황금코다리 스토어

황금코다리

개인인증

팔로워0 팔로우

소개

등록된 소개글이 없습니다.

전문분야 등록된 전문분야가 없습니다.

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

6개
전체 판매량

145개
최근 3개월 판매량

0개
자료후기 점수

평균A+
자료문의 응답률

-

전체자료 6개

catalase와 protease 효소 확인

1. TitleCatalase 와 Protease 효소 확인2. Object실험 시 이용되는 균주가 Catalase 와 Protease 활성을 나타내는 가를 확인해보고, 이 두 가지 효소에 대해서 이해한다.3. Principle & Theoryⅰ. 활성화 에너지(activation energy)화학반응은 일정한 에너지를 가진 분자들의 충돌에 의해 일어나는데, 화학반응을 일으킬 수 있는 최소 운동 에너지를 활성화 에너지라고 한다. 활성화 에너지보다 큰 에너지를 가지고 있는 분자들이 충돌하면 반응이 진행된다. 활성화 에너지가 높은 반응은 쉽게 일어나지 않으며, 활성화 에너지가 낮은 반응은 빠르게 일어난다. 온도가 10℃ 올라가면 활성화 에너지보다 많은 에너지를 가지고 있는 분자들이 많아지기 때문에 반응 속도가 약 두 배 빨라진다. 활성화 에너지가 작아지면 정반응 속도만 빨라지는 것이 아니라 역반응 속도도 빨라진다. 생물체 밖에서는 온도나 압력을 높여 주어야 화학반응 속도가 증가하지만, 생물체 내에서 일어나는 화학 반응은 효소가 촉매 역할을 하므로 온도나 압력을 높여 주지 않아도 화학 반응이 촉진된다. 생물체 내에서 효소는 기질과 결합하여 활성화 에너지를 낮춤으로써 화학 반응 속도를 빠르게 해준다. 따라서 효소가 관여하는 반응은 효소가 관여하지 않는 반응에 비해 반응 속도가 빠르며, 단위 시간당 생성되는 생성물의 양이 많다. 그리고 화학반응에 있어서 생물체 밖 화학반응은 반응이 한 번에 일어나므로 많은 양의 열과 빛이 한꺼번에 방출된다. 반면 생물체 내 화학반응은 반응이 여러 단계를 거치면서 일어나므로 에너지가 단계적으로 소량씩 방출되며, 효소에 의해 조절되므로 체온 범위의 온도와 1기압 상태에서 신속하게 일어난다.ⅱ. 효소의 성질효소는 촉매의 일종으로 어떤 반응의 속도를 매우 빠르게 만들어주는 역할을 한다. 효소가 반응물과 결합하는 특정 부위를 활성부위라고 하며, 효소는 활성 부위와 입체 구조가 맞는 기질하고만 결합하므로 한 가지 효소는 한 가지 기질하고만 결합 할 수 있다. 이와 같은 성질을 기질 특이성이라고 한다.위의 그림을 보면 꼭 자물쇠에 열쇠가 들어 가는듯한 모습인데 그래서 효소의 기질특이성을 열쇠-자물쇠설이라 부르기도 한다. 자물쇠에 열쇠가 맞아야만 열리는 것처럼 효소는 활성 부위의 입체구조와 기질의 입체구조가 일치하는 경우에만 작용한다.효소의 이러한 특징 때문에 저해제라는 것도 존재한다. 저해제란 말 그대로 효소의 기능을 저해하는 물질인데 경쟁적 저해제와 비경쟁적 저해제가 있다. 경쟁적 저해제는 기질과 입체구조가 유사해서 효소의 활성 부위에 기질과 경쟁적으로 결합함으로써 위 그림에 나와 있는 효소-기질복합체의 형성을 방해하는 물질이다. 비경쟁적 저해제는 효소의 활성 부위가 아닌 다른 부위에 결합하여 활성 부위의 구조를 변형시킴으로써 효소-기질복합체의 형성을 방해하는 물질이다.ⅲ. 효소의 활성에 영향을 주는 요인크게 3가지가 있다. 온도와 pH, 기질의 농도이다. 온도 같은 경우는 효소가 관여하는 반응에서 반응 속도는 온도가 올라감에 따라 빨라지다가 일정 온도를 넘어서면 효소의 활성이 급격하게 떨어진다. 이유는 효소의 주성분인 단백질이 높은 온도에 의해 변형되어 제 기능을 하지 못하기 때문이다.pH는 단백질의 입체 구조에 영향을 미치므로 효소는 당연히 pH의 영향을 받는다. pH에 따른 효소의 활성은 그 기능과 작용기관에 따라 다르게 된다. 예를들어 위속의 펩신은 최적 pH가 2인데 반해서 카탈라아제 같은 효소는 최적 pH가 7이다.기질의 농도 같은 경우는 다른 조건이 일정할 때(효소의 수도 일정) 기질의 농도가 증가함에 따라 반응속도가 빨라지다가 효소와 기질의 결합이 포화 상태에 이르면 반응속도가 일정해진다. 화학반응에 있어서 반응물이 많으면 반응속도가 빨라지는 것과 비슷한 원리라 할 수 있다.ⅳ. Catalase와 Catalase test세균의 성상 시험 중 하나로 본래 catalase는 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 효소이다. Slide glass위에 3% H2O2 1방울을 놓고 평판배지에서 발육된 신선집락을 loop로 따서 혼합하여 검사하는 방법이다. 기포가 발생하면 catalase 시험양성이다. catalase 시험은 포도상구균에서 연쇄상구균을 감별하거나 그람 양성간균과 마이코박테리움을 감별하는데 가장 흔하게 사용된다. catalase는 과산화수소를 산소와 물로 분해하는 효소이다. 화학적으로 catalase는 분자내에 4개의 철 원자가 환원상태보다는 산화된 상태인 것을 제외하고는 헤모글로빈과 구조가 유사한 hemoprotein이다. 연쇄상구균을 제외하곤 대부분의 호기성 세균과 통성 혐기성 세균은 catalase activity를 가지고 있다. 과산화수소를 분해하는 대부분의 혐기성 세균은 분자 당 ferric ion을 하나씩 만을 가지고 있다는 점만 제외하곤 catalase와 유사한 peroxidase 효소를 가지고 있다.가스가 발생하면 양성이다. 일부 세균은 과산화수소를 분해하는 catalase 이외의 효소를 가지고 있으므로, 20~30초 후에 매우 작은 가스가 발생하면 양성으로 판정하지 않는다. 그밖에 catalase는 적혈구 내에 존재하므로 집락에 혈구가 함유되지 않도록 한다. 만약 혈액배지에서 자란 집락에 과산화수소수를 가하면 적혈구 내 catalase 작용에 의하여 생긴 약하고 지연된 공기방울은 양성으로 취급하지 않는다.Catalase test의 생화학적 원리는 다음과 같다.Hydrogen peroxide는 호기성 당분해 산화과정의 최종산물로서 세포 독성작용이 있으므로 세포내에 축적되면 세포가 죽게된다. 그러므로 세균들은 catalase나 peroxidase를 이용하여 hydrogen peroxide를 분해한다. Catalase는 hemoprotein으로서 한 분자당 3가 철이온 (Fe+++)이 4개가 있으며 효소활성시에는 산화 상태로 존재한다. 일부 세균은 Iron을 함유하지 않는 catalase를 가지고 있으며 이러한 catalase를 pseudocatalase라 한다. 전형적인 catalase 효소는 과산화수소를 가수분해하고 산에 강하나 pseudocatalase는 산에 약하다. Catalase는 대부분의 cytochrome을 함유한 호기성 및 통성 혐기성 세균에 존재하지만 연쇄구균을 포함한 일부 균종에는 없다. Catalase 효소는 Hydrogen peroxide를 가수분해하여 물과 산소를 만들며 cytochrome system이 없는 세균의 대부분은 catalase 효소가 없으므로 과산화수소를 가수분해하지 못한다. 대부분의 혐기성 세균은 catalase 대신에 peroxidase 효소를 가지고 있으므로 혐기성 세균에서의 catalase 시험은 peroxidase에 의해 간섭 영향을 받을 수 있기 때문에 비특이적인 시험방법이다.ⅴ. Protease펩티드결합을 가수분해하는 효소를 일컫는 말이다. 종류에는 펩신, 펩티다아제, 트립신 등이 있다. 펩신(pepsin)은 위에서 분비되는 소화효소이다. 위의 주세포에서 분비되는 펩시노겐(pepsinogen)이 염산에 의해 펩신으로 활성화된다. 펩신은 단백질을 폴리펩티드로 분해하며, 위에서 말 했듯이 pH2정도의 낮은 산성 환경에서 가장 활발하다. 펩티다아제(peptidase)는 단백질 분해효소이며 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소인데 거의 모든 생물의 세포 내외에 분비되며 종류도 많고 분포도 넓다. 펩티다아제는 크게 엑소펩티다아제 즉, 말단의 아미노산이 만드는 펩티드 결합에 작용하는 것과(종류: 아미노펩티다아제, 카복시펩티다아제. 디펩티다아제 등)와 엔도펩티다아제 즉, 중심에 있는 펩티드결합까지 작용하는 것으로 나뉜다. 소화관에 분비되는 종류에는 트립신과 펩신이 있다. 트립신(trypsin)은 이자액에서 분비되는 단백질 분해효소이며 펩신과 함께 제일 중요한 단백질 분해효소이다. 이 효소는 1874년 퀴네라는 사람이 발견하였다. 펩타이드 아미노산 서열 중에서 아르기닌(arginine)과 리신(lysine) 뒤를 가수분해하는 분해 기작을 지닌다. 이자액에서는 트립시노겐의 형태로 분비되고, 분비 후 트립신으로 활성화 되어 단백질 또는 펩타이드를 가수분해할 수 있다.4. Apparatus & Reagents, Procedureⅰ. Apparatus & ReagentsBacillus subtilis, Enterococcus faecalis, slide glass, 과산화수소, 멸균 정제수, clean bench, pipet, autoclave, incubator 등ⅱ. Procedure(1) Catalase test① 사용되는 균(Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis)을 slide glass에 도말한다.② 도말한 slide glass 위에 3% 과산화수소 용액을 한 방울 떨어뜨린 후 거품생성 여부를 확인한다. (과산화수소를 가한 즉시 기포가 발생하면 강한 양성반응, 5분 후에 발생하면 약한 양성반응, 10분 후에 발생하거나 발생하지 않으면 음성반응으로 판정한다.)

