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생화학실험 결과 보고서 (단백질 정량법)

실험제목단백질 정량법실험날짜2020년 월 일 요일학번이름Ⅰ. 실험방법① 표준물질준비1. 조별로 BSA stock(2mg/ml) 1ml를 이용하여 표준물질을 준비한다.vialBSA증류수final BSA conc.A300 of stock02000B375 of stock1251500C325 of stock3251000D175 of vial B175750E325 of vial C325500F325 of vial E325250G325 of vial F325125H100 of vial G40025I(blank)04000② BCA method1. 50:1의 비율로 A와 B 시약을 섞는다.2. 표준물질 및 미지 단백질 시료를 microplate에 준비한 다음 잘 섞는다.StandardBCA WRAbsorbanceConc.125 of vial A2001.4962000225 of vial B2001.2721500325 of vial C2000.9681000425 of vial D2000.286750525 of vial E2000.967500625 of vial F2000.502250725 of vial G2000.29125825 of vial H2000.29825925 of vial I2000.278010~1125 of protein sample2000.495/0.545339.167/422.5③ Bradford methodStandardBradford dyeAbsorbanceConc.150 of vial A501.0282000250 of vial B501.2331500350 of vial C501.0241000450 of vial D501.01750550 of vial E501.187500650 of vial F500.942250750 of vial G500.877125850 of vial H500.60625950 of vial I500.401010~1150 of protein sample500.954/0.943990.5/935.51. 1x Bradford dye를 냉장고에서 꺼내 상온에 잠시 두고, 사용 전에 충분히 흔들어 준다.2. 표준물질 및 미지 단백질 시료를 microplate에 준비한 다음 잘 섞어준다.3. incubater의 RT에서 최소 5분(1시간 넘지 않게) 돌린다.4. Standard와 미지시료를 595nm에서 흡광도를 측정한다.Ⅱ. 실험결과- 1,3번째 줄이 Standard 시료들이고, 2,4번째 줄이 미지시료들이다. 4번째 줄에 하나 더 있는 시료는 Bradfordassays를 할 때 4번째 시료를 만들 때 무슨 이상인지 너무 묽게 나왔기 때문에 새로 만들어서 저 자리에서재 측정을 하였기 때문이다. 해당 사항은 표준곡선에서 반영되었다.- 밑의 두 이미지는 BCA method와 Bradford assays의 표준곡선 결과이다. 농도에 따라 흡광도가 증가하는경향을 보여주었고, BCA method의 중간에 훅 꺼지는 부분은 색으로는 큰 이상이 없어서 찍어보았으나 흡광도결과가 너무 낮게 나온 경우이다. Bradford에서는 이런 부분을 개선해서 그래프를 만들었고 BCA에서는 비교로써새로 만들지 않고 두었다.[결과보고서]Ⅲ. 토의이번 실험결과는 표준곡선 그래프에서 경향성을 가지지만 지금 이미지에 첨가되어있지 않은 값인 R제곱값을 보면 BCA method는 0.7968, Bradford assay는 0.4136으로 굉장히 낮다. Bradford assay 같은 경우는 오름세의 경향을 보여주다가 등락을 보여주기 때문에 신뢰도가 매우 낮아졌고, BCA method 같은 경우는 Bradford 보다는일정한 경향성을 같지만 4번째 시료가 이상했던 점이 그대로 드러났고, 1000ug/ml에서가 500ug/ml보다 값이큰 차이를 보여주지 않기 때문에 신뢰도가 더 높아지지 못하였다. 하지만 두 실험모두 양의 경향성을 가지게 되었고 이에 기대어 미지시료들의 농도를 구해보면, BCA에서 미지시료 1은 339.167ug/ml, 그리고 미지시료 2는422.5ug/ml가 되었다. Bradford assay에서는 미지시료 1은 990.5ug/ml, 그리고 미지시료 2는 935ug/ml를 가 되었다. 미지시료의 단백질 함량을 모르고 있기 때문에 정확한 오차 발생의 여부나 어느정도의 오차가 발생하였는지에 대해서는 알 수가 없지만 그래프 자체의 신뢰도가 많이 떨어지기 때문에 정확한 값들은 아닐 것이다.그래프 자체의 신뢰도가 높지 않기 때문에 오차가 발생했다고 가정하고 그 이유를 찾아보면, 우선 4번째 시료의농도가 될 것이다. BCA와 Bradford assay 모두 4번째 시료가 농도가 처음에 이상하게 만들어졌었다. 육안으로 봐도 색 자체가 매칭이 되지 않아 Bradford assay에서는 다시 만들었었는데, 다시 만들었다고 해도 정확하지 않았을 수가 있고 이 부분이 정확한 차례를 잘 지켜서 만들어졌는데도 오차가 크다면 처음 만든 Standard 자체가잘못 만들어진 것이기 때문에 오차가 매우 커질 것이다. 그런 경우가 아니라 실험조작자의 오류에 기인한 것이라면, 우선 e-tube에 넣는 과정에서 pipette tip의 기포가 발생하여 정확한 양을 못 넣었을 수가 있다. 그리고 투입하는 양 자체가 너무 적어서, 필요한 양이 모두 pippete에서 나오지 못하여 최대한 넣어보려고 몇 차례 애를 쓰기도 하였지만 다 담기지 않았던 실험과정이 있기도 하였다. 이런 부분이 심하고 덜 심하고의 차이가 그래프의신뢰도를 낮춰버리는 요인이 되었을 수가 있다. 그리고 Bradford assay는 bradford 시약과 단백질의 결합하는 정도에 따라 결과 값이 달라질 수 있는데, 이런 발색을 이용한 단백질의 정량은 시간이 지날수록 결과 값이 달라지는 경우가 생기기 때문에 시약을 다 만들어놓고 한번에 흡광도를 재는 방식이었던 이번 실험에서는 이 부분이영향을 미칠 수도 있다. 그 외에 e-tube에 단백질이 골고루 분포되지 않아 BSA가 정확하게 희석이 되지 않은

