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PCR, restriction enzyme(A+보장, 출처가 확실한 양질의 다양한 자료, 검토를 거쳐 더욱 완벽해진 내용)

주차 보고서1. SubjectPCR, restriction enzyme2. Date3. PurposePCR의 개념을 이해하고, 실제로 실험을 진행할 수 있다.restriction enzyme의 개념을 이해하고 실험에 적용할 수 있다.4. Introduction1. PCR이란?1) 정의1958년 K.Mullis에 의해 고안된 PCR(중합효소 연쇄 반응, Polymerase Chain Reaction)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내에서 원하는 DNA 분자를2 ^{n}배로 증폭시키는 방법. 즉, 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시키는 것이 가능. 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계 작업이 가능함. 이론적으로는 무한정으로 증폭시킬 수 있지만 효소활성저하로 25~30회 정도 반복. PCR에서 파생한 여러 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당.그림1, 그림2. Polymerase Chain Reaction2) 목적PCR은 현재, 생물학에서 광범위하게 사용되는 기술. 근래 과학수사나 친자감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 또한 PCR을 활용한 것. 생물학에서는 여러 유전병을 판별할 목적으로 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용됨. 분류학에서도 종간의 DNA 비교를 위해 PCR을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는 매우 중요한 기술.① 유전병의 존재 여부 및 돌연변이 검사백혈병이나 림프종의 진단에도 PCR이 활용 됨. 유전체 샘플에 바로 이용가능 한 PCR 검사는 특정 악성 세포의 위치를 아주 정확히 측정 가능.그림3. 낭포성 섬유증 진단② DNA의 증폭과 정량화PCR은 타겟 분석이 어려움. EtBr 염색을 통해 분석하는 방법이 전통적인 PCR에서 사용되지만 이 역시 정확성이 떨어짐. PCR이 진행되는 초기 cycle에서는 2배로 증폭되는 expotential phage를 보이나 결국 PCR 반응 동안 효소의 활성의 감소, dNTP 및 Mg등의 양이 감소하며 plateaus(정체기)라 불리는 현상이 발생. 따라서 정확한 DNA의 양을 측정하고자 할 때에는 expotential phase에서 측정을 해야만 정확한 DNA의 양을 측정할 수 있으나 전통적인 방법으로는 이를 분석하기는 어려움. 이러한 분석 방법의 한계를 극복하기 위해 개발되어진 것이 Real-Time quantitative PCR(qPCR).DNA(또는 cDNA)에 결합하는 형광염료를 첨가 한 뒤 PCR을 시행. 이때 PCR thermal cycler와 형광광도계가 일체화된 장치를 통해 실시간으로 형광물질의 변화량을 측정할 수 있으며 형광값을 통해 증폭된 DNA의 양의 분석 가능. 또한 농도를 알고 있는 standard DNA sample과 비교하여 실험 샘플의 초기 핵산 양을 정량적으로 결정하는데 유용. 형광 reporter로는 dsDNA에 붙을 수 있는 분자들이나 혹은 PCR primer에 결합 할 수 있는 형광 dye등이 사용됨.증폭산물을 확인하기 위해 별도의 전기영동과정이 필요 없으며, 민감도가 매우 우수. 또한 검사과정의 자동화를 통해 빠른 시간 안에 결과보고가 가능. 최근 개발되는 대부분의 분자 미생물검사법은 real-time PCR 검사법을 사용하고 있으며, 대중 검출 기술 또한 지속적으로 개발되고 있음.③ 과정Ⅰ. 세포 내 total RNA 추출 후 역전사Ⅱ. PCR 증폭- 실험군 :cDNA, 형광용액, Taq 중합효소, MgCl2, dNTP, primer을 넣고 PCR로 증폭.- 대조군 : 표준곡선을 얻기 위해 농도를 단계별로 희석한 DNA와 형광용액을 포함하는 master 용액을 넣고 PCR 진행.Ⅲ. 그래프의 해석- 형광 검출이 가능할 정도로 DNA 산균 ribosomal RNA를 담체로 이용하는 것을 권장.A. 방법ⓐ Eppendorf tube에 침전한 미량의 세포에 세포 융해용액 D 100 ㎕를 첨가한 후 재빨리 vortex로 혼합.ⓑ Beckman TL-100용의 원심 tube에 5.7 M CsCl 100 ㎕를 주입.ⓒ 여기에 ①에서 얻은 세포 융해액을 조심스럽게 주입.ⓓ 80,000 rpm, 2시간 동안 원심분리.ⓔ Guanidinium/cesium chloride를 주의하여 흡인.ⓕ 침전을 0.1% DEPC 용액 100 ㎕으로 용해.ⓖ 2.5 M ammonium acetate 10 ㎕, ethanol 200 ㎕를 첨가하여 -20℃에서 1시간 동안 침전.ⓗ 10,000×g, 4℃, 15분간 원심분리.ⓘ 침전을 70% ethanol로 2번 세정.ⓙ 침전을 약 1 ㎍/㎕의 농도가 되도록 적정량의 0.1% DEPC 용액으로 용해.