자연과학| 2019.10.07| 7페이지| 2,000원| 조회(213)

미생물, protease, 효소, enzyme, 활성화에너지, 결과, Catalas..

미리보기

닫기
박테리아 성장곡선 평가A+최고예요

1. Title박테리아 성장곡선2. Object세균을 대량 배양할 때나 또는 조사해야 할 시료의 수가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정해 볼 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 구해보고 또 정확한 균체수의 측정을 위하여 콜로니 계수법을 병행해 보도록 한다.3. Principle & Theoryⅰ. 생장곡선생물의 생장을 시간에 따라 측정하여 그래프로 표시한 곡선이다. 생물의 생장에 영향을 주는 요인을 분석하거나 여러 생물 사이의 생장을 비교할 때 사용하게 된다. 생장곡선의 전형적인 모양은 S자 모양의 시그모이드 곡선이다.위의 그림은 생장곡선의 패턴을 보여준다. 여기서 보면 기대되는 개체군의 생장곡선은 지수함수 y=x^2의 형태의 그래프를 나타내야 하지만, S자 모양으로 기울기가 감소하게 된다. 그 까닭은 환경저항에 있다. 어느 환경에서든지 특정 생물의 개체군은 개체수가 증가함에 따라 먹이부족, 천적, 생활공간의 부족, 경쟁의 증가, 노폐물의 축적 등 여러 요인에 의해 방해를 받게 된다. 즉 생물이 어떤 환경에서 증식을 할 때, 증식을 억제하도록 환경으로부터 가해지는 힘을 환경저항이라 한다. 개체수를 P라고 하고 생물의 증식능력을B_p, 환경저항을 R이라고 하면 개체수 P는 다음과 같은 수식으로 표현이 가능하다고 한다.P= { B_p} over {R }다음은 환경저항과 관련된 시간에 대한 개체수의 그래프이다.ⅱ. 미생물의 생장미생물의 생장(growth)이라는 말은 미생물 구성성분의 양적증가와 구조 및 크기의 증가를 뜻한다. 이 말은 세포의 무게와 크기의 증가가 있으면 그 세포는 세포분열을 하게 될 것이고, 결국은 개체수의 증가와 이어지게 된다. 이번 실험에서 우리가 원하는 결과는 미생물 개체의 질량과 크기의 증가보다는 집단생장(population growth) 즉 미생물 총수의 증가에 초점을 맞출 필요가 있다.-세대시간:미생물은 일반적으로 이분법을 한다. 한 개의 세포가 분열 때마다 두 개의 세포수 있다.?이러한 직선 방정식은 세포가 지수생장을 한다는 것을 보여준다. 세포집단은 일정한 기간동안 두배가 된다는 뜻하다.-지수생장의 수학지수생장을 하는 세균의 배양에서 일어나는 세포수의 증가는 2배 씩으로 기하급수가 된다. 세포 하나가 계속 분열을 하게 되면2^0 rarrow 2^1 rarrow 2^2 rarrow CDOTS rarrow 2^n이렇게 증가하게 될 것이다. 배양을 할 때 처음 존재하는 세포의 수와 지수생장의 특정 기간이 지난 후에 존재하는 세포수의 관계에 대해 최종세포수를 N이라 하고 처음세포수를N_0, 그리고 지수생장의 기간 동안 일어난 세대수를n이라 하면 최종세포수를 구할 수 있는 수식을 유추할 수 있다.N= N_0 2^n 이 수식을 n에 대해서 변형시킬 수 있다. 그 과정은 다음과 같다.log N = logN_0 2^n ,logN=logN_0 + n log 2logN-logN_0 =n log 2n= {logN-log N_0}over{log2} = {logN-log N_0}over{0.301} = 3.3(log N-log N_0 )THEREFORE n=3.3(logN -log N_0 )이렇게 n에 관한 식으로 변형하였다.따라서 이 공식으로 세대수를 계산할 수 있다.N, N_0값은 실험으로 도출 가능하다. n값을 구하게 되면 세대시간을 쉽게 산출 가능하다.ⅲ. 박테리아 생장곡선앞에서 이야기한 지수생장은 이상적인 상태를 뜻하고, 실제 미생물의 생장은 환경저항 및 새로운 환경의 적응 등의 이유로 다음과 같은 그래프의 모양을 가지게 된다.위에 보이듯이 Lag phase(지체기), Exponential phase(지수기), Stationary phase(정지기), Death phase(사멸기) 이렇게 크게 4가지 생장주기가 있다.자세히 살펴보면 다음과 같다.1. Lag phase(지체기)세균배양액이 희석되어 다른 배지로 옮겨질 때, 생존 가능한 세포들의 수는 즉시 증가하지 않는다. 그 시기를 지체기라 하는데 이 시기동안 미생물은 증식을 위한 여러 필를 형성하지 못하는 세포는 앞으로의 기아상태를 대비해 몸을 감싸 방사능 및 화학물질에 더욱 내성을 가지게 된다.또한 세포벽 및 세포막의 조성이 변화한다.3. Stationary phase(정지기)에너지와 영양분의 공급이 고갈되면 세포는 정지기로 들어간다. 어떤 세포들이 증식하는 동안 다른 세포들은 죽게 되면서 전체 개체군 총 세균수는 비교적 일정하게 남아있다. 이것은 죽은 세포들이 펩티드와 핵산을 방출하여 다른 세포들의 영양분과 에너지원을 제공하기 때문이다. 정지기 동안 생존 가능한 세포들은 이차 대사물질들을 합성하고 변환한 화학적인 특성들을 유지한다. 세포들이 정지기로 남아있는 시간의 길이는 종과 환경적인 요소에 따라 다양하다. 사멸되는 박테리아의 수와 신생되는 박테리아의 수가 균형을 이루어 총 박테리아의 수에 별 변동이 없는 시기이다.4. Death phase(사멸기)세포들이 일정한 비율로 사멸함으로써 개체군 내 총 세균수가 감소하는 기간이다. 세균의 사멸은 대수적으로 일어난다. 