자연과학| 2020.09.24| 4페이지| 2,000원| 조회(232)

단백질, 생화학, 리포트, 화학, 단백질 정량, 생화학실험, 결과, 화학과, 실험 결과

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생화학실험 결과 보고서 (효소반응속도론)

실험제목효소반응속도론실험날짜2020년 월 일 요일학번이름Ⅰ. 실험방법 (3개조가 한 팀을 이뤄 실험을한다. 우리 3조는 substrate가 20ul 들어가는 3번째를 담당했다.)1. Determining Km value of alkaline phosphatase① E-tube에 reaction buffer, DW, substrate를 넣고 잘 섞어준다.(우리 조는 buffer 500ul, DW 475ul, substrate 20ul를 넣었다.)② Enzyme을 최종적으로 첨가하면 반응이 시작된다. (섞고 즉시 inverting)③ 0,1,2,3 분간 상온에서 반응을 시켜주고 시간에 따라 1M NaOH를 250ul를 첨가하여 반응을 중단시킨다.④ cuvette에 1ml 반응용액을 넣어 OD를 측정한다.2. Determining Ki value of inhitor① E-tube에 reaction buffer, DW, substrate, inhibitor를 넣고 잘 섞어준다.(우리 조는 buffer 500ul, DW 475ul, substrate 20ul, inhibitor 2.5ul를 넣어 주었다.)② Enzyme을 최종적으로 첨가하면 반응이 시작된다. (섞고 즉시 inverting)③ 0,1,2,3 분간 상온에서 반응을 시켜주고 시간에 따라 1M NaOH를 250ul를 첨가하여 반응을 중단시킨다.④ cuvette에 1ml 반응용액을 넣어 OD를 측정한다.Ⅱ. 실험결과time/absorbance12300.8291.096010.8241.2042.05720.7491.2632.10130.7941.3172.10245600.0320.0240.01910.0740.0650.12920.0850.1180.21530.0840.1920.162- △A/min1230->1-0.005△A1=-0.01890.108△A2=0.08842.057△A3=1.26950->2-0.040.08351.05050->3-0.01170.07370.7014560->10.042△A4=0.02860.041△A5=0.0480.11△A6=0.0670->20.02650.0470.0430->30.01730.0560.048- V (V=A/ε*l*min), (ε=18300/M*cm)△V1=-0.00000103M=1.03△V2=0.00000483M=4.83△V3=0.00006937M=69.37△V4=0.00000156M=1.56△V5=0.00000262M=2.62△V6=0.00000366M=3.66- SS5 = 10mM * 5/1000 = 0.05mMS10 = 10mM * 10/1000 = 0.1mMS20 = 10mM * 20/1000 = 0.2mM- 1/S1/S5 = 201/S10 = 101/S20 = 5- 1/V1/V1 = -0.9711/V2 = 0.2071/V3 = 0.01441/V4 = 0.6411/V5 = 0.3821/V6 = 0.273- Lineweaver-Buck plot- Without inhibitor의 