나. Poly(A) + RNA의 정제Poly(A)+ RNA는 Oligo(dT) Cellulose 등을 사용하여 Total RNA로부터 분리하는 방법이 일반적. OligotexTM-dT30은 라텍스입자에 Oligo(dT) 30의 5′말단을 공유 결합하여 고정한 시약으로, Poly(A)+ RNA와 고효율로 결합하여 원심분리 조작으로 입자를 회수하여 신속하게 고순도의 Poly(A) + RNA를 회수 가능.Ⅱ. RNA의 순도와 농도 검정대부분의 경우 실험결과는 사용하는 RNA의 순도에 의해 크게 좌우되므로 사용전에 반드시 RNA의 순도를 검정해야 함.가. 전기영동에 의한 Total RNA의 순도검정Total RNA 1~2 ㎍를 열변성 (65℃, 10분)하여 1% agarose gel (TBE buffer)에 전기영동. 분해가 되지 않은 total RNA는 2개의 ribosomal RNA (진핵세포 : 28S와 18S, 원핵세포 : 23S와 16S)의 선명 band가 약 2:1의 비율로 보이며 ribosomal RNA의 band가 퍼져있는 경우에는 RNase의 혼입으로 RNA가 분해되었을 HCl(pH8.3), 100mM MgCl2, 50 mM Dithiothreitol· 10X Taq polymerase buffer : 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl(pH8.3), 15 mM MgCl2, 0.1%(w/v) gelatin· [γ-32P] ATP(7,000 Ci/nmol, 160 mCi/ml, ICN Biochemi-cals)· [α-32P] dCTP(3,000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, Amersham)· dNTP Mixture(각 1.25 mM)· 합성 oligonucleotide나. 방사성 동위원소(RI)를 이용한 PCR법mRNA를 고감도로 검출할 필요가 있는 경우, 특히 염기서열의 이상을 검출하기 위해 SSCP 해석을 하고자 하는 경우는 primer를 방사선표식하여 PCR에 이용. 이 경우는 32P를 기질로 하여 T4 polynucleotide kinase로 primer의 5’말단을 표식. RT-PCR 산물을 SSCP로 해석하는 경우에는 양측의 primer를 표식하는 것이 mRNA 구조의 이상을 검출하기 위해 반드시 필요하지만 양 primer를 동등한 강도로 방사성표식을 하기 위해서는 좌우 primer 각각에 대하여 별개의 kinase 반응을 해 줄 필요가 있음. 특히 표식한 primer는 정제할 필요가 없고, T4 polynucleotide kinase 반응액의 일부를 직접 PCR 반응액에 첨가. 단 kinase 반응액의 성분이 PCR을 저해하지 않도록 kinase 반응은 PCR의 최적 pH인 8.3에서 수행하고, 반응 후 가능한한 소량의 dH2O로 희석. SSCP 해석에서 명료한 signal을 얻기 위해서는 최소량의 PCR 산물을 비변성 polyacrylamide gel로 분리하는 것이 가장 바람직. 이를 위해 PCR에 이용하는 primer가 높은 방사활성을 갖도록 표식해야 함.③ 장점 : RNA는 쉽게 분해되므로 실험 시 불편이 많았으나 RNA보다 안정한 cDNA를 합성하여 증폭하므로 실험의 안정성을 높임. coli에서 유래하였고, BamHI은 Bacillus amyloliquefaciens에서 유래. EcoRI에서 E는 속(genus)명에서 유래하였고, co는 종(species)명에서 유래. R은 RY13 균주에서 유래한 것이고, I은 이 박테리아에서 가장 먼저 추출한 제한효소를 의미.6. 효소에서 Unit이라는 단위의 의미1) 효소 활성 단위 Unit, Katal효소 활성은 국제단위(International unit; IU)로 표현하는데, 이는 특정 조건에서 1분(min)동안 1μmol의 기질을 생성물로 전환시키는 효소의 양으로 1unit(U)라 함. 효소의 활성을 나타내는 또 다른 단위는 Katal(Kat). 1 Katal은 1초(s)에 1mol의 기질을 생성물로 전환시키는 효소의 양. 예를 들어. 1 Katal의 트립신은 특정 조건에서 초당 1mol의 펩티드 결합을 파괴하는 트립신의 양을 의미. 1Katal은 6×10 ^{7}IU와 동일.{1mol} over {1s} (=1katal) TIMES {1 TIMES 10 ^{6} mu mol} over {1mol} TIMES {60s} over {1min}##=`6 TIMES 10 ^{7} mu mol`/`min##=`6 TIMES 10 ^{7} `IU* 효소의 활성은 기질농도, pH, 이온강도, 온도 등에 영향을 받기 때문에 반드시 반응조건이 명시되어야 함.효소의 실제 농도를 알고 있는 경우에도 농도(M)을 사용할 수 있음. 그러나 대부분의 경우 효소의 실제 농도를 알 수 없으므로 효소의 양은 그 활성으로 표시됨. 따라서 효소량은 unit/ml(or katal/ml)로 나타내고, 비활성은 unit/mg(or katal/mg)으로 표시.5. Material & Method1. PCR (Plasmid DNA & Genomic DNA)[1] Material1) buffers (PCR mixture kit)[2] Methods1) mixture 준비1. 하나의 e tube에 sample 개수만큼 아래 조성을 각각 .