그러나 세포개체군은 보통 세포가 대수기에서 증식하는 것보다 훨씬 천천히 죽어간다. 신생되는 박테리아 수보다 사멸하는 박테리아의 수가 증가하여 생균수가 점차로 줄어드는 시기가 사멸기이다.ⅳ. 미생물의 생장에 영향을 주는 요인미생물의 생장에 영향을 주는 요인으로는 크게 4가지가 있다. 온도, 수분, pH, 산소가 있다.1. 온도미생물이 생장하기 위해선 가장 최적의 온도가 있고 최적온도가 가까워질수록 생장속도가 빨라진다. 하지만, 최적온도를 지나기 시작하면 단백질의 변성과 세포막의 붕괴, 열에 의한 용혈현상으로 미생물이 자라기 힘들어지다가 자라지 못하는 최고온도에 다다르게 된다. 미생물마다 최적의 온도가 다르다.- 온도에 따른 생장률을 그린 그래프. 미생물마다 최적 온도가 다른 것을 알 수 있다.2. 수분수분은 생명체가 활동하는데 꼭 필요한 요소로써 대부분의 반응에 수분이 사용된다. 대부분 수분이 많은 곳에 미생물이 많이 자라게 된다. 수분의 가용성은 환경이 보유하고 있는 물의 양, 즉 이용 가능한 물의 양은 작아지고 생장을 못하게 되는 것이다.3. pH미생물마다 주로 자라는 pH는 다르며 산성을 좋아하면 호산성균 염기성을 좋아하면 호알칼리성균이라 하고 이들은 산성에 강한 DNA를 보호하거나 염기성에 강한 RNA를 보호하기 위해 자기 내부의 pH를 유지한다.4. 산소미생물들 중에는 호기성 미생물과 혐기성 미생물이 있다. 호기성 미생물은 산소가 있는 곳에서 잘 자라는 미생물이고, 혐기성 미생물은 산소가 없거나 적은 곳에서 생장하는 미생물이다.ⅴ. 미생물의 생장 측정 방법 (세포 수의 측정법)세포의 수를 측정하는 방법은 직접계수법(direct microscopic count)과, 생균수 측정법(viable count)이 있다. 미생물의 생장 여부를 알 수 있는 빛의 분광도 측정법도 있지만 세포 수의 측정법과 거리가 멀어 따로 언급하겠다.1. 직접계수법배양액의 일정량을 일정 넓이의 검경 면적위에 놓고(계수장치, counting chamber) 현미경으로 균수를 세는 방법이다.페트로프-하우저(Petroff-Hausser) 계수기를 이용해 현미경으로 직접 측정하는 방법이 있어 소개해보겠다.- 페트로프-하우저(Petroff-Hausser)의 모습이다. 첫 번째 그림은 측면이고 두 번째는 정면, 세 번째는 눈금을 확대한 모양이다.죽은균과 살아있는 균의 구별이 불가해 구별 없이 세균을 센다. 조건이 있는데 시료는 액체여야 하고, 평균값을 내는 방법이므로 신뢰도 향상을 위해 균체가 107/ml 이상이 되어야 한다고 한다. 그리고 시료 수가 많을 때에는 세기 까다롭다는 단점이 있으며 조작이 간단하고 짧은 시간내에 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 간단하지만 결과는 신뢰도가 많이 떨어진다. 단위 부피당 세균수를 구한다면 원하는 값을 계산할 수 있다.2. 생균수 측정법일정의 조건으로 콜로니를 만드는 세균수를 육안으로 측정한다. 살아있는 균을 측정하는 방법으로, 여러 가지 방법이 있는데 페트리디시를 쓰는 평판법이 일반적이고 그 밖에 막 여과(membrane fi 방법 (상대적 증가 관찰)기본적인 원리는 현탁한 세포(cell suspension)에 의해 생기는 빛의 분산도를 측정하면 미생물 수의 상대적 증가를 알 수 있는 것이다.흡광도(absorbance)는 용액이 빛을 흡수하는 정도를 나타낸 양이다. Lambert-Beer law에 의하면 흡광도에 대한 수식은 다음과 같다.A=log {입사광의강도} over {투과광의강도}여기서 A는 흡광도이다. 따라서 A의 값이 높으면 높을수록 배양된 균이 많다는 것이다. 또한 흡광도는 빛이 투과하는길이, 용액의 농도에 비례한다. 용액의 농도를 C, 빛이 투과하는 길이를 d라 하고 비례식이므로 비례상수 k를 넣어주면A=C TIMES d times k라고 표현이 된다. 여기서 비례상수 k 대신varepsilon _ lambda라고 표기하며varepsilon _ lambda는 분자 흡광 계수라고 한다.?빛의 분산도(turbidity) 측정법을 알기 쉽게 도식화한 그림4. Apparatus & Reagents, Procedureⅰ. Apparatus & ReagentsEnterococcus faecalis, Escheria coli, TSB액상배지, TSB고상배지, 삼각플라스크, 마이크로 피펫, microtube, 증류수, Clean Bench, shaking incubator, 분광광도계, 큐벳 등ⅱ. Procedure-UV 측정1. 삼각플라스크에 TSB 액상배지 100ml을 넣고 autoclave(121℃, 15min)하여 멸균한다.2. 사용되는 균을10 ^{6},10 ^{ 8}으로 희석하고, 1ml을 TSB 액상배지(삼각플라스크)에 접종한다.3. 배양액 1ml을 microtube에 채취한 후 t0라고 표기한다. 그리고 삼각 플라스크는 shaking incubator에 배양한다.4. t0을 포함하여 시간 별로 흡광도를 측정한다. (0시간, 2시간, 4시간, 6시간, 7시간)(2시간 간격으로 TSB액상 배지가 든 삼각 플라스크를 shaking incubator에서 꺼내 배양액 1ml을)

자연과학| 2019.10.07| 12페이지| 2,000원| 조회(3,607)

미생물, 분광광도계, 배양, 사멸기, 생육, 성장곡선, 정지기, 지수기, 지체기, 지수생..