Vmax, KmVmax : 1/0.6034 = 1.657Km: Km/Vmax=-0.0731, Km=(-0.0731)*1.657=-0.1211- With inhibitor의 Vmax, KmVmax : 1/0.1435=6.969Km : Km/Vmax=0.0247, Km=0.0247*6.969=0.172-Inhibitor A의 inhition modeKm값이 inhibitorA 첨가로 ?0.1211에서 0.172로 증가하였기 때문에 경쟁 억제제라고 할 수 있다.- 실험사진 첨가[결과보고서]Ⅲ. 토의이번 실험에서는 기질과 효소의 Michaelis-Menten을 바탕으로, 반응속도를 산출해보고 효소-기질-Inhibitor 간의결합 및 저해 mechanism을 추정하였다. 효소와 기질의 직접적인 구조의 규명없이 단순하게 반응속도의 기질의존성만을 측정하여 효소와 기질, Inhibitor의 mechanism을 쉽고 빠르게 이해할 수 있는 Michaelis-Menten 이론을 활용하였다. 실험 방법에서는 반응시간에 따라, 그리고 기질의 농도에 따라 그리고 Inhibitor의 유무에 따라다르게 시험관을 준비하여 실험을 진행하였고, 일관적이게 NaOH를 첨가하여 반응을 중단시켰다. Enzyme은 얼음에 넣어두었다가 사용할 때만 꺼내어 써주었는데, 이는 Enzyme의 활성이 그 이유이다.Vmax와 Km 값을 도출할 때, PNP의 유전율(ε)은 18300/M*cm으로 계산을 진행하였고, Spectrophotometer를 통해얻어낸 흡광도를 0~1, 0~2, 0~3으로 나누어 분당 흡광도로 변환한 뒤, 이것의 평균값을 각각 Inhibitor가 없는1, 2, 3, 그리고 Inhibitor가 있는 4, 5, 6의 평균 분당 흡광도로 배정을 하였다. 이를 토대로 Lambert-Berr변형식을이용하여 V를 구하고, 기질의 농도를 구하여 S값을 구한다. 이 두 값을 Inhibitor가 있을 때, 없을 때로 구분지어그래프로 나타내면 위의 실혐 결과의 그래프인 lineweaver-buck plot을 완성할 수 있다.그래프를 완성 시키면서, Inhibitor가 있을 때의 그래프는 Vmax와 Km 값 모두가 양수로 나왔으며, 만족할 만한개형을 가졌다. 하나 의아했던 점은 기질의 농도가 증가할수록 흡광도가 줄어들고 따라서 V가 줄어드는 모습을보여주었다. Inhibitor가 없을 때의 그래프는 Vmax와 Km 값 중 Vmax가 양수, Km 값은 음수가 나왔다. Km 값이증가하였기 때문에 사용된 Inhibitor는 경쟁 억제제임을 알 수 있었다. 하지만 그래프의 개형이 만족스럽지가 않았는데, 기질이 5ul함유 되었을 때 0min에서의 흡광도가 너무 높게 나온 게 화근이었다. 이를 이유로 Km 값이음수를 갖게 되었다. 결과적으로 Km 값이 증가하긴 했기 때문에 경쟁 억제제로 보았을 때, Inhibitor가 있을 때의V가 줄어드는 모습은 이 경쟁 억제제가 기질의 농도가 높아질수록 더 활발해지는 특성을 가짐을 추정해 볼 수있다. 하지만 Michaelis-Menten 식 자체가 몇 가지의 단순화 가정, 근사 등을 기반으로 유도된 것이기 때문에어디까지나 추정일 뿐일 것이다.Ⅳ. 감상이번 실험 자체는 시간이 짧고 과정이 단순했기 때문에 어려움이 크지 않았다. 하지만 결과 보고서를 작성할