자연과학| 2021.03.14| 25페이지| 4,500원| 조회(297)

PCR, 생화학 실험, 분자생물학 실험, restriction enzym

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pH 및 완충 용액-시약 만들기(A+보장, 출처가 확실한 양질의 다양한 자료, 검토를 거쳐 더욱 완벽해진 내용) 평가A좋아요

주차 보고서1. SubjectpH 및 완충 용액 / 시약 만들기2. Date3. PurposePipette, pH의 개념을 이해할 수 있다.pH meter, 완충 용액의 개념 및 원리에 대해 이해하고, 실험에 사용할 수 있다.4. Introduction1. Pipette 이란?실험 기구로써 작은 양의 액체를 옮기는 데에 사용됨. 대개 화학, 생물, 물리 등과 같이 자연과학 실험에 흔히 사용되는 실험 기구 중 하나. 액체나 기체의 부피를 정밀하게 측정하는데에 사용. 눈금 피펫(graduated pipette)과 홀 피펫(hole pipette), 마이크로 피펫(micropipette) 등이 있음. 정밀한 양을 옮기기 위해 사용되는 실험 기구. 사용 목적에 따라 유리로 된 간단한 피펫에서부터 부피 양이 미세하게 조절될 수 있는 복잡한 피펫까지 다양한 형태의 피펫들이 판매되고 있음. 피펫의 종류에 따라 부피의 정확도 정도도 다름.1) 사용법피펫을 잡을 때, 엄지 손가락은 push button에 올리고, 검지 손가락으로 pipette을 받치며, 네 손가락은 pipette body를 감싸야 함.① 필요한 volume에 맞는 피펫을 선택한 후 페펫의 volume adjustment knob를 돌려 원하는 양으로 조절.② tip holder에 멸균된 피펫 팁을 꽂기.③ 1st stop까지 피펫의 push button을 천천히 누른 상태로 채취할 시료 용액에 피펫팁을 담근 후, 원 위치까지 push button을 천천히 누르기.④ 용액을 옮길 용기에 피펫을 살짝 기울여 1st stop까지 피펫의 push button을 눌러 용액을 분배.⑤ 팁에 납아 있는 용액을 2nd stop까지 push button을 눌러 남아있는 시료를 빼낸 후 피펫의 위쪽에 있는 tip ejector button을 눌러 피펫 팁을 분리.2) 주의사항피펫을 거꾸로 들어 오염되지 않도록 주의. 피펫의 정확도와 정밀도를 주기적으로 측정해야함. 피펫을 기울이면 정확한 양의 시료가 흡입되지 않기 때문에 항상 과가 있음. 피스톤이 시료와 직접 접촉하여 흡인력이 일정하게 유지됨.③ Volumetric pipettes그림 5. Volumetric pipettesVolumetric pipettes 또는 bulb pipette이라 명명. 용액 부피를 매우 정밀하게 측정하는데 사용. 길고 좁은 관 윗부분에 큰 전구모양의 공간이 있는 형태. 전구모양의 공간에 (마치 부피 플라스크처럼) 특정 부피를 표시하는 눈금이 있음. 대체로 10, 25 및 50 mL의 단위를 가지는 종류를 사용. 보통 적정을 위한 용액을 준비하는 데 사용됨.④ Graduated pipettes그림 6. Graduated pipettes눈금 이 매겨진 피펫. 실린더 또는 뷰렛처럼 부피를 나타내는 눈금이 있는 긴 튜브로 구성됨. 과거에는 액체를 흡입하기 위해 입으로 직접 관을 빨기도 했음. 그러나 KCN, NH3, 강산, 염기 및 수 은염을 경구로 흡입하는 것은 매우 위험한 행위. 때문에 근래에는 경구흡입 대신에 휠을 돌려 수동으로 조정하는 형태의 피펫이나 버튼을 눌러 자동으로 조정하는 형태의 피펫을 사용.⑤ Pasteur pipette그림 7. Pasteur pipetteteat pipettes나 droppers, eye droppers 또는 chemical droppers라 명명. 소량의 액체를 옮기는 데 사용되는 피펫. 플라스틱 또는 유리재질의 관으로 구성되어 있으며 피펫이지만 특정 부피에 대해 눈금이 표시되어 있지는 않음. 뒤의 고무는 피펫 본체와 분리가능.⑥ Transfer pipettes그림 8. Transfer pipettesBeral pipettes라고도 함. Pasteur pipette과 유사하지만, 단일의 플라스틱 몸통으로 만들어져 있으며 끝부분의 전구모양 관은 액체를 모아둘 수 있는 공간으로 활용.2)특수 피펫① Pipetting syringe그림 9. Pipetting syringevolumetric (bulb) pipettes, graduated pipettes, 및 burettes의 ＝[H ^{+} ][OH ^{-} ]＝10 ^{-14} ` THEREFORE pH＋pOH＝14) 이므로, 이때의pH=log {1} over {[H ^{+} ]} =-log[H ^{+} ]=7이 됨. 수소 이온 농도가 10^－7그램 이온보다 클 때([H＋]＞[OH－]), 즉 pH가 7보다 작을 때 그 용액은 산성, 그 반대일 때가 알칼리성, 7이면 중성. 수소 이온 농도는 용액의 산성 강도를 나타내고, 분석 화학, 콜로이드 화학, 생화학, 기타 화학의 각 분야와 그 응용면에서 중요한 양임.3. pH meter의 원리 및 사용법그림 12. pH meter실험에서 용액의 산도 또는 알칼리도를 측정하는데 사용되는 장비. pH meter로 용액의 pH 값을 알아내는 원리는 pH 측정전극과 기준전극 사이에 발생하는 전위차를 이용하는 데에 있음. pH meter는 pH 측정전극, 기준전극, 고 입력 임피던스 미터 이렇게 세부분으로 구성. pH 측정전극은 측정되는 용액의 pH에 따라 변화되는 전극을 말하며, pH 측정전극은 hydrogen ion sensitive glass bulb 내외의 수소이온 농도 변화에 따라 변화되는 mV 출력을 가짐. 