미리보기

닫기
그람염색

1. Title그람염색2. ObjectGram 염색에 의한 세균 감별염색(Differential staining)방법을 익히고, 세균의 Gram양성(Violet 색) 및 음성(적색)에 따르는 분류와 염색성의 원리, 방법, 기본지식을 이해한다.3. Principle & Theoryⅰ. Peptidoglycan다당사슬에 비교적 짧은 펩티드사슬이 결합한 화합물을 뜻한다. 쉽게 말하면 세균의 세포벽에 있는 당단백질이다. 펩티도글리칸은 세균에만 존재하며 N-아세틸뮤람산과 diaminopimeic acid(DAP)는 고세균이나 진핵생물에는 존재하지 않는다. 펩티도글리칸에 아미노산 DAP를 함유하고 있는 생물은 모든 그람-음성 세균과 몇몇 그람-양성 세균이다. 그람-양성 구균의 펩티도글리칸은 DAP 대신에 lysine을 함유하고 있으며 몇몇 다른 그람-양성 세균은 DAP나 lysine과는 다른 아미노산을 가지고 있다. 위의 그림은 Peptidoglycan의 구조이다. 그림을 보면 M과 G라 되있는데, M은 NAM을 뜻하고, G는 NAG를 뜻한다. 보통 글리칸가닥은 반복되는 이당류인 NAG, NAM으로 구성된다. 평균 길이는 약 30개의 이량체이지만 다양한 길이의 분포를 보여준다.NAM기에 공유결합으로 연결되는 것은 펩티드이고, 여기에 몇 가지 비정상적인 아미노산이 첨가되며 대표적으로 D-글루탐산 D-알라닌 및 DAP(diaminopimelate)가 있다. DAP는 교차결합은 펩티드 사슬에서 마지막 D-알라닌의 방출로 이어진다. 일부 세균의 경우 펩티드 교차결합은 아미노산을 추가적으로 흡수하며, 그람양성세균에서는 교차결합에 하나 또는 그 이상의 글리신이 NAM-NAG의 가닥에 연결된다.위의 그림은 그람음성세균과 그람양성세균의 peptidoglycan층의 차이를 보여준다. 그람음성세균은 glycan의 단일 층으로 구성된 peptidoglycan의 얇은 층을 가지고있다. 이 구조는 2차원적이고 펩티드 교차다리는 glycan 가닥으로 된 2차원면에만 존재한다. 반대로 그람 양성세. Gram staining (differential staining; 분별염색)Gram staining은 1884년 덴마크의 내과의사 Christian Gram이 처음으로 고안하였다. Christian Gram에 의해 고안된 분별염색(differential staining)은 세균의 식별을 용이하게 하기 위해 2가지 이상의 생물학적인 염료를 사용하는 염색법이다. 또한 이 기법은 특별한 세포구조물을 염색할 때 사용되기도 한다.그람염색법은 단염색법에서 관찰할 수 있는 세균들의 크기, 형태, 배열상태 뿐만 아니라 세균을 그람양성과 음성 이렇게 두 부류로 구분을 할 수 있다. 단염색과 그람염색법의 다른 점은 단염색은 한가지의 염색약만 사용하지만, 그람염색법은 세균을 두종류로 구분하기 위해 두종류의 염색약을 사용한다.그람염색의 핵심은 일차염색 그리고 탈색, 그다음 대조염색이다. 그중에서도 탈색과정이 매우 중요하다. 일차염색(primary stain)에 사용된 crystal violet이 탈색제(decolorizing agent)에 의해 탈색이 되어야 그람염색으로 원하는 결과를 얻을 수 있으며, 탈색정도는 세포벽의 구성성분의 차이와 연관있다.그람양성균은 위에서 설명한 것과 같이 두꺼운 peptidoglycan층을 가지고 있다. 하지만 그람음성균은 그람양성균에 비해서 얇은 peptidoglycan층을 가지고 있다. 뿐만 아니라 그람음성균은 지질(lipid)을 함유한 층을 바깥쪽에 지니고 있다. 이러한 세포벽 구성비에 의해 세균을 그람양성 그람음성 이렇게 두 그룹으로 분리할 수 있는 것이다.crystal violet으로 염색 후에 사용하는 Gram's iodine은 매염제(mordant)로서 crystal violet과 결합하여 불용성의 CVI(crystal violet-iodine) 복합체를 형성하여 염색능력을 향상시킨다. 단백질 변성과 지질의 용매로 작용하는 95% 에탄올을 일정시간 처리하면 염색약이 탈색되기 시작한다. 하지만 그람양성세균의 세포벽은 두꺼운 peptid복합체를 떨어져나가게 한다.- 그람양성세균은 세포벽에 지질을 포함하지 않아서 세포벽은 세균으로부터 CVI 복합체의 손실에 대한 장애물의 역할을 한다.- 탈색단계에서 탈색제에 노출되는 시간이 길어지면 잘못된 염색결과가 나온다.- 늙거나 죽은 세균은 CVI복합체를 유지할 능력이 없어져 잘못된 염색결과가 나온다.그람염색같은 감별 염색법은 미생물학에 있어서 매우 중요한 기술 중의 하나이다. 시약의 조성 및 시간을 변형한 여러 방법이 개발되었는데 그 중 Hucken의 염색법이 많이 사용된다.그럼 Hucken의 변법(modification)에 대해서 보자.1. 도말, 건조, 고정은 단염색법에서와 같이 한다.?슬라이드를 부분으로 나누어 첫 세부분에는 세균을 각각 도말하고 마지막 부분에는 세균을 혼합하여 도말한다.2. Hucken crystal violet액을 도말표본에 떨어뜨려 1분간 염색한 후 물로 씻어낸다.3. Gram's iodine액으로 1분간 처리하고 물로 씻어낸다.4. 