자연과학| 2020.09.24| 3페이지| 2,000원| 조회(485)

효소, 생화학, 리포트, 화학, 반응속도론, 생화학실험, 결과, 화학과, 실험 결과

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생화학실험 결과 보고서 (단백질 전기영동)

실험제목단백질 전기영동실험날짜2020년 월 일 요일학번이름Ⅰ. 실험방법① SDS page gel 제작1. 유리판에 gel casting을 할 면을 에탄올과 증류수, kimwipes를 이용하여 깨끗이 닦는다.2. gel kit를 조립하고 조교가 준비한 용액을 가져온다.3. separating gel 용액을 casting 한 kit에 붓는다.4. 마지막으로 물 (또는 n-butanol, isopropanol)을 맨 위에 1cm 정도 덮어준다.5. 10~20분 기다린 후, 층이 잘 분리가 되고 직선으로 잘 굳어 있으면 물을 제거하여 준다6. stacking 용액을 준비하여 마지막으로 APS, TEMED를 넣고 kit에 붓는다.7. 마지막으로 comb를 꽂아 넣고 bubble이 들어가지 않도록 주의한다.8. 최종적으로 굳은 gel은 well을 깨끗이 씻어서 전기영동을 준비한다.(이 과정은 1,2,3 조 중에 우리 조만 성공하여 3조의 kit로 1,2,3조의 실험을 모두 수행하였다.)② 단백질 샘플 준비1. 단백질 2ul + DW 6ul + 염색시약 2ul을 90도에서 5분 정도 끓여서 완전 변성화2. 다시 얼음에 넣어 차갑게 하고, 12000 rpm에서 5분간 원심분리③ 전기영동1. gel running casting을 진행하고 running buffer를 채우고 pre-running을 10분 정도 150V에서 진행 한다.2. well을 주사기로 잘 씻어준 다음 마이크로 피펫을 이용하여 샘플을 로딩한다.3. 150V로 dye가 gel 맨 아래쪽에서 빠질 때까지 전기영동을 진행한다.④ 단백질 염색1. 전기영동을 마친 gel을 분리하여 플라스틱 용기에 CBB staining solution을 첨가하여, 수평 교반하면서 10~15분간 염색시킨다.2. 염색이 완료되면 stanining solution은 회수하고, destaining solution을 충분히 부어 overnight3. 다음날 gel을 확인하여 사진을 찍고, 단백질의 분자량을 확인한다. (이 부분은 조교가 확인 후 통보하였다.)Ⅱ. 실험결과- 첫 번째 사진은 loading을 마친 모습이고 separating 되기 전의 단계로 gel이 3조 밖에 굳지 않았기 때문에column수가 절묘하게 들어맞아 3조의 kit에서 1,2,3 조의 단백질 전기영동 실험을 한번에 하고 있다.- 두 번째 이미지는 이번 실험에서 사용된 size마커 도표로 아래 첨부될 실험이미지에 따르면 tris gly 10%이다.- 마지막 칸이 차례대로 미지시료1, 미지시료2 이다. 위에 첨부한 size 마커대로 보면 맨 왼쪽의 대표 size marker의 모양을 보면 Tris glycine gel 10%임을 모양을 보고 알 수가 있다. 그에 따라 미지시료의 유효한 band를빨간 네모로 표현한 이미지이다.Ⅲ. 토의이번 실험은 glycine과 cl-, 그리고 단백질의 이동속도를 기반으로 진행하는 전기영동 실험이었다. 이번 실험의주의 사항으로는 먼저 Gel cassette을 조립할 때 두꺼운 판이 뒤, 얇은 판이 앞으로 위치하게 하여 조립하는 것이 있었다. 두 번째로, gel을 굳히기 위해 gel monomer solution을 부을 때 거품이 생기지 않도록 신중하게 gel을 붓는 것이었다. 세 번째는 gel solution을 제작할 때, APS와 TEMED를 신속하게 넣어 gel 틀에 붓는 것이었다. APS와 TEMED를 넣으면 gel solution이 굳는 반응이 바로 진행되기 때문에신속하게 진행해야 했다. 네 번째는 running gel 위에 stacking gel이 위치하도록 하는 것이었다. 마지막으로 sample loading을 하기 전에 well을 주사기로 청소해주는 것이었다. well에는 전기영동에 영향을줄 수 있는 불순물이 섞여있기 때문에 이를 주사기로 제거하기 위함이었다. 실험의 결과로는 위의 이미지와 같이 전기영동 결과가 나왔는데, 두 미지시료 모두 75, 63, 48, 35kDa의 단백질을 함유하고 있었는데, 차이가있다면, 48kDa 부근의 밴드가 다른 지점에서 나타났기 때문에 이 부근의 단백질은 서로 다를 것이고, 미지시료 1의밴드들이 전반적으로 불분명하게 많이 찍혀서 나타났기 때문에, 미지시료 2와 비슷한 단백질 조성을 가질 것이라고속단할 수는 없었다. 그리고 미지시료 2 또한 35~48kDa에서의 밴드가 불분명하기 때문에 어떤 정도의 단백질량을가지는 지 확실하지 않다. 하지만 size marker에서의 유효한 값의 band를 찾을 수 있기 때문에, 어느정도 선에서는 미지시료 1과 미지시료 2가 비슷한 단백질 조성을 가질 것이라는 것을 유추해 볼 수는 있다.