기준전극은 수소이온 농도에 따라 출력이 변화 되지 않고 항상 일정한 전위를 가짐. pH 측정전극은 높은 내부저항을 가지므로 작은 전위변화도 감지할 수 있음. pH meter의 내부저항은 매우 중요한 변수이며, 전극의 내부저항보다 1000배 더 높아야 함. 고 임피던스 증폭기는 정확하게 측정한 결과를 아날로그 또는 디지털 디스플레이에 pH 단위로 직접 표시하는 것.1) 사용법① 기기가 충분히 warm up 될 수 있도록 미리 전원을 켜두기.② 보존 용액에 들어있는 electrode를 꺼내 SDW로 헹군 후, KIMTECH로조심스럽게 수분을 흡수. (electrode는 민감하므로 물기만 닦는다는 느낌으로)③ calibration buffer를 이용해 pH를 제대로 인식할 수 있도록 보정.→ pH 4, 7, 10 을 제대로 인식하는 지 c온의 농도가 변하면 그 변화를 줄이도록 평형이 이동하는 현상을 공통 이온 효과라고 함. 약산에 그의 짝염기가 충분한 양으로 포함된 완충 용액에 산이나 염기가 첨가되어도 공통 이온 효과에 따라 그 변화를 줄어들게 함으로써 완충 효과가 나타남.5. Material & Method1. plasmid DNA prep stock1) 1M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml 제조① 미세 저울과 약포지 및 약숟가락을 준비② 위의 준비물들을 이용하여 6.057 g의 Tris powder를 50ml 비커에 옮겨 담기③ Tris powder가 담긴 비커에 30ml 정도의 SDW를 넣어 혼합④ 용액에 stirring bar를 넣고 stirrer를 작동시켜 침전물이 남지 않도록 용해? pH meter를 calibration buffer를 사용하여 보정⑥ pH meter를 이용하여 용액의 pH를 측정, HCl 및 NaOH를 첨가하여 pH를 8.0으로 조절(완충용액의 특성을 고려하여 HCl 및 NaOH를 첨가 시 Pipetting 양 조절 주의)⑦ pH가 8.0으로 조절되면 비커에 담긴 용액을 메스실린더에 옮겨 담고, 50 ml까지 SDW를 더하여 mass up⑧ 제조가 완료된 용액은 conicla tube에 옮겨 담은 후 labeling2) 100 mM EDTA (pH 8.0) 50ml 제조① EDTA 1.86124g을 미세 저울과 약포지, 약숟가락을 통해 정량② 정량한 EDTA 1.86124g과 SDW 30ml 정도를 함께 비커에 넣음③ 비커에 magnetic bar를 넣고 magnetic stirrer를 작동시켜 EDTA를 모두 용해시킴④ pH meter를 이용해 pH를 측정하고 마이크로 피펫을 이용하여 HCl 및 NaOH를 넣어 pH를 8.0으로 맞춤⑤ 용액을 메스실린더에 옮겨 담고 SDW를 넣어 50ml 까지 mass up⑥ 용액을 cornical tube에 옮겨 담고 labeling3) 3M NaOAc 50㎖ 제조① 정밀저울에 약포를 올리고 영점 조절② NaOAc 분섞고 SDW 30ml 정도를 함께 비커에 넣음③ 비커에 magnetic bar를 넣고 magnetic stirrer를 작동시켜 시료들을 모두 용해시킴④ 용액을 메스실린더에 옮겨 담고 SDW를 50ml까지 mass up⑤ 용액을 cornical tube에 옮겨 담고 labeling4) Sol. Ⅲ (neutrilization buffer) (4 °C) 50ml 제조① 5M KoAc를 미세 저울과 약포지, 약숟가락을 통해 24.535g 정량② 정량한 5M KoAc 24.535g과 11.5% Acetic acid 5.75ml를 섞고 SDW 30ml 정도를 함께 비커에 넣음③ 비커에 magnetic bar를 넣고 magnetic stirrer를 작동시켜 시료들을 모두 용해시킴④ 용액을 메스실린더에 옮겨 담고 SDW를 50ml까지 mass up⑤ 용액을 cornical tube에 옮겨 담고 labeling5) 70% EtOH 10㎖ 제조① Conical tube에 EtOH 7㎖를 정량② SDW로 10㎖까지 mass up3. SDS-PAGE stock1) 2M Tris-HCl (pH 8.8) 100ml 제조① 미세 저울과 약포지 및 약숟가락을 이용해 Tris 24.228g 준비② 비커에 준비한 Tris 24.228g와 SDW 65ml를 넣음③ Tris와 SDW를 넣은 비커에 magnetic bar를 넣고 stirrer를 작동시켜 침전물을 용해④ pH meter를 이용하여 용액의 pH를 측정 후, HCl을 첨가해가며 pH 8.8까지 낮춰줌⑤ pH 조정이 끝난 용액을 메스실린더에 옮김. SDW를 첨가해가며 100ml까지 mass up⑥ mass up이 끝난 용액을 conical tube에 옮겨 담고 labeling하여 보관2) 1M Tris-HCl (pH 6.8) 100ml 제조① 미세 저울과 약포지 및 약숟가락을 이용해 1M Tris 12.114g 얻음② 비커에 1M Tris 12.114g와 SDW 60ml를 넣음③ Tris와 SDW를 넣은 비커에 magnetic bar를보관