95% 알코올로 20~30초 탈색한 후 물로 씻어낸다.5. Safranine액으로 20초간 대조염색(counter-stain)한 후 물로 씻어낸다.6. 공기중에서 말린 후 경검한다.그람염색의 과정과 결과를 쉽게 보려면 다음 그림을 보면 된다. 색상표현은 안되어 있지만 이해를 하는데 있어서는 충분하다. ⅳ. 여러 가지 염색방법1. 단순염색(Simple staining)광학현미경으로 미생물을 관찰 할 때에 염색을 하지 않고 관찰하는 것은 어렵다. 그 이유는 관찰하고자 하는 미생물과 명시야와 배경간의 불충분한 대조 때문에 그럴 것이다. 이 문제를 최소화해서 광학현미경에 의한 관찰을 용이하게 하기 위해 미생물들을 염색할 수 있다. 단순염색은 세포를 염색하기 위해 한 가지 약물만 사용하여 염색하는 방법이다.위의 그림은 세균의 형태와 배열을 나타낸다. 단순염색 방법을 사용하여 세균 세포를 염색된 세포의 형태와 배열을 관찰할 수 있다.단순염색방법은 1. 염색대 위에 열고정된 슬라이드 글라스를 놓고 methyl 고정시켜 염색한 후에 관찰 하는 것을 원칙으로 한다. 염색을 위한 도말표본의 준비를 위해서는 미생물체와 적당한 도말, 자연건조와 열고정 등의 기본적인 과정이 포함된다.1. 도말(smear)Slide glass에 도말을 하기 전 슬라이드 글라스의 청결이 중요하다. 특히 지방의 제거가 중요하다. 슬라이드 글라스를 알코올에 담구어 뒀다가 깨끗한 거즈(Gauze)로 닦아 사용하면 좋다. 슬라이드 글라스의 전면에 백금이로 물이나 균액을 도말해서 잘 퍼지면 탈지가 잘 된 것으로 간주한다. 탈지가 불충분하면 세균의 고정이 되지 않아 염색 시 흘러내려가 버린다. 도말은 가능하면 얇고, 둥글고, 편평하게 한다. 고체배지에서 자란 균(colony)을 도말할 때는 증류수를 약간만 풀어 얇게 혼합하여 도말한다. 미숙자의 잦은 실수는 고체배지에서 도말을 할 때에 세균을 너무 두껍게 도말하는 것이다. 액체배지에서 배양된 균액 사용시에는 잘 흔들어서 혼합 후 멸균된 백금이로 1~2회 떠서 슬라이드 글라스에 원형으로 얇게 도말한다.larrow그림은 습윤표본 제작 순서이다.좌측이 액체배지이고 우측이 고체배지이다.화질이 안좋아서 잘 안보이는데,액체배지부터하면 액체배지에서 자란 균액 1~2 loop를 슬라이드 글라스에 놓는다. 그 다음 1.5cm~2.0cm 되게 타원형으로 도말한다. 그리고 커버 글라스를 덮고 현미경으로 관찰한다.고체배지는 슬라이드 글라스에 물이나 식염수를 1~2방울 넣고 loop로 아주 작은 집락을 따서 얇게 도말한다음 커버글라스로 덮는 것이다.larrow도말표본 제작 순서이다.위의 경우와 거의 같은데 도말 후에 실온에서 건조 한 후 분젠버너에서 건조, 고정 시키는게 다르다.2. 건조(dry)시료를 도말한 표본은 공기 중에 두어 자연건조 시키는 것이 원칙이다. 급히 서두를 경우는 도말한 면을 위로 하여 약한 불꽃 위에서 표본을 좌우로 흔들면서 건조시킨다.3. 고정(fixation)시료를 도말한 면을 위로하여 약한 불꽃 중에서 3회 정도 천천히 통과시켜 가면, 균체는 그 원형배율로 관찰시1. 오른손으로 경주를 잡고 왼손으로 경각을 받친 상태로 현미경을 이동시켜 실험테이블에 놓는다. 현미경 이동시 한 대씩 들고 이동 할 것. 실험테이블은 수평이며 진동이 없어야 한다.2. 전원을 연결한 후 광원을 켜고 빛의 최대 밝기의 3/4 정도로 조절한다.3. 시료가 있는 슬라이드 글라스를 제물대에 고정시키고, 제물대 이동나사를 조절하여 시료가 있는 부위가 집광기로부터 빛이 들어오는 부위에 오도록 조절한다.4. 집광기를 위로 올려 제물대와 조금 떨어진 위치에 놓고 조리개를 조절하여 빛의 양을 중간 정도로 조절한다.5. 저배율 대물렌즈를 시료위에 맞춰 놓는다. 대물렌즈가 대물렌즈교환기 중앙의 잠금 장치에 있는지 확인 한다.6. 옆에서 보면서 조동나사를 이용하여 대물렌즈와 프레파라트를 가깝게 위치하도록 한 다음 시료와 대물렌즈를 서서히 떨어뜨리면서 대략적인 상을 맞춘다.7. 미동나사로 정확하게 초점을 맞춘다.8. 최상의 이미지를 얻지 못했을 때는 조리개와 집광기를 조절하여 최상의 조건을 만든다. 일반적으로 저배율에서는 집광기를 약간 내리고 조리개를 줄여서 통과하는 빛의 양이 적게 하여 관찰한다.9. 최상의 이미지를 얻은 후 제물대 이동나사를 조절하여 최상의 관찰물을 찾고, 최상의 관찰물을 찾은 후에는 미동 나사를 상하로 움직여 입체적으로 관찰한다. 대안렌즈가 쌍안인 경우에는 두 대안렌즈의 간격을 관찰자의 눈 간격과 같게 조절하고, diopter 조절나사를 한쪽식 조절하여 관찰자의 시력에 가장 적절한 상을 얻도록 하여야 한다.*고배율로 관찰시1. 대물렌즈를 고배율로 돌려놓는다.2. 집광기와 조리개를 조절한다. 고배율일수록 집광기를 위로 올리고 조리개는 열어 녾는 것이 좋다.3. 100x 대물렌즈를 사용시에는 유침유를 프레파라트에 한방울 떨어뜨리고 관찰한다. 프레파라트 위의 유침유에 대물렌즈가 닿은 상태에서 관찰한다.4. 짧은 파장의 빛을 주었을 때 해상능이 높아지므로 청색 필터(blue filter)나 녹색 필터(green filter)를 사용하기도 다 .

