12. RT-PCR 결과]Fig12는 추출한 RNA를 housekeeping gene인 Gapdh와 ectoderm marker gene인 Pax6를 이용하여 RT-PCR을 하고 electrophoresis를 통해 분리한 사진이다. 여기서 Gapdh는 housekeeping gene으로 NC(negative control)과 RA(Retinoic acid)에서 동등한 농도로 실험이 진행되었다는 것을 알려주며 결과적으로 Pax6의 발현은 RA를 처리한 것에서만 발현된 것을 알 수 있다.Discussion이번 실험은 teratoma에서 분리한 세포로부터 구축한 embryonic carcinoma cell인 P19 cell line의 pluripotency를 이용하여 3배엽으로 만든 뒤에 Retinoic acid를 이용하여 P19 cell를 뉴런으로 분화를 유도하였다. 우선 P19 cell을 3배엽으로 만들기 위해서 multicellular aggregate인 embryoid body를 만들어야 한다. 이때 처음 fig5에서 cell의 confluency를 확인하고 EB를 형성시키기 위해 2 X 105 cell 만큼을 petri dish에 분주해야 하므로 hemocytometer을 이용하여 세포의 수를 구했고 2 X 105 cell 만큼을 넣기 위해 80㎕ 넣었다 [2 x 105 / (50 ÷ 4 x 20 x 104) x 103 ㎕/ml= 80㎕]. 그 결과가 fig6이며 이때 negative control과 retinoic acid를 구분하여 2개의 petri dish에 분주하였다. EB를 형성시키기 위해서 tissue culture dish가 아닌 bacteriological petri dish에 배양하였는데 있다.이렇게 추출한 RNA를 RT-PCR하기 전에 RNA의 농도와 순도를 확인하는데 이때 나온 값이 Fig11이다. Fig11은 spectrophotometer을 사용하여 추출한 RNA의 순도와 농도를 확인한 것으로 A260/A280의 값이 1.17, 그리고 A260/A230의 값이 0.68이 나온 것을 확인할 수 있다. 적정 범위로는 A260/A280의 값이 1.8 ~ 2.2 이며 A260/A230의 값이 2.0 ~ 2.2이다. A260/A280는 단백질 contamination을 확인하는 것으로 값이 낮게 나온 것을 보아 solution에 단백질이 많이 존재함을 알 수 있다. A260/A230는 버퍼, 지질 등의 contamination을 확인하는 것인데 이 또한 값이 낮게 나온 것을 보아 contamination이 많이 되어있는 것을 알 수 있다. 이러한 원인으로 수용액 층만 채취하는 과정에서 밑에 존재하는 층까지 채취했을 가능성이 있고, 실험 과정에서 정교하게 진행하지 못한 점 또한 존재한다. 이렇게 분리한 RNA는 DEPC-treated water을 이용하여 RNA 농도를 100ng/㎕로 맞추어야 하는데 그 공식은 dilution x (측정된 농도 ng/㎕ / 1 + 넣어야 할 DEPC) = 맞출 농도 ng/㎕이다. 측정된 농도는 14.2고 dilution은 20이었으므로 최종 계산이 DEPC 1.84㎕가 나왔다.RNA 농도를 100ng/㎕로 맞추고 housekeeping gene인 Gapdh와 ectoderm marker gene인 Pax6를 primer으로 하여 RT-PCR을 진행하였다. 이때 RT-PCR mixture가 Table1.이며 reverse transcription을 진행하기 위해선 cDNA로 합성할 template RNA와 extension을 진행할 polymerase, extension 할 때 필요한 dNTP, polymerase가 활성을 띄고 최적의 환경을 조성해 줄 polymerase buffer, 그리고 polymerase가1697

자연과학| 2019.10.28| 15페이지| 3,000원| 조회(169)