자연과학| 2021.03.14| 13페이지| 2,500원| 조회(267)

pH, 생화학 실험, 완충 용액, 시약 만들기, 분자 생물학 실험, pH 및 완충..

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기기 사용법 및 농도 계산법 (A+보장, 출처가 확실한 양질의 다양한 자료, 검토를 거쳐 더욱 완벽해진 내용)

주차 보고서1. Subject기기 사용법 및 농도 계산법2. Date3. Purpose농도, 멸균 등의 개념을 이해하고, 농도를 실제로 계산할 수 있다.실험에 사용하는 기기에 대해 이해하고, 실험에 사용할 수 있다.4. Introduction1. 농도1) 퍼센트 농도(Percentage concentration)퍼센트`농도= {용질의`질량(g)} over {용액의`질량(g)} TIMES 100(%)① 정의 : 단위 질량당 용액에 녹아 있는 용질의 질량을 백분율로 나타낸 척도.2) 몰 농도(Molarity concentration)몰농도(M)= {용질의`몰수(mol)} over {용액의`부피(L)}① 정의 : 용액 1L에 녹아있는 용질의 몰수.*몰수 : 몰(mole, 기호: mol)은 물질의 입자의 수를 나타내는 국제단위계의 기본 단위.1mol=6.02214076 TIMES 10 ^{23}3) 몰랄 농도(molality)몰랄농도(m)= {용질의`몰수(mol)} over {용매의`질량(kg)}= {용질의`부피(V)} over {용액의`부피(V)} TIMES 100(%)① 정의 : 용질의 몰수에 기초한 농도 단위. 용매 1kg에 들어 있는 용질의 몰수.4) 노르말 농도(Normal concentration)① 정의 : 용액 1ℓ 속에 녹아 있는 용질의 g당량수를 나타낸 농도Ⅰ. 당량 : 산화·환원반응에서 1mol의 전자, 수소이온, 또는 수산화이온과 반응하거나 또는 그것을 내어 놓을 수 있는 물질의 양.Ⅱ. 당량수 : 한 분자가 용매에 녹아 이온화 되는 양이온(or 음이온)의 수Ⅲ. g당량수 : 분자량(g/mol)/당량수(eq/mol) (1분자 중의 수소이온 또는 수산화이온 수)2. 멸균1) 멸균(pasteurization)① 정의 : 물체의 표면이나 내부의 모든 미생물(포자 포함)을 제거하여 무균 상태로 만드 는 것(유익함과 해로움을 불문하고 모든 미생물을 사멸시키는 것).② 방법 : 습열, 건열, 방사선, 여과 등.Ⅰ. 습열(Moist heat steriliza비. Centrifuge는 현탁액, 비 혼합성 액체, 혈액 등을 분리를 분리하는데 사용. Ultracentrifuge는 혈장으로부터 다양한 지단백질 일부를 분리하거나 미세 입자 분획을 펠릿화 하는데 사용.② 특징 : 원심기 본체는 주로 로터의 회전속도에 따라 분류. 속도가 증가함에 따라 수동원심기, 저속원심기, 고속원심기, 초원심기 등으로 명명. 또, 저속(또는 고속)원심기 등이 냉각기능을 갖추었을 때는 저속(또는 고속)냉각원심기라 칭함. Centrifuge는 용액이 담긴 튜브를 로터에 넣고 정해진 속도로 회전시킴. 원심력이 용액 속 각 입자에 적용되고 가속되는 과정에서 밀도가 높은 물질은 바깥쪽으로 이동하며 침전되고, 반대로 밀도가 낮은 물질은 중심으로 이동하고 상단에 위치하게 됨. Centrifuge의 원리인 원심력은 원운동 시 물체에서 나타나는 것처럼 보이는 관성력으로 중심축에서 멀어지고 회전축과 평행하는 방향으로 작용.③ 사용법 : Ultra Centrifuge을 기준으로 작성함.Ⅰ. 로터를 삽입.Ⅱ. 로터 ID 버튼을 누르기.Ⅲ. 속도 설정을 위해 RPM 버튼 혹은 RCF 버튼을 누르기.Ⅳ. 키패드를 이용해 원하는 속도값을 입력.(최대 속도는 삽입된 로터에 따라 다름. 로터별 최대 속도값을 확인.)Ⅴ. Enter 버튼을 눌러 값을 확정.Ⅵ. 시간 설정을 위해 Time 버튼을 누르기.Ⅶ. 키패드를 이용해 원하는 시간값을 입력.Ⅷ. Enter 버튼을 눌러 값을 확정.Ⅸ. 온도 설정을 위해 Temp 버튼을 누르기.Ⅹ. 키패드를 이용해 원하는 온도값을 입력.ⅩⅠ. Enter 버튼을 눌러 값을 확정.ⅩⅡ. 온도 제한 범위 설정을 위해 Temp Limit 버튼을 누르기.ⅩⅢ. 키패드를 이용해 원하는 온도범위을 입력.ⅩⅣ. Enter 버튼을 눌러 값을 확정.ⅩⅤ. 가속/감속 단계 설정을 위해 가속 버튼 혹은 감속 버튼을 누르기.ⅩⅥ. 키패드를 이용해 원하는 가속 혹은 감속값을 입력.ⅩⅦ. Enter 버튼을 눌러 값을 확정.ⅩⅧ. 설정 값 입력을 마친 후, Star가 사용자에게 닿을 수 있어, 비교적 병원체 작업에 안전하지 않음. 따라서 유해한 박테리아 와 바이러스를 제거, 사용자 또한 병원체로부터 보호하는 목적으로 Biosafety cabinet를 사용할 수 있음.③ 사용법 : Ⅰ. Manometer 수평조정.- Manometer 수평 계의 물방울이 가운데 위치하도록 수평을 조정. 이후 수평계 좌측에위치한 수평 조정 볼트 조정하거나 크린벤치의 수평을 조정하여 수평을 맞추기.Ⅱ. 영점 조절 바를 이용, 오일의 영점을 맞추기.Ⅲ. 오일이 평시 사용하는 지시치 보다 높을 시에는 HEPA 필터를 교체.Ⅳ. Main S/W를 On하여 전원 키기.Ⅴ. 작업대에서 작업을 할 경우 FL 버튼을 눌러 FL 램프를 On.Ⅵ. 시료의 살균 작업을 할 경우 UV 버튼을 눌러 UV 램프를 On.Ⅶ. 청정공기 유입을 위할 시에는 FAN 버튼을 눌러 모터를 On.