자연과학| 2020.09.24| 3페이지| 2,000원| 조회(493)

단백질, 생화학, 전기영동, 리포트, 화학, 생화학실험, 결과, 화학과, 실험 결과

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생화학실험 결과 보고서 (PCR and Electrophoresis)

실험제목PCR and Electrophoresis실험날짜2020년 월 일 요일학번이름Ⅰ. (1) 실험방법 PCR1. 1.5ml e-tube에 30ul 3차 증류수와 colony 1개를 풀어준다.2. 멸균된 0.2ml PCR tube에 다음과 같은 비율로 샘플을 섞는다.Control(ul)Sample(ul)Template-3Primer-F11Primer-R11Taq mix553차 증류수3-Total10103. Tube를 centrifuge한 다음, PCR 기기에 넣고 조건을 설정하여 돌린다.(2) 실험방법 agarose gel electrophoresis 해당과정은 2조가 수행하였다.1. 100ml 삼각플라스크에 0.4g agarose와 40ml 1x TAE buffer를 넣어준다.2. 삼각플라스크 입구를 랩으로 덮고 구멍을 조금 뚫는다.3. 전자레인지에 20sec씩 2-3번 돌려서 완전히 녹는 것을 확인한다.4. gel kit와 cast, comb를 조립한다.5. 3번의 용액을 조립된 kit에 조심히 붓는다.6. 30min간 완전히 굳힌 뒤, comb를 빼고 gel을 꺼낸다. 보통 1/10의 loading dye를 넣지만 더 잘 보이기 위해서 2ul 첨가1. miniprep 한 plasmid DNA 10ul + 2ul loading dye2. PCR 결과물 10ul +2ul loading dye1. 전기영동장치에 gel을 두고, gel이 잠길 정도로 1x TAE buffer를 붓는다.2. sample을 loading 하는데 plasmid ? without template ? with template 순으로 한다.3. 전기 영동장치의 전원을 연결하여 100V, 20-30분 정도 전기영동한다.Ⅱ. 실험결과- 1번의 결과인 plasmid의 결과에서는 1, 3조의 결과에서 밴드를 관찰할 수 있고, 2조의 결과에서는 어떤 밴드도관찰되지 않았다.- 2, 3번의 결과인 PCR product의 결과에서는 1, 2조의 결과에서는 확연한 template의 유무에 따른 차이를 볼 수있었으나 3조의 결과에서는 template의 유무에 따른 차이를 관찰할 수 없었고, 관찰된 밴드마저도 희미하였다.Ⅲ. 토의이번 실험은 plasmid DNA purification에 이어 바로 진행된 실험으로 templat DNA(colony)의 유무에 따른electrophoresis 결과 차이를 알아보는 실험이었다. 실험 결과에서 1번의 결과는 plasmid의 결과로 이전 결과보고서에서 다루었으므로 언급하지는 않고 2번이 template를 넣지 않았을 때, 3번이 template를 넣었을 때의 결과로이에 대해서 작성하려 한다.먼저 1조는 명확히 밴드들이 잘 관찰되었고, 3조는 아주 옅게, 2조는 1조보다는 덜 진하게 밴드들이 관찰된다.전기영동을 통해 얻어진 결과에서 각 레인의 밴드들이 갖는 색의 농도는 검출된 DNA의 양을 뜻하며, 1조가 가장DNA를 많이 얻어내었고, 3조가 가장 적게 얻어내었다는 것을 알 수 있다. 