자연과학| 2019.10.07| 15페이지| 2,000원| 조회(440)

현미경, 그람염색, gram, 결과, Negative, Gram staining, Positive

미리보기

닫기
항균성 시험

1. Title항균성 시험2. Object흔히 사용되는 항생물질을 이용하여 항생제에 대한 미생물의 감수성 정도를 측정한다.3. Principle & Theoryⅰ. 항생제(Antibiotics)의 정의미생물이 생산하는 대사산물로 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질을 말한다. 그러나 항생제 중에는 미생물에서 유래하지 않고 합성된 것도 있으며, 처음 발견은 미생물에서 하였지만 인공적으로 합성된 약물, 또는 기존 항생제의 구조 중 일부를 변경하여 만든 반합성 약물 등이 있는데, 이러한 약물은 ‘항생제’보다는 ‘항균제’라고 하는 것이 더 정확한 표현이다. 세균 이외에 진균이나 바이러스 등 미생물에 작용하는 약제도 있으나 이러한 약품은 항생제라 명명하기에 알맞지 않다. 항진균제나 항바이러스제 등 이러한 약을 모두 포함시킨다면 ‘항미생물제제(antimicrobial agents)’라고 하는 것이 더 정확한 표현이다.ⅱ. 항생제의 종류항생제는 다음과 같이 분류가능하다.① 페니실린(penicillin)류 :페니실린은 페니실리움(Penicillium)속에 속하는 곰팡이에서 얻은 화학 물질로 박테리아로 발생한 병을 치료하는 데 사용되는 항생제의 한 종류이다. 페니실린은 박테리아의 세포벽을 자라지 못하게 함으로써 박테리아가 용균(lysis)되게 하여(세포벽이 약하여 세포액이 밖으로 나와 박테리아가 죽는 현상) 박테리아의 생장을 억제한다.② 세팔로스포린(cephalosporin)류 : 페니실린계의 항생 물질. C, N, P 등의 종류가 있다. 병원균의 세포벽 합성을 억제하여 살균작용을 한다. 페니실린에 저항성이 생긴 포도상구균 등의 그람양성균뿐 아니라 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 엔테로박테르(enterobacter) 등에도 효과가 있다.③ 아미노글리코사이드(aminoglycoside)류 : 아미노글리코시드(aminoglycoside)는 아민이 변형된 글리코시드(배당체)로 구성된 분자 또는 그 일부를 말한다. 여러 가지 아미노글리코시 있다. 그람양성균, 음성균 리케차, 크리미디아에 정균적으로 작용한다. 세균의 리보솜의 50S 소단위(L16 단백질)에 작용하고 펩티드전이작용을 저해한다. 내성은 세균의 아세틸전달효소의 생산에 의해 나타난다. 3-OH기가 아세틸화되고 이것이1-OH기에 전위되고 새롭게 생성된3-OH도 아세틸화된다. 그람양성균, 장티푸스균·변형균 등의 그람음성균, 리케차 및 대형 바이러스, 다른 항생제에 저항성이 있는 감수성균 감염에 효과가 있다.⑥ 폴리펩티드(polypeptide) 항생제 : 호중구(때로는 대식세포)의 아주르과립 등에 많이 포함되어 있는 항균성 단백질 또는 펩티드. 약 30개의 아미노산으로 구성된 환상펩티드인 디펜신이나 카텝신 G, 엘라스타아제, CAP(cationicantimicrobial protein), 37/아주로시딘 등의 서프로시딘족 단백질 및 BPI단백질(bactericidal/permeability increasingprotein) 등이 있고, 모두 그람음성균에 살균작용을 보이지만앞의 2개와 아주로시딘 등은 그람양성균이나 진균에도 유효하다. 또 미엘로과산화효소, 리소자임, 락토페린 등도 항균성 단백질의 범주에 속한다. 인체의 세포막에 작용하여 전신에 투여했을 때 신장 독성을 나타내므로 거의 사용하지 않지만 국소투여용으로 사용한다.⑦ 퀴놀론(quinolone)류 : 퀴놀론카르복실산또는 유사한 구조를 모핵으로 하는 합성 항세균약의 총칭으로 광범위 항생제이다. 세균 DNA를 초코일(supercoil)로 압축하는 효소인 DNA 선회효소를 억제한다. 그람양성균과 특히 녹농균, 살모넬라 등의 그람음성균에 대해 현저한 항균력을 나타낸다.?항생제의 작용기작의 모식도ⅲ. 항미생물제의 분류세균배양에 미치는 영향을 관찰함으로써 항미생물제는 살균제, 정균제, 용균제 3가지로 분류할 수 있다. 살균제는 세포에서의 작용부위를 견고하게 결합하여 희석을 해도 제거되지 않아 세포를 죽인다. 하지만 죽은 세포가 파괴되지 않는다. 따라서 총 세포수는 일정하게 유지된다. 정균제는 세포농도 이하의 항생제 농도를 갖는 시험관에서는 생장이 일어난다.특정 약제의 MIC는 일정하지 않고 균주, 접종량, 배지의 조성, 배양시간 및 온도, pH, 통기 등의 조건에 의해 달라지게 된다. 따라서 배양조건을 표준화하면 될 것이다.항미생물 활성을 측정하기 위해 사용되기도 하고 이번실험에서 사용되는 분석법은 디스크 확산기법(disk diffusion technique)이다. 한천배지에 균주를 접종해 원형의 여과지에 항미생물제를 첨가한다. 그러면 여과지로부터 한천배지로 항미생물제가 확산되고 여과지로 거리가 멀수록 항미생물제의 농도는 낮아질 것이다. 여과지로부터 일정한 거리에 MIC 농도가 형성된다. 형성되는 생장저해 구역(zone of inhibition)의 직경은 여과지에 투여한 항미생물제의 농도 및 용해도, 확산상수 및 효능에 비례하게 된다. 이러한 방법들은 병원성 미생물이 항생제에 얼마나 감수성을 가지는지에 대해 조사하기 위해 사용된다.?항생제가 여과지로부터 주위의 한천으로 확산되어 항생제에 민감한 미생물의 생장을 저해한다.ⅴ. 실험에서 사용 될 항생제의 소개이번실험에서는 Ampicillin, Tetracycline이 사용될 예정이다. 두 약품에 대해 간략히 설명해 보겠다.1. AmpicillinC_16 H_19 N_3 O_4 S. 분자량 349.42.그람음성세균세포 표층의 투과성이 뛰어나고, 그람양성균뿐만 아니라, 대부분 의 그람음성균에도 유효한 넓은 항균스펙트럼을 가진광역페니실린의 대표적인 경구약제이다.암피실린은 가장 널리 사용되는 천연 페니실린인 페니실린 G와 비슷한 작용을 하며, 위산에 더 안정하여 경구투여가 가능하다. 암피실린은 또한 특정 세균주에 대해 활성이 더 강하다. 암피실린은 투여하기가 쉽기 때문에 널리 쓰이는 페니실린 항생제이다. 구조는 다음과 같다.2. TetracyclineC_22 H_24 N_2 O_8. 분자량 444.44.Streptomyces aureofaciens 또는 다른 Streptomyces에 의해생산되는 테트라사이클린계 램프, clean bench, paper disk, methanol, Ampicillin, Tetracycline, pipet, autoclave, incubator, microtube 등ⅱ. Procedure① 사용되는 균(E.coli, Bacillus subtilis)을 각각 106으로 희석시킨다.② 희석시킨 균을 Mueller-Hinton 배지에 500㎕ overlay한다.③ overlay 후, clean bench 안에서 물기가 거의 없을 정도로 말린다.④ paper disk에 항생제(Tetracycline, Ampicillin)를 각각 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 40㎍/㎖, 80㎍/㎖에 접종하고, control로 사용 할 디스크에 메탄올을 접종한다.⑤ 어느 정도 말린 후 멸균한 핀셋을 이용해 접종한 디스크를 overlay한 배지에 올려 놓고, 디스크 중앙을 가볍게 눌러 배지 표면에 완전히 부착시킨다.⑥ 디스크 간의 간격은 충분히 떨어져야 한다. 각 디스크 중심 간의 간격은 24mm 이상이어야 하며 평판 가장자리로부터 15mm 이상 떨어져야 한다.⑦ incubator ( 37℃, 24~48시간)에서 배양을 실시한 후 결과를 관찰한다.5. ResultAmpicillin을 넣은 Bacillus subtilis 와 Tetracycline을 넣은 Bacillus subtilisAmpicillin을 넣은 Escherichia coli 와 Tetracycline을 넣은 Escherichia coliAmpicillin을 넣은 Escherichia coli 와 Tetracycline을 넣은 Escherichia coli6. Discussion & Feeling첫 번째 Ampicillin을 넣은 Bacillus subtilis 와 Tetracycline을 넣은 Bacillus subtilis 를 비교해보면 환의 크기가 Ampicillin이 Tetracycline보다 상대적으로 크다는 것을 알 수 있다. 이 뜻은 MIC값이 Ampicillin이 더 작다는 것 같다. 디스크생력을 나타낼수 있는 균의 범위가 더 넓다는 것이다. Ampicillin은 페니실린 계열이라 세포벽에 작용을 할 것이다. 그런데 그람양성균은 펩티도글리칸층이 두터워 항생물질의 영향을 많이 받을 것이나, 그람음성균은 펩티도글리칸층이 별로 두텁지 않아 항생물질의 영향을 작게 볼 것이라 생각된다. 물론 세포벽에 작용한다고 β-락탐계 항생물질이 그람음성균을 못 죽이지는 않을 것이다. 대신 3세대 세파로스포린계열 처럼 높은 세대의 항생물질을 써야 할 것이다. 그리고 Tetracycline같은 경우는 리보솜의 밑단부분 (30s)에 작용해서 단백질 합성을 저해하는 항생제라 그람음성균이던 양성균이던 상관없이 살균효과를 나타 낸 것 같다. Ampicillin을 넣은 Enterococcus faecalis 와 Tetracycline을 넣은 Enterococcus faecalis 는 실험결과가 이상하게 나왔다. 콜로니도 저렇게 듬성듬성 난데다가 Enterococcus faecalis 의 콜로니 치고는 너무 컷던 것 같다. 그리고 Enterococcus faecalis 는 그람양성구균인데 위 사진처럼 Ampicillin을 주입한 디스크 주변에 붙어 있는 것도 보인다. 이 점을 보면 Escherichia coli를 잘못 접종하지 않았나 하는 생각도 들기도 한다. 왜냐하면 Tetracycline을 주입한 디스크 주변에는 세균이 관찰이 안 되었기 때문이다. 하지만 또 그렇게 볼 수 없는게 너무 듬성듬성하게 콜로니가 형성되는 바람에 지금 저 배지에 자라는게 Escherichia coli인지 아니면 Enterococcus faecalis인지 그저 우연히 Tetracycline을 주입한 디스크주변에는 안자라는지 알 수가 없다. 콜로니 모양은 Escherichia coli가 맞는 것 같다. 순수배양 때 콜로니의 외형을 관찰한 적이 있기 때문이다. 내 예상으로는 우리가 stock에 있는 균을 따서 micro tube에 희석하는 과정에서 Enterococcus faecalis stock을 이용한 다.