Ⅷ. Fan Selector S/W를 이용하여 공기 유입량을 조절. (저속 or 고속)Ⅸ. 가스밸브에 분젠 버너를 연결하여 사용. (소독용)Ⅹ. 실험을 종료 시에 는 각각의 버튼을 눌러 Off를 한 후 최종적으로 Main 버튼을 Off.④ 주의사항 : Ⅰ. 절대적으로 UV 등을 On한 상태에서는 무균 작업대에서 작업하지 않기.(눈 또는 노출된 부위에 화상을 입을 수 있음.)Ⅱ. 작업대에서 장시간을 자리를 비우기 전에 UV등을 Off를 해야 하는지를 확인, 필요시 반드시 Off를 해야 함.Ⅲ. UV 등이 켜진 상태에서 직접적으로 보지 말기. 눈에 손상이 올 수 있음.6) Fume hood그림 7. Fume hood① 목적 : 유해한 독성, 인화성 가스/입자/증기로부터 효과적인 제어를 통하여 연구원의 안전을 확보하기 위하여 사용됨.② 특징 : 안전 유리로 된 전면도어를 제외하고 밀폐된 구조의 국부적인 환기장치. Fume Hood 내부는 항상 부압을 유지하여 Hood 내부의 유해가스가 실험실 내부로 역류되지 않도록 설계됨. 연구원의 안전을 위하여 전면도어의 개방시에도 항상 일정한 속도의 배기하고 암을 내리거나, 샘플 큐벳을 큐벳홀더에 삽입.Ⅶ. 샘플 측정을 시작.-페디스털 : 자동 측정이 켜진 경우에는 암을 내리고, 자동 측정이 꺼진 경우에는 암을 내리고 측정 버튼을 누르기.-큐벳 : 측정 버튼을 누르기.샘플 측정이 완료되면 스펙트럼과 보고된 값이 표시됨.Ⅷ. 샘플 축정을 마쳤으면 실험 종료.Ⅸ. 암을 올리고 새 실험용 천으로 두 페디스털을 청소하거나, 샘플 큐벳을 분리.④ 주의사항 : Ⅰ. 페디스털에 불산(HF)을 사용하지 말 것. 플루오르화 이온은 석영 광섬유 케이블을 영구적으로 손상시킴.Ⅱ. 세정제 또는 이소프로필 알코올을 포함한 용액이 페디스털 상태를 변질시킬 수 있음. 샘플 분석에 이러한 용액이 필요한 경우, 즉시 3-5 μL DI H2O를 사용.Ⅲ. 인체와 동물의 조직, 체액, 감염원, 혈액 등의 생물학적 샘플은 전염병을 옮길 수 있음. 적절한 보호 장구를 착용 해야 함. 감염성이 있는 물질을 취급할 때 해당 조직의 생물학적 안전 프로그램 프로토콜을 따를 것.9) Gel document그림 10. Gel document① 목적 : DNA, RNA를 전기영동 후 data 확인 및 분석에 사용.② 특징 : 분자 생물학 실험에서 널리 사용되는 장치. 폴리 아크릴 아마이드 또는 아가로즈 겔 내에 현탁 된 핵산 및 단백질의 이미지화 및 문서화에 사용. 실험 시 겔은 일반적으로 ethidium bromide 또는 GelGreen 등을 이용하여 염색. 대체로 UV light transilluminator(gel에 UV를 투과하여 가시광선 방출 유도), hood 또는 암실(외부 광원을 차단함과 동시에 기기에서 발생되는 UV로부터 사용자를 보호하기 위해 사용.),CMOS 카메라(이미지 캡쳐 용)가 포함 됨.③ 사용법 : Ⅰ. 장비 하단 뚜껑을 열고 tray에 gel 상태의 sample을 올리기.Ⅱ. PUSH Button을 누른 후 기기가 결과 분석을 하는 동안 대기.Ⅲ. 연결 된 PC에서 이미지 처리 소프트웨어를 통해 결과를 확인.Ⅳ. 결과를 수치나 말 것. 고속으로 팬이 동작하고 있으므로 화상이나 부상의 원인이 됨.Ⅴ. 장시간 사용하지 않을 때는 곰팡이가 피거나 냄새가 고이지 않도록 냉동고 안을 청소 한 후 2 ~ 3일간 문을 열어 건조.12) Microplate reader그림 13. Microplate reader① 목적 : 방출 된 빛을 측정하여 화학적, 생물학적 또는 물리적 반응을 감지하는 데 사용. 일상적인 실험실 프로세스 및 효율성을 개선.② 특징 : 단백질 및 핵산 정량, ELISA, luciferase assay 뿐만 아니라, cell based assay 등 다양한 실험을 수행하는데 사용. 제약, 생명공학의 연구 분야에서 연구, 약물 개발, 그리고 품질과 제조 공정 등에서 넓게 이용.* Microplate : Microplate는 작은 테스트 튜브로 사용되는 여러 "wells"이 있는 평판. 인간과 동물을 대상으로 한 가장 현대적인 의료 진단 테스트의 기초인 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)에서 매우 일반적으로 사용 됨. 대체로 2 : 3 직사각형 매트릭스에 6, 12, 24, 48, 96, 384 또는 1536 개의 샘플 wells이 배열되어 있음. 각 wells은 일반적으로 수십 나노 리터에서 수 밀리리터의 용량.③ 사용법 : Ⅰ. 전원을 켠 후 연결된 PC와의 연동 확인.Ⅱ. 장비 중심부에 위치한 tray에 Microplate sample을 올리기.Ⅲ. 버튼을 누른 후 기기가 결과 분석을 하는 동안 대기.Ⅳ. 연결 된 PC에서 이미지 처리 소프트웨어를 통해 결과를 확인.Ⅴ. 결과를 수치나 그래프 또는 PDF 파일 등으로 분석 및 확인.④ 주의사항 : Ⅰ. Microplate sample을 기기에 올릴 때 wells에 담긴 시료들이 섞이지 않게 주의.Ⅱ. 만일 wells에 담긴 시료들을 흘렸을 경우 즉시 기기 내부를 닦아내기.Ⅲ. Microplate sample을 옮기는 동안 이물질이 들어가지 않도록 주의.5. Material & Method-

자연과학| 2021.03.14| 20페이지| 4,000원| 조회(229)

생화학 실험, 분자생물학 실험, 농도 계산법, 기기 사용법, 기기 사용법 및 농..