그리고 하나의 밴드가 아닌 여러 개의밴드들을 관찰할 수가 있는데, 이는 PCR을 준비할 때 과정을 생각해 보면 알 수 있다. control과 sample에 공통적으로 첨가된 primer-F와 primer-R, 이 두 개가 각 레인의 맨 아래에 두 밴드를 형성하고 sample에서 특이적으로 가지는 template의 밴드가 700Bp 부근에서 나타난다. 하지만 700Bp 부근에서도 밴드가 미세하게 분화되어있는 것을 관찰할 수가 있는데, 이는 supercoile circular와 open circular 구조, linear 구조의 혼재 때문에 갈라지는 것이라고 생각할 수 있다. 그리고 이번 실험에서는 염색을 위해 Ethidium bromide를 주로 사용하는데, 이시약은 DNA의 이중나선 구조사이로 끼어 들어가 결합하게 되어 agarose gel에 UV 빛을 쬐어주면 DNA가 있는 자리에 DNA에 결합한 Ethidium bromide이 형광 빛을 발하면서 위치를 확일할 수 있는 원리를 갖고 있다. 좀더 설명하기에 앞서 DNA 전기영동 실험에는 두 가지 dye가 필요하다. 여기에 대한 설명을 하자면, 첫 번째는agarose geld서 로딩한 DNA 샘플이 어느정도 이동하고 있는지를 보게 해주는 시각적인 dye와 두 번째는 DNA와결합해서 agarose gel상에서 DNA의 위치를 파악하게 해주는 dye이다. 첫 번째 dye는 혼자서 이동하는 것으로[결과보고서]DNA의 이동과는 무관하게 전기영동 시간에 따라 이동하며 시각적인 효과만을 준다. 두 번째 dye는 DNA와결합하고 있기 때문에 DNA가 존재하는 곳에만 존재하게 된다. Ethidium bromide가 두 번째 dye에 해당하는데,이것이 DNA 사이로 끼어들 때, 돌연변이를 유발하여 세포를 사멸 또는 암세포화 시키는 역할을 하기 때문에 강력한 발암제로 독성이 매우 높은 위험한 성분이라 할 수 있으며, 더욱이 승화하는 성질이 있어 대기중으로 계속해서 증발되어 나오기 때문에 시약의 효율성, 경제성이라는 장점이 있으나 위험성이 아주 큰 염색시약이라고 할수 있다. DNA에 삽입되는 intercalating agent로써 틀변환 돌연변이를 일으키는 발암물질인 Ethidium bromide는제한된 구역에서 사용되어야 하며, 수용성으로 신체가 오염되었을 시에는 물로 즉시 닦아주고, 항상 어두운 곳에보관되어야 하는 주의사항들이 있다. 이에 대해 대체시약으로 개발되고 있는 dye들은 Ethidium bromide보다 경제적이지 못하고 DNA를 검출해 내는 감도가 떨어지는 단점들이 있지만, 무독성이기 때문에 요즈음에는 이번 실험에서 사용된 loading star를 널리 이용하고 있다.이번 PCR, Electrophoresis 실험에서 제대로된 밴드들을 얻어내지 못한 이유에 대해서 생각해보면, 몇가지 이유를 들 수가 있다. 매번 오차요인으로 지목되는 기구 사용 간의 부정확성이 먼저 있다. micro pippet이라는 평소에사용을 해 볼 기회가 상대적으로 적은 기구를 운용함에 있어서 근소한 부피들에 대해 부정확한 측정과 옮겨담기가 있었을 것이다. 게다가 실제로 실험 중에 이게 피펫에서 다 빠져나갔는지 애매한 경우가 더러 있었기 때문에이런 부분도 오차에 한 몫 기여했을 것이다. 두 번째 요인으로 PCR 시에 증폭이 잘 되지 않아서 gene의 copy 수가 적게 나타났기 때문일 수 있다. 하지만 그랬다면 특정 gene 이외의 DNA가 복제 되었다는 뜻인데 실험결과에서 그렇게 나타나진 않았기 때문에 맞는 요인은 아닐 것이다. 다음으로 primer band에서도 희미하게 관찰된 것