자연과학| 2019.10.07| 9페이지| 2,000원| 조회(233)

미생물, 항생제, Escherichia coli, 감수성, ampicillin, 결과

미리보기

닫기
순수배양

1. Title순수배양2. Object공기 중과 토양 속에서 배양한 미생물을 순수 분리하는 방법과 세균의 형태와 크기,배열상태 등을 관찰해본다.3. Principle & Theoryⅰ. 순수배양의 정의순수 배양이라 함은 다른 종류의 미생물이 섞여 있지않고, 단일종의 미생물 집단이 있는 상태를 뜻한다. 자연상태로부터 단일 종류의 미생물을 얻기 위해서는 첫째 다른 것으로부터 순수하게 분리하여야 하며, 둘째 순수 분리한 균을 적절한 환경에서 다른 미생물의 오염이 없는 것이 배양하는 두 단계의 과정을 거쳐야 한다.목적으로 하는 미생물을 순수배양하려면 용기에 들어 있는 배지를 무균상태로 만들고 접종(이식)할 때 잡균이 오염되지 않도록 하기 위해서 세심한 주의가 필요하다.ⅱ. 액체배양법(Liquid culture)생태와 생리의 관찰, 발효생산 화합물의 분석 및 미생물 균체의 다량수확을 목적으로 할 때에 액체배양을 하는 데에는 4가지 방법이 존재한다.(가) 정치 배양법(Static culture, 시험관내 액체배양법)시험관에 멸균된 액체배지를 10ml 정도 넣고 한 백금이의 미생물을 이식하여 적온의 배양기에서 배양한다. 이 방법으로 증식의 유무, 균개, 피막, 침전물 형성의 유무, 가스발생, 생산물검출반응, 배양액 혼탁도 등을 관찰한다.(나) 액체내 통기배양법(Aerated culture)산화발효를 시킬 때, 산화세균, 효모 등의 균체를 다량으로 수확할 목적으로 배양할 때에 통기배양법을 쓴다. 간단히 통기배양을 할 때에는 면여관(솜을 넣어 멸균한 유리관)을 써서 흡인(수류펌프, 진공펌프) 또는 압입(콤프레서)하여 공기를 무균공기로 하여 배양액을 통과시킨다.(다) 진탕배양법(Shaking culture)각종 배양병에 배지를 넣고 (500ml의 배양병에 배양액은 150~200ml가 적당하다)배양기에 설치된 진탕기에 얹어 배양한다. 주의할 점은 진탕 중 면전에 배지가 묻으면 오염의 원인이 되므로 묻지 않도록 하여야 한다. 또 면전을 너무 단단하게 하면 안되고 접종량을 다량으로 배지표면은 물론 배지 속에도 집락이 형성되며 역시 집락의 성상은 독립된 집락이 많은 곳일수록 특이적으로 나타난다. 일반적으로 배지 속에 자라는 집락은 표면집락에 비하여 작고 입체적인 특징이 있다. 절대 호기성 세균은 배지 속에서는 집락형성을 하지 않는다.여러 가지 표면 도말분리접종법육안으로 관찰한 세균집락의 다양한 모습. 위에서 관찰하면 집락의 전체적인 모습과 가장자리 형태를 관찰할 수 있고 집락의 돌출정도나 돌출양상은 측면에서 관찰집락을 SEM(주사전자현미경)으로 관찰한 모습(a)Micrococcus(x31,000) (b)Clostridium(x12,000)(c)Mycoplasma pneumoniae(x26,000) (d)Escherichia coli(x14,000)ⅴ. 고체평판배지를 사용하는 미생물의 순수 분리 방법① 도말평판법(streak plate method) : 획선평판법, 멸균된 백금이에 분리하고자 하는 미생물의 시료를 묻혀 고체배지의 한쪽에서부터 시작하여 점진적으로 도말* 도말하는 방법: 한쪽에서 점진적으로 도말 → 접종군이 차츰 희석 → 마지막 도말부위:한 개의 세포② 주입평판법(pour plate method) : 혼합평판법, 시료를 연속적으로 희석한 후 시료의 일부를 액상의 고체배지에 섞은 다음 평판접시에 함께 부어 고화시킨 뒤 배양* 배지표면 뿐만 아니라 내부에도 집락 생성③ 표면도말법(spread plate method) : 미생물이 함유된 한 방울의 현탁액을 고체배지 위에 멸균된 유리막대로 펼치는 방법이다. 집락이 충분히 분리되어 성장하기 위해 현탁액을 미리 희석한다. 배양 후 분리 된 집락을 새로운 배지에 접종하면 순수성을 확실히 할 수 있다.ⅵ. 배지배지는 외관상의 성질에 따라 액체배지(liquid medum)와 고체배지(solid medum)로 분류한다. 액체배지는 미생물의 생리화학적인 연구 또는 대량 배양에 사용하며, 고체로 된 한천배지는 미생물의 순수분리, 보존, 배양 등의 목적으로 사용한다. 액체배지를 고체배지로 만들 경우는균과 방선균은 중성 내지 약알칼리성(pH 7.0~8.0)에서 잘 생육한다. 이러한 점을 고려하여 만든 배지가 목적하는 pH에 근접하지 않을 경우에는 산 또는 알칼리를 가하여 조절하면 된다. 배지를 살균하는 과정에서 화학반응이 일어나 조절한 pH가 변할 수도 있으니 주의를 기울여야 한다.ⅶ. 그람염색1884년 덴마크 의사 H. C. J. 그람이 고안한 특수 염색법으로, 이때 자주색으로 염색되는 세균을 그람양성균, 붉은색으로 염색되는 세균을 그람음성균이라고 한다.-그람양성과 음성균의 분류Gram positive이랑 Gram negative의 차이점은 펩티도클리칸(peptidoglycan)에 있다.그람양성균의 세포벽은 여러 층의 펩티도글리칸층이 두껍게 감싸고 있는데 세포벽의 약 80-90%가 펩티도글리칸이다. 그런 반면에 그람음성균의 세포벽은 펩티도글리칸층이 한 겹으로 매우 얇으며, 이층 외부에는 인지질, 리포폴리사카라이드, 리포프로테인 등으로 구성된 외막(outer membrane)이 감싸고 있는 형태로 세포벽이 이루어져있다. 