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plasmid DNA prep 및 genomic DNA prep(A+보장, 출처가 확실한 양질의 다양한 자료, 검토를 거쳐 더욱 완벽해진 내용)

주차 보고서1. Subjectplasmid DNA prep 및 genomic DNA prep2. Date3. Purposeplasmid DNA prep와 genomic DNA prep의 원리를 이해하고 실험을 수행할 수 있다.4. Introduction1. plasmid DNA / genomic DNA란?그림 1. Plasmid DNA / Genomic DNA1) Plasmid DNA① 정의 및 특징1952년 미국의 유전학자 J. 레더버그가 최초로 플라스미드를 세균의 염색체 이외의 독자적으로 증식할 수 있는 DNA 분자라는 의미로 명명. 플라스미드(plasmid)는 생장에 필수적인 염색체(chromosom) DNA에서 물리적으로 분리되어 있는 대표적인 에피솜(episome) DNA 분자.플라스미드는 대개 박테리아의 내부에서 박테리아 염색체와 독립적으로 존재. 그러나 일부 플라스미드는 박테리아 염색체에 삽입되는 경우가 있으며, 이처럼 박테리아 염색체에 삽입할 수 있는 능력을 가진 플라스미드를 "에피솜(episome)"이라 정의. 박테리아 염색체에 삽입된 에피솜은 독립적으로 복제할 수 없어 박테리아 DNA가 복제할 때 에피솜도 같이 복제. 때에 따라 삽입된 에피솜은 박테리아 염색체에서 빠져나와 다시 독립된 플라스미드로 존재할 수 있음.박테리아 염색체는 평균 수 백만 kb인 반면, 플라스미드는 대개 1 kb에서 200 kb 이내이며, 대부분 환형이지만 선형 플라스미드도 관찰 됨. 세포에서 분리한 플라스미드는 가장 압축된 상태인 초나선형(supercoil)으로 존재. 플라스미드는 자신의 복제기점을 소유하여 염색체와는 독립적으로 복제되어 증식 가능. 하지만 복제과정에 필요한 효소들은 숙주 염색체에 의존. 플라스미드가 세포내에 존재하는 숫자가 다른데, 이것을 복제수 (copy number)라 함. 이러한 복제수는 플라스미드 상에 있는 유전자와 숙주와 플라스미드 사이의 상호작용에 의해 결정. 일부 진핵생물에서도 존재하지만 주로 세균에서 많이 발견되며 바이러스와는 달리 세포는 고분자화합물결합을 끊는 lysozyme과 세포벽을 온전하게 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하는 EDTA를 이용하여 세포벽을 파괴. 삼투압유지하게 하는 Glucose를 이용하여 세포가 모양을 유지. 세포가 완전히 깨지지 않고 변성이 크게 일어난 chromosomal DNA는 Potassium, SDS, 세포벽 깨진 것들과 엉켜서 Centrifuge로 침전되고 plasmid DNA만 따로 추출 가능.3. genomic DNA prep 원리그림 7. Genomic DNA prep1) 세포 용출액에서 단백질과 RNA를 제거하여 DNA 정제① 세포 용해Ⅰ. 세균 : EDTA 또는 리소자임을 이용하여 세포벽을 분해시키고, SDS와 단백질 분해효소 K(proteinase K)로 세포막을 파괴하고 단백질을 분해.Ⅱ. 동물세포 : SDS와 단백질 분해효소 K를 이용해 세포를 파괴.Ⅲ. 식물세포 : 액체질소를 이용하여 세포를 얼린 다음 막자사발에서 조직을 분쇄(식물은 셀룰로오스의 세포벽으로 둘러싸여 있고, 탄수화물(광합성에 기인) 및 2차 대사산물. 핵산분해효소를 포함하고 있어 순수한 DNA 분리가 까다로운 편).EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽을 파괴. 즉, EDTA는 2가 양이온(Mg ^{2+},Ca ^{2+} 등)을 잡아주는 역할을 하는 chilating agent. 일반적으로 미생물의 exopolysaccharide 사이를 안정화 시키는Mg ^{2+}와 결합하여, cell wall을 약화시킴.세포막은 친수성과 소수성의 인지질 이중층을 형성. SDS는 ionic detergent로 친수성과 소수성의 특징을 가진 인지질층과 같이 SDS도 인지질과 같은 구조를 지님. SDS의 친수성 부분이 세포막이나 핵막의 친수성 부분에 결합하여 cell을 lysis시키고 protein을 unfolding시킴. 즉 세포막을 깨는 일을 수행. 막단백질은 펌프(pump 또는 gate), 수용체, 에너지 변환체, EDTA를 사용.2) Sol.Ⅰ : cell이 급격하게 깨지는 것을 방지하기위해 넣어줌.① Glucose : 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시킴. 실험 중 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분이 불가. 따라서 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨야하며 이를 가능하게 하는 것이 Glucose의 역할.② Tris (pH 8.0) : pH의 급격한 변화를 맞기 위한 buffer의 역할.③ EDTA (pH 8.0) : EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽을 파괴 함. 즉, EDTA는 2가 양이온(Mg ^{2+},Ca ^{2+}등)을 잡아주는 역할을 하는 chilating agent. 일반적으로 미생물의 exopolysaccharide 사이를 안정화 시키는Mg ^{2+}와 결합하여, cell wall을 약하게 만드는 역할.3) Sol.Ⅱ : cell을 깨줌과 동시에, protein이나 size가 큰 genomic DAN등을 denature.① NaOH : pH를 12 ~ 12.5로 조절, genomic DNA와 protein, plasmid DNA 등을 denature.② SDS : ionic detergent로 cell을 lysis시키고 protein을 unfolding시킨다. 즉 세포막을 깨는 역할.4) Sol.Ⅲ : denature되었던 plasmid DNA를 다시 renature.① KoAc : potassium에 의해, soluble한 form의 SDS가 insoluble한 potassium dodecyl sulfate가 되면서, genomic DNA와 protein등과 함께 insoluble한 complex를 형성.② Acetic acid : KoAc와 acetic acid를 넣어주게 되면, 높은 농도의 salt와 acetic acid등에 의해 pH가 낮아지며, protein과 genomic DN Cell (예비실험 ? 조교가 진행) - plasmid DNA prep과 동일.[2] Method※ Heat block 56 ℃ 설정1) cell-down (centrifuge 5 min, 8000 rpm)2) supernatant (= sup, 상층액) 제거3) Buffer CL 400 μl을 넣고 resuspension4) e tube 2개를 꺼내 labeling후, 각 200 μl씩 aliquot5) 각 e tube에 Proteinase K 20 μl, RNase A solution 5 μl을 넣고 vortexing6) heat block에서 incubation (56 ℃, 10 ~ 30 min)※ Heat block 70 ℃ 설정7) 각 e tube에 Buffer BL 200 μl를 첨가하여 inverting8) incubation (70 ℃, 5 min)9) Centrifugation (RT, 13000 rpm, 5 min)? ?? 돌아가는 동안 새 e tube 2개를 꺼내서 labeling (조 이름)10) sup (350 ~ 400 μl)을 조심스럽게 새로운 e-tube로 옮김11) spin down (: 짧게 Centrifugation 하여 sample에 있는 기포 제거)12) 각 e tube에 100% EtOH 200 μl 첨가하고 vortexing13) spin down (: 짧게 Centrifugation 하여 sample에 있는 기포 제거)14) mixture를 spin column으로 옮겨 Centrifugation (RT, 13000 rpm, 1 min)15) collection tube에 있는 용액을 버리고, paper towel에 뒤집어 털어낸 후 다시 끼움16) 각 e tube에 Buffer WA 700 μl를 spin column에 첨가하여 centrifugation (RT, 13000 rpm, 1 min)17) collection tube에 있는 용액을 버리고, 각 e tube에 Buffer WB 700 μl를 spin co의 경우 Genomic DNA보다 농도가 높기에 더 두껍고 선명한 형태의 band를 형성함. 사용된 size marker중 왼쪽에 있는 것은 [DM2300] ExcelBand ™ 100 bp+3K DNA Ladder, 오른쪽에 있는 것은 AccuLadder ™ 1 kb DNA Size Marker 으로 제품 판매처에 올라와 있는 이미지와 비교한 결과, AccuLadder ™ 1 kb DNA Size Marker의 경우 1000 bp 이하는 모두 분리가 덜 되어 겹쳐진 상태로 band 형성되어 있음을 확인. 이러한 현상은 gel의 농도 차이, electrophoresis 실험조건의 상이함 등에 의해 야기될 수 있음.그림 4. Agarose gel electrophoresis7. Discussion이번주차에는 plasmid DNA prep과 genomic DNA prep을 함께 진행하였다. 사실 실험실에서 자주 쓰이는 방법은 kit를 사용하는 것이라고는 하나, 처음해보는 실험이기에 그 원리를 보다 더 잘 이해하고 지식의 토대를 공고히 하기 위해 plasmid DNA prep의 경우는 manual식으로 진행하였다. 두 실험 모두 시간상의 문제로 조교님께서 미리 준비해주신 cell을 이용하여 실험을 진행하였는데, 정석대로라면 streaking, spreading방식으로 도말하여 키운 E.coli를 사용해야했을 것이다. 다만 우리 조 뿐만이 아니라 화요일 실험반의 경우 streaking 방식으로 도말한 plate는 배양도 잘 되고, plate에 satellite colony가 관찰되지 않아 contamination되었을 확률이 낮았기에 실험에 사용하고자 했다면 가능은 했겠지만, spreading방식으로 도말한 경우 colony가 과도하게 자라 계수할 수 있을 정도의 단일 conoly를 얻을 수 없는 상태였다. 따라서 이후 같은 실험을 진행한다면 spreading할 때에 희석배수를 조절해야 온전한 colony를 얻을 수 있을 것 같았다.plasmid DNA prep과 gl