세포, P19 세포의 배양과 분화 유도, 분화 표지 유전자 발현 확인

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효소 평가A+최고예요

Abstract효소(enzyme)는 생명체 안에서 촉매역할을 하는 고분자(Macromolecule)의 단백질(protein)로 기질(Substrate)과 결합을 할 때 특이성을 갖는다. 그리고 효소는 단백질로 구성되어 있어서 환경적인 요소인 온도와 PH의 영향을 많이 받는다. 이번 실험에서는 기질인 ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)의 농도와 PH, 온도의 각 조건에 따른 효소인 β-galactosidase의 반응 속도를 측정하는 실험을 하였다. 생성물(Product)인 ONP가 420nm에서 최대의 흡광도를 갖는 것을 이용하여 ONP의 양을 측정해서 반응하는 속도를 구했고 이것을 토대로 하여 Michaelis-menten그래프와 Lineweaver-Burk그래프를 만들 수 있었다. 그래프와 추세선의 식을 통해 Km=277.67μM과 Vmax=5.11μM/min의 값을 구할 수 있었다. 같은 방법으로 최적의 온도와 최적의 pH도 구하였고 실험결과 ß-galactosidase의 최적온도는 36~37℃이며, 최적PH는 7.4인 것을 확인을 할 수 있었다.세 가지 반응 모두 Na2CO3를 넣어 반응을 종결 시켰는데 이것은 Na2CO3가 수용액 상에서 이온화가 되어서 시료 안의 pH가 12에 가깝게 되어 효소의 3차원 구조를 변형시켜 더 이상의 반응이 이루어지지 않게 되기 때문이다.Introduction화학반응이 일어나기 위해서는 반응이 일어날 수 있을 만큼의 에너지가 필요하다. 그리고 반응 분자들이 화학반응을 일으키기 위해 필요로 하는 최소의 에너지를 활성화 에너지(activation energy)라고 한다. 활성화 에너지는 대부분 반응 분자들이 주위로부터 받아들이는 열에너지(thermal energy)의 형태로 공급된다. 열에너지를 흡수하게 되면 반응분자들이 가속화되어 전보다 더 자주 충돌하게 되고 더욱 힘차게 반응분자들이 충돌하게 만든다. 그러나 이러한 방법은 생물에는 적합한 방법이지 되지 못한다. 그 이유로 첫번째는 고온 이상의 반응물이 포함되는 반응에서 활성 부위(active-site)는 효소와 기질 간에 일어나는 반응을 위해서 효소에 기질이 알맞은 배치로 합쳐질 수 있는 모형을 제공한다. 두번째로는 효소의 활성 부위(active-site)는 기질이 붙으면 그것을 붙듦으로써 기질 분자를 전이 상태(transition state)로 뻗도록 하여 반응을 하는 동안 절단되어야 하는 결정적인 화학 결합을 압박해서 모양을 휘게 한다. 네번째 방법으로는 화학 반응에서 활성 부위가 직접 참여하는 것 이다. 때때로 이런 과정은 효소와 기질의 특정 아미노산의 곁사슬(side chain) 사이에 형성이 되는 짧은 시간의 공유결합(covalent bond)을 포함한다. 반응의 다음 단계로는 곁사슬을 원래의 상태로 재생해서 활성 부위는 반응 전과 반응 후가 같게 된다.일정량의 효소가 기질을 생성물(product)로 전환시키는 속도는 부분적으로 기질의 최초 농도 함수이다. 즉 가용할 기질분자가 많으면 많을수록 기질은 효소의 활성 부위에 더욱 빈번하게 접근한다. 그러나 효소의 농도가 고정된 상태에서 더 많은 기질을 첨가하여 반응이 빠르게 일어나게 될 수 있을 지에는 제한이 있다. 어떠한 지점에서 기질 농도가 높아서 모든 효소들의 활성 부위가 사용 중에 있게 되면 이때의 기질 농도에 의하여 효소는 포화(saturated)되었다 라고 하며 효소의 활성 부위가 기질을 생성물(product)로 전환시킬 수 있는 속도에 의하여 반응 속도가 결정되게 된다. 만일 효소 집단이 포화(saturated)되었을 때 생성물(product)이 형성되는 속도를 증가시키는 방법으로는 효소를 더 많이 첨가해 주는 것이다. 세포는 때때로 더욱 많은 효소를 생성해서 반응 속도를 증가시키기도 한다.효소의 활성(얼만큼 효율적으로 효소가 기능을 하는지)은 환경적인 요소에 의하여 영향을 받기도 한다. 단백질(protein)의 3차원 구조는 환경에 굉장히 민감하기 때문에 효소는 어떤 조건에서 다른 조건보다 일을 더 잘하는데 이러한 조건을응계로 1934년에 Lineweaver.H와 Burk.D가 고안한 것으로 효소 반응에서의 반응속도가 기질의 농도와 어떠한 관계를 나타내는지를 보여준다.이 식은 Michaelis-menten의 식을 역수로 취하여 변형시킨 것으로 Vmax값을 보다 더 정확히 구할 수 있다.[Figure 3.Michaelis-menten graph] [Figure 4.Lineweaver-burk graph]이번 실험에서 ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)를 기질로 사용해서 당분해(glycolysis)를 촉매 시키는 β-galactosidase의 최적pH와 최적온도를 구하고 기질의 농도에 따른 반응속도를 측정할 것이다. ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)는 ONP와 galactose의 화합물로 두개의 물질이 β-1,4결합으로 연결되어 있고 β-galactosidase에 의하여 결합이 끊어지게 된다. β-galactosidase에 의해 생성된 ONP는 420nm에서 최대의 흡광도를 갖으므로 spectrophotometer를 사용하여 ONP의 양을 측정할 수 있다. β-galactosidase의 최적 온도는 37℃이고 최적의 pH는 7.4이다.