세포벽의 10-20%만이 펩티도글리칸이다. 세균의 세포벽은 크기와 형태를 유지하게 하며 또한 삼투압에 의한 세포 파열을 방지하는 역할을 한다. 세균을 도말, 건조, 고정 한 후 알칼리성의 pararosanilin 계 색소 (crystal violet, gentian violet 등) 로 염색한 다음, Lugol's soln. 이나 picric acid 와 같은 약산화 촉매로 처리하고 중성의 탈색액 (95% 이상의 ethanol 또는 aectone)으로 탈색할 경우, 쉽게 탈색되는 균 (Gram negative)과 탈색되기 어려운 균 (Gram positive)으로 나뉜다.-Gram 염색의 원리Gram 염색의 원리의 핵심은 peptidoglycan이다. 염색과정은 위에 나오는 것 처럼 알칼리성의 pararosanilin 계 색소 (crystal violet, gentian violet 등) 로 염색한 다음, Lugol's soln. 이나 pi폐렴쌍구균을 흰쥐에 접종하는 방법인데 동물체를 배지로 이용하는 방법이다.-사면 배양법(Slant culture): 사면배지에 분리한 미생물을 백금선을 이용해 한천표면의 아래서부터 위로 선을 긋는다. 이 때 한천표면에 구멍이 나거나 찢어 지지않게 주의한다. 배양기속에 넣어 1~3일이 지나면 집락이 발생한다.? 사면배양법사면배지의 집락- 천자배양법: 혐기성미생물의 보존에도 많이 사용된다. 균을 백금선에 채취한 후 이것을 응고한 한천배지의 위에서 아래로 수직으로 찌른 후 가만히 빼서 적온의 배양기에 넣는다. 가스를 발생하면 구열이 생기고 젤라틴을 사용하여 균의 용해성의 유무를 조사한다.천자배양의 접종방법 , 천자배양의 여러성상-혐기성세균의 분리 및 배양법혐기성균은 Cytochrome 효소계가 없기 때문에 분자상의 산소를 이용할 수 없다. 따라서 혐기성균의 배양에 필요한 조건은 산소(air)를 제거하는 것이다. Burri 법과 진공배양법이 있다고 한다.ⅸ. 세균의 종류실험에 사용되는 균류만 조사하였다.1. Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis를 위시하여 소화관에 상재하고 있는 구균이다. 혈액한천배지상에서 용혈을 나타내지 않는 것이 많고, 용혈의 상태에 의한 분류로는 γ형에 들어간다. 아급성심내막염이나 요로감염증을 일으키는 일이 있고, 또한 식중독의 원인으로 되는 일이 있다. 열, 담즙, 항생물질에 대하여 강한 저항력을 갖는다. 전에는 streptococcus faecalis라고 불렀다.2. Bacillus subtilis바실루스속에 속하는 대표적인 세균종의 일종. 토양, 건초, 먼지 등 자연계에 널리 분포하는 그람양성간균. 길이 2~3μm, 호기성으로 내생포자를 형성한다. 포자는 열, 방사선, 화학약품에 대하여 강한 내성을 보이며, 오랫동안 휴면 상태를 유지한다. 일찍이 형질전환현상을발견하였으며, 간단한 배지에서 생육할 수 있으므로 분자유전학, 재조합DNA실험 등의 연구에 널리 이용되었다.3. Escherichia coli온혈 미리준비한 culture tube에 넣어둔 TSB액상배지3ml에 접종하고37℃, 200rpm에서 16시간 배양한다. (shaking incubator)- 셋째날① 배양액 1ml을 streaking하고 1ml을 1.5ml micro tube에 넣고 centrifuge(8000rpm, 4℃,3분)하고 10% glycerol로 stock을 만든다.② 다음 실험 시간에 순수배양을 잘 했는지 염색법을 이용하여 현미경 관찰 한다.- Stock 제조 과정그림1. Centrifuge 한 것 그림2. 배양액을 버린 것 그림3. 10% Glycerol 을 넣고현탁한 사진① 균1, 균2, 균3 (균 하나 당 2개씩, 총 6개)를 1ml씩 1.5ml micro tube에 첨가한 것을centrifuge(8000rpm, 4˚C, 5분)한다. (그림1)② Centrifuge한 것을 그림 2와같이 배양액을 버린다.③ 배양액을 버리고 10% glycerol 1ml를 넣고 현탁 시킨다.④ -80℃ deep-freezer(초저온 냉동고)에 보관한다.5. Result실험 종료 후 12시간 경과 후 각 균주별 배지 사진이다.1. 희석배수가10 ^{-8}일 경우Bacillus subtilis Escherichia coliEnterococcus faecalis2. 희석배수가10^-7일 경우Bacillus subtilis Escherichia coliEnterococcus faecalis3. 희석배수가10^-6일 경우Bacillus subtilis Escherichia coliEnterococcus faecalis위에서 보면 우리조의 Bacillus subtilis의 배지가 이상 한 것을 알 수 있다. 자라야 될 Bacillus subtilis가 안자라고 Escherichia coli가 자란 것이다. 그 사실은 밑의 원액 streaking 사진을 보면 알 수 있다.4. 원액 streakingBacillus subtilis Escherichia coliEnterococcus faecalis관찰 되어야

자연과학| 2019.10.07| 14페이지| 2,000원| 조회(642)

분리, E.coli, 그람염색, 배지, 순수분리, 순수배양, 결과, 접종, Bacill..

미리보기

닫기