자연과학| 2020.09.24| 3페이지| 2,000원| 조회(342)

PCR, 생화학, 리포트, 화학, 생화학실험, 결과, 화학과, 실험 결과, electo..

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생화학실험 결과 보고서 (Plasmid DNA Purification)

실험제목Plasmid DNA purification실험날짜2020 년 월 일 요일학번이름Ⅰ. 실험방법1. 준비된 cell pellet을 꺼내 150ul A1용액으로 풀어준다.2. 250ul A2용액을 넣고 5회 정도 inverting 해준 다음, 2분 동안 실온에 놓는다.3. 350ul A3용액을 넣고, 색이 사라질 때까지 inverting 한다. vortexing 하지 않도록 한다.4. micro-centrifuge로 12,000rpm 으로 3분 돌린다.5. 상층액을 DNA spin column+collection tube 세트에 옮긴다.6. column을 통과한 액을 버리고 collection tube를 다시 꽂아준다.7. column을 통과한 액을 버리고 collection tube를 다시 꽂아준다.8. 450ul AQ용액을 첨가한 후, centrifuge 12,000rpm으로 1분 돌린다.9. column을 통과한 액을 버리고collection tube를 다시 꽂아준다.10. 빈 상태에서 centrifuge를 한 번 더 돌린다.11. DNA spin column을 새 e-tube로 옮겨서 50AE 용액을 첨가한 후, 1분간 방치한다.12. Micro-centrifuge로 12,000rpm으로 1분 돌린다.13. E-tube에 걸러진 plasmid DNA를 새로운 e-tube에 담는다.14. plasmid DNA는 전기영동으로 확인하기 위해 냉장고에 보관한다.Ⅱ. 실험결과Ⅲ. 토의이번 실험은 alkaline lysis 방법을 이용하여 Plasmid DNA Purification을 해보는 실험이었다. 먼저 실험방법 각과정에 대한 설명을 하자면, 각 과정에서 사용되는 A1, A2, A3, AQ 용액들이 있다.먼저 A1용액은 박테리아 벽을 깨주게 만들어 주면서 glucose로 삼투압을 유지시켜준다. A1은 resuspensionsolution이라고도 하는데, RNase의 존재로세포가 깨졌을 때 RNA를 분해시켜주고 세포가 용액에 골고루 영향을받을 수 있도록 완전히 resuspension시키기때문이다.다음으로 A2용액은 lysis solution으로 SDS에 의해 cell membrane 단백질의 고유전하가 변하고 lipid가 제거되어cell이 깨지게 된다. 쉽게 말하면 단백질을 변성을 통해 풀어주고, DNA 또한 풀어주는 용액이다. 이때 세포막이깨져 세포내용물이 용액으로 흘러나오면서 용액은 투명해지고, NaOH의 존재로 인해 pH가 급격히 상승하여박테리아의chromosomal DNA와 plasmid DNA는 변성되어 분리되게 된다.다음으로 A3용액은 산성으로, 급격히 상승한 pH를 중성으로 만들어 주어 변성되었던 DNA를 다시금 재생하게만든다. 여기서 plasmid DNA는 크기가 작아 원래의 모양으로 재생이 가능하지만 chromosomal DNA와 같이 크기가 큰 것들은 재생되지 못하고 단백질과 엉켜 복잡한 구조를 형성하면서 투명한 수층에 모이게된다.