[Figure 5.ONPG의 구조와 β-galactosidase 첨가반응]이번 실험에서 반응을 종결하기 위해 Na2CO3를 마지막에 첨가 하였는데, 시료에 Na2CO3를 넣으면 시료의 pH가 12에 근접하게 돼서 효소의 구조를 변형시켜 더 이상의 반응이 이루어지지 못하도록 한다.Method and Material[Table 1. 온도에 따른 반응속도 실험 조성표]1(4℃)2(RT: 20℃)3(37℃)4(60℃)5(80℃)2.5mM ONPG0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1M sodium phosphate buffer (PH 7.40.8ml0.8ml0.8ml0.8ml0.8mlβ-galactosidase0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1mlTotal 되면 96 well plate에 각 0.16ml씩 넣은 다음 420nm에서 흡광도를 측정한다.[Table 3. 기질의 농도에 따른 반응속도 실험 조성표]1(100μM)2(200μM)3(300μM)4(400μM)5(500μM)6(600μM)2.5Mm ONPG0.04ml0.08ml0.12ml0.16ml0.20ml0.24ml0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.4)0.86ml0.82ml0.78ml0.74ml0.70ml0.66mlβ-galactosidase0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1mlTotal volume1ml1ml1ml1ml1ml1ml[Table 3]에서 β-galactosidase를 제외한 나머지 용액들을 각 e-tube에 넣고 37℃의 water bath에서 5분동안 preincubation을 시키고 e-tube 1개당 6개의 e-tube를 준비하고 Na2CO3를 각 0.04ml씩 넣어둔다. 그 다음으로 preincubation을 한 e-tube에 β-galactosidase를 0.1ml씩 첨가를 하고 흔들어서 반응을 시작한다. 여기서도 마찬가지로 enzyme을 넣고 inverting하여 잘 섞어주는 것이 중요하다. 그리고 5분 간격으로 총 25분간 tube에서 용액을 0.16ml씩 따서 0.04ml의 Na2CO3가 담겨있는 e-tube로 옮겨서 섞은 다음에 반응을 종결 시킨다. 그리고 모든 sample의 반응이 끝나게 되면 96 well plate에 각 0.16ml씩 넣은 다음 420nm에서 흡광도를 측정한다.Result[Table 4. 각 온도의 흡광도]온도/min4℃20℃37℃60℃80℃00000050.0060.0290.0550.0140.009100.0090.0560.10.0130.008150.0100.0750.1380.0140.009200.0150.1020.1670.0130.015250.0190.1280.1930.0140.014[Figure 6. 4℃의 흡광도][Figure 7. 20℃의 흡광도][Fig용하여 생성물(product)인 ONP의 농도 변화 그래프를 만들어 해당하는 기울기(V0)를 구하고, V0와 변화조건 사이의 그래프로 나타냈다. 세 실험에서의 다른 점은 각 기질의 농도, 온도, pH를 다르게 해주어서 그것에 따른 반응 속도를 관찰한 점이다. 그리고 각각의 Ph와 온도에 따른 효소의 반응속도의 차이를 확인하고 최적온도와 최적pH의 유무를 반응속도 그래프를 활용해서 확인했다. 일정한 양의 효소가 존재할 때 기질의 농도에 의하여 반응속도가 점점 변하는 것을 Michaelis-Menten Equation과 Lineweaver-Burk plot을 이용해서 확인했다. 기질의 농도에 따른 Vmax는 5.11μM/min이 나왔고 Vmax의 1/2이 될 때 기질의 농도인 km값은 277.67μM을 도출했다.이번 실험을 진행 하면서 크게 차이나는 오류는 없었지만 각 그래프마다 차이가 난다면 효소와 기질의 정량을 제대로 주입하지 못한 것과 β-galactosidase를 마지막에 주입할 때 시간의 오차가 생겼다는 것 이다. 반응물의 농도를 확인할 때 흡광도 값 하나로 반응속도와 Lineweaver-Burk plot을 구하므로 보다 정교한 pipetting과 농도측정이 이번 실험에서 가장 중요한 요소로 생각된다. 또한 단백질을 정량 하는 방법이 Spectrophotometer를 이용하여 ONP의 흡광도를 측정하는 것 인데 흡광도를 측정하는 것은 일반적으로 사용하는 방법이지만 실제로는 ONP의 전체의 양이 아닌 Aromatic group만을 정량 하는 것 이므로 농도에서 오차가 생겼을 것이다. 그러므로 Bradford, Lowry assay등의 다른 반응을 사용하여 정량을 할 때 같이 사용해서 평균값을 사용했다면 계산하는 농도를 더욱 정확한 값을 구할 수 있고, 또 96 well plate를 다룰 때 투과성에 영향을 줄 수 있는 실험적 오차도 줄일 수 있었을 것이다. 그리고 Water bath에 Preincubation을 시켰던 Sample에 β-galactosida65

자연과학| 2019.10.28| 16페이지| 3,000원| 조회(632)

효소, 효소반응, 반응물

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