자연과학| 2021.03.14| 23페이지| 4,500원| 조회(390)

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SDS-PAGE 및 Staining(A+보장, 출처가 확실한 양질의 다양한 자료, 검토를 거쳐 더욱 완벽해진 내용) 평가A+최고예요

주차 보고서1. SubjectSDS-PAGE 및 Staining2. Date3. PurposeSDS-PAGE의 원리를 이해하고 단백질 분리를 할 수 있다.4. Introduction1. SDS-PAGE 실험 시 사용되는 재료의 명칭 (Bio-rad 제품)그림 1. SDS-PAGE※ 사용 시 주의 사항 및 자세한 사용법은 ‘10) 실험’ 항목에서 후술.1) Glass plate : Long & Short plate로 구성. Spacer plate의 경우 볼록하게 튀어나온 면이 있음. Short plate 와 Spacer plate를 결합하여 Polyacrylamide gel을 주조하기위해 사용.그림 2. Short plate 그림 3. Spacer plate2) Casting frame : 틈에 Glass plate을 끼워 넣어 사용. Glass plate를 고정 시키는 기능.그림 4. Casting frame3) Casting stand : Glass plate이 장착 된 Casting frame을 고정시켜 gel을 굳히는 기능.그림 5. Casting stand4) Casting Stand Gaskets : Casting stand과 함께 사용. 고무재질로 Casting frame의 밑바닥을 밀봉시킴.그림 6. Casting Stand Gaskets5) Comb : gel을 굳힐 때 sample이 들어갈 well을 만드는 기능.그림 7. Comb6) Buffer dam : Assembly module에 장착되는 glass plates이 한 장일 경우 사용. Assembly module에 장착된 gel과 함께 SDS running buffer을 담을 공간을 형성.그림 8. Buffer dam7) Assembly module : glass plates를 고정시켜 Buffer thank에 장착시키는 장치. Cell Lid, Power Cables과 연결되어 Buffer thank 내에 전류를 흐를 수 있게 함. 플러그는 상이한 색으로 구분 됨.그림 9. Assem 전기장 안에서 움직이는 현상.v = Ez/fv: 이동속도E: 전기장의 세기z: 분자의 알짜전하f: 마찰계수f = 6πηrπ: piη: 용매의 점도r: 분자의 반지름그림 13. Gel electrophoresis다공성 겔은 체(sieve)로 작용. 작은 단백질일수록 겔 상에서 멀리 이동하며 분자량 marker와 비교하여 분자량의 추정이 가능.③ 디스크 겔(Disc gel)- 압축용 겔(stacking gel) : 시료를 겔에 넣었을 때 모든 시료가 같은 시작점에서 출발하도록 시료를 모아주는 역할.Cl ^{-}와Gly ^{-/0}사이에 단백질 압축. 3~5% acrylamide. pH6.8- 분리용 겔(rinning gel) : 크기에 따라 단백질을 분리. 6~15% acrylamide. pH8.8④ 디스크 겔의 제작 : 먼저 분리용 겔 용액을 만들어 장치에 주입. 겔이 굳은 후에 압축용 겔 용액을 붓고 comb을 끼워 홈(well)을 제작.그림 14. 분자량에 따른 단백질의 이동거리Ⅰ. Gel making : Acrylamide와 bis acrylamide을 혼합한 뒤 APS와 TEMED를 첨가. 둘(acrylamide와 bis acrylamide)의 혼합 비율과 농도가 복합적으로 작용하여 구멍 크기 결정. bis acrylamide의 농도가 높을수록 겔은 좀 더 촘촘한 체의 역할을 함. APS와 TEMED가 첨가되면 곧바로 polymerization이 시작되기 때문에 실험을 바로 진행해야 함. gel을 완성하고 comb를 뽑아낸 후에는 모양과 농도의 변화를 방지하기 위해 보관용액(5% acetic acid)에 담아 냉장보관.그림 15. 중합과정Ⅱ. 겔 제작에 필요한 시료압축용 겔 5%(5ml)분리용 겔 15%(10ml)H2O3.4ml2.3ml30% acrylamide mix0.83ml5.0ml10% APS0.05ml0.1mlTEMED0.005ml0.004ml1.5M Tris-HCl-Gly0.63ml(pH6.8)2.5ml(pH8.8)10% SDS0.05ml0. 이동하며 분자량 marker와 비교하여 분자량의 추정이 가능. acrylamide와 bis acrylamide의 혼합 비율과 농도가 복합적으로 작용하여 구멍 크기 결정. bis acrylamide의 농도가 높을수록 겔은 좀 더 촘촘한 체의 역할을 함. 농도가 높을수록 분리가능한 단백질의 크기는 작아짐.2) Stacking buffer① 조성 및 역할 : Stacking gel 제작에 이용.0.5MTrizma6.06g0.4%SDS0.4g- 80ml의 증류수에 용해시킨 후 5N HCl을 가하여 pH 6.8로 조절한 후 증류수를 가하여 100ml로 제작.- SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)를 넣는 것은 전기영동 시 SDS가 확산, 소실되는 것을 방지하기 위함. Tris-HCl-Gly는 buffer로 작용. stacking buffer로 제작된 stacking gel은 시료를 겔에 넣었을 때 모든 시료가 같은 시작점에서 출발하도록 시료를 모아주는 역할.Cl ^{-}와Gly ^{-/0}사이에 단백질 압축. 3~5% acrylamide. pH6.8 (pH6.8 :6.8=9.6+log {[Gly ^{-} ]``10 ^{1}} over {[Gly ^{0} ]``10 ^{3.8}})제작된 겔은 아래와 같은 조성을 이룸.압축용 겔 5%(5ml)H2O3.4ml30% acrylamide mix0.83ml10% APS0.05mlTEMED0.005ml1.5M Tris-HCl-Gly0.63ml(pH6.8)10% SDS0.05ml3) Separating buffer① 조성 및 역할 : Separating gel 제작에 이용.1.5MTrizma18.15g0.4%SDS4.0g- 80ml의 증류수에 용해시킨 후 5N HCl을 가하여 pH 8.8로 조절한 후 증류수를 가하여 100ml로 제작.- SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)를 넣는 것은 전기영동 시 SDS가 확산, 소실되는 것을 방지하기 위함. Tris-HCl-Gly는 buffer로 작용. Separat고정.4) casting stand 바닥에 sealing gasket을 끼움.5) setting된 frame을 casting stand에 올린 후 집게로 고정.6) SDW를 plate 사이로 적당히 부어 아래로 새지 않는지 확인.7) 새지 않으면 SDW를 버리고 남은 물기 제거.(2) Polyacrylamide gel 제작1) 50 ml conical tube에 gel name labeling.2) Separating gel, Stacking gel 조성 각각 넣고 mix. (10 % APS, TEMED 제외!!!)Separating gelX %12 %?Stacking gel5 %?DW7.5 - (X/3) ㎖3.5 ㎖DW2.3 ㎖Sol. A(Acrylamide solution)X/3 ㎖4 ㎖Sol. A(Acrylamide solution)0.67 ㎖Sol. B(Separating buffer)2.5 ㎖2.5 ㎖Sol. B(Separating buffer)-Sol. C(Stacking buffer)--Sol. C(Stacking buffer)1 ㎖10% APS50 ㎕100 ㎕10% APS50 ㎕TEMED5 ㎕5 ㎕TEMED5 ㎕Total10 ㎖Total3 ㎖3) Separating gel에 10 % APS와 TEMED를 넣고 inverting.4) Separating gel 8 ml을 spacer 틈에 넣고, 그 위에 isopropanol을 넣어 기포를 제거.5) RT에서 30 min 굳힘.6) isopropanol 제거 후, DW로 한 번 washing.7) Stacking gel에 10 % APS와 TEMED를 넣고 inverting.8) Stacking gel 2 ml을 spacer 틈에 넣고, ‘1.5 mm, 10 well comb’를 끼움.(이때 튀지 않게 조심!!!)9) RT에서 30 min 굳힘.* 바로 사용하지 않을 시 랩에 싸서 4℃ chamber에 보관.(3) Sample preparation ( 미리 heat block 전원을 켜두고, 95 ② 5X sample buffer의 조성에 따른 band의 차이 등.?온전한 5X sample buffer가 사용된 경우 비교적 뚜렷한 형태와 색상으로 band가 형성되어 있음을 확인 가능. 또한 미리 파악하고 있던 사용된 protein의 zise에 맞게 적절한 위치에 band가 형성되어 있음을 살펴볼 수 있음. 그러나 w/o 2-mercaptoethanol, w/o SDS, w.o glycerol의 경우에는 온전한 5X sample buffer가 사용된 경우와는 다른 모습의 band가 관찰됨. w/o 2-mercaptoethanol의 경우에는 비교적 아래의 위치에 band가 형성되어 size marker의 60 kDa band와 45 kDa band 사이에 band가 위치해 있으며, w/o SDS는 band가 아예 관찰되지 않고, w/o glycerol의 경우에는 넓고 평평하게 고른 형태의 band가 아닌 길게 흔적이 남은 역삼각형 형태의 band가 형성되어 있음(이러한 결과에 대한 원인은 Discussion에 서술).그림 4. destaining 후 gel (1~3조)그림 5. destaining 후 gel (4~5조)3. E.coli streaking, spreading37℃ incubator에서 보관한 plate를 관찰한 결과 E.coli streaking plate, spreading plate모두 colony가 제대로 형성되지 않아 밋밋한 상태의 배지만이 관찰됨. 우리조의 plate 뿐만이 아니라 모든 조의 plate에 colony가 제대로 형성되지 않을 것을 보아 준비된 cell에 문제가 있었을 것으로 추정됨.그림 6. E.coli streaking, spreading7. Discussion이번주차에는 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 혼합용액으로부터 각각의 단백질을 분리하는 실험을 진행하였다. 실험을 진행하기에 앞서 조교님의 조언대로 기기의 명칭 및 사용법을 미리 숙지해왔기에 비교적 수월하게 실험을 진행할 수 있었다. 실험 당시 Polyacryl=3

자연과학| 2021.03.14| 24페이지| 4,500원| 조회(677)

SDS-PAGE, 생화학 실험, staining, 분자생물학 실험, SDS-PA..

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