다음으로 AQ용액은 수득률을 높이기 위한 용액으로 EtOH가 들어있다. A2용액을 첨가할 때 다량의 NaOH가들어가게 되고, A3용액에 의한 중성화로 인해 염이 만들어지게 되는데, AQ용액을 첨가함으로써 NaOH와 염의제거가 이루어지면서 수득률을 높일수 있게 된다.마지막으로 AE용액은 Column의 DNA를 녹여서 collection tube로 내려오게 만드는 역할을 한다. DNA를 충분히모으기 위해 1분 정도 기다리는 시간 또한 필요하다.각 용액을 이용한 과정들을 살펴보면, 먼저 cell pellet을 꺼내서 A1용액을 첨가하여 박테리아의 벽을 허물어서풀어주게 된다. 그리고 A2용액을 넣어 5회정도 inverting하여 단백질 및 내부의 DNA를 모두 풀어주게 되는데,염기성으로 인해 거품이 이는 모습을 보여준다. A3용액을 첨가하여 Plasmid DNA만 다시 재생을 시켜주는데,이 때, DNA와 SDS가 엉켜서 흰색의 침전물이 생기게 된다. 침전물을 제외한 나머지가 Plasmid DNA이다. 이후AQ를 첨가하여 용해도 차이를 이용한 DNA와 염의 결합력을 증가시켜 침전시킨다. 원심분리 과정 이후, AE를 첨가하는데, 이는 elution buffer로써, column의 DNA를 녹여 collection tube로 내려오게 한다. 정제 후 DNA 전기영동을 통해 분리가 잘 이루어졌는지 확인하게 된다. 위의 실험결과 중 첫 번째 이미지가 전기영동 이후의 결과인데, 그래프를 잘 보면 3조와 1조는 2000~3000Bp에서 진한 밴드가 확인되었고 그 위로 옅은 밴드들을 확인할수가 있다. 하지만 2조의 경우에는 plasmid 검출라인에서 밴드 자체가 나타나지 않았다. DH5alpha 는 3000~4000Bp에서 밴드가 관측되면 plasmid가 존재하는 것으로 확정할 수가 있는데, 1,3조의 경우에는 plasmid가 관측이 되기는 하지만, plasmid의 분리가 제대로 이뤄지지 않아서 주변의 옅은 밴드들이 존재하는 것으로 생각할 수 있다.반면 2조는 검출자체가 되지가 않았는데, 이는 A시약들을 첨가할 때 제대로 처리가 이루어지지 않았거나, A3 용액 첨가 이후 상층액을 원심분리하고 나온 액을 버릴 때 너무 버려서 plasmid가 검출되지 않을 만큼 미비하게[결과보고서]남았을 경우가 있을 것으로 사료 된다. 다시 1, 3조의 결과로 돌아가 옅은 밴드가 몇 개 생성된 경우에 대해서생각해보자면, 첫 번째로 마이크로 피펫 사용 시, 조작 미숙으로 인해 정확한 부피를 얻어내지 못한 경우가 있을것이다. 그리하여 buffer들이 제대로 된 작용을 하지 못하여 DNA의 적절한 정제가 이루어지지 않았을 수 있다.두 번째로 생각해 볼 수 있는 것은 plasmid DNA는 supercoiled 구조이기에 pH 변화에 큰 영향을 받지 않아변성이 잘 일어나지 않지만 lysis 과정이 다소 길어서 구조에 변성이일어나 linear 또는 open circular 형태의plasmid가 되었을 수 있다. 따라서 밴드에서 한 밴드만 검출되지 않고 해당 부근에서 여러개의 밴드가 관찰된것은 약간의 변성에 의해 여러 형태의 구조가 나타난 것으로 생각해 볼 수가 있다. 다음으로 생각해 볼 수 있는

자연과학| 2020.09.24| 3페이지| 2,000원| 조회(213)

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