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PCR & Gel electrophoresis 예비보고서

1.실험제목: PCR & Gel electrophoresis2.실험날짜: 2019년 6월 3일3.실험조원:4.실험내용: PCR은 polymerase chain reaction으로, 알고 있는 일부의 소량의 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 증폭시키는 방법이다. PCR의 한 cycle은 총 세가지 단계로 나뉘는데, 첫번째는 Denaturation이다. 복제 대상 유전자(GOI, gene of interest)가 포함되어 있는 이중 가닥 DNA를 90-95℃에서 가열하여 수소 결합을 끊고, 단일 가닥으로 unzipping 하는 과정이며 Taq DNA 중합 효소를 이용한다. 두번째는 Priming이다. GOI의 3'에 상보적인 20-30 bp 정도의 DNA primer가 template DNA에 붙을 수 있게 온도를 50-65℃로 낮춘다. 마지막으로 extension이다. DNA 중합 효소가 작용하여 primer의 뒤를 이어서 5'에서 3' 방향으로 template DNA에 상보적인 복제 가닥이 합성된다. 온도는 DNA 중합 효소가 최적의 활성을 보이는 구간으로 설정하는데, Taq polymerase의 경우에는 75℃~80℃라고 한다. 보통 25-35의 cycle로 실시하고 표본이 DNA가 아니더라도 적은 양의 mRNA로부터 역전사 하여 특정 cDNA를 cloning할 수도 있으며 돌연변이 여부 검사, 병원성 바이러스나 박테리아 검출, 유전자 footprinting을 하여 병의 진단이나 범죄 수사에 사용된다. 전기영동법은 DNA, RNA, 혹은 proteins의 mixture를 분자량의 크기에 따라 분석, 분리, 정제하는 기술이며 이번에는 PCR을 통해 부분 DNA를 증폭시킨 뒤 이용한다. DNA 겔 전기영동 실험 장치는 시료를 넣을 작은 구멍이 있는 agarose gel 혹은 polyacrylamide gel의 얇은 slab이 있고, 전기장에 놓게 되면 phosphate로 인해 음전하를 띄고 있는 DNA 분자들은 well에서 agarose를 침투하면서 이동된다. (DNA는 (+) 방향으로 움직이기 때문에 well은 (-)극에 존재한다.) agarose는 galactose와 3,6-anhydrogalactose가 서로 교차하며 만들어진 3차원적 그물 구조를 가지므로 거대분자들은 작은 구멍, 그물 구조 사이사이를 빠져나가야 하기 때문에 작은 분자들에 비해 이동속도가 느려진다. 즉, 이동 속도는 분자량 M이 감소함에 따라 증가하며, 이동거리는 D=a-bXlogM으로 표현되어지기도 한다. (a,b는 상수) 또한 Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동하며 DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA, linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다. 사용하는 용액에 대해 살펴보았다. TBE buffer는 agarose gel이 잠겨있는 running buffer로 사용되며 Tris base + boric acid + EDTA로 구성되어있고 bp가 5000이하 일 때 사용한다. 이는 TAE보다 buffering capacity가 더 좋고, high voltage에서 gel이 녹는 것을 방지할 수 있다고 한다. (1000 이상이면 TAE buffer를 사용한다.) DNA가 (-)에서 (+)로 움직이는 동안, Tris base는 cation을 제공하여 반대의 방향으로 움직여 DNA가 더 잘 움직일 수 있게 해준다. Borate는 Tris의 pH가 11이므로 높아진 pH를 낮추어 DNA의 Denaturation을 방지한다. EDTA는 DNase(DNA 분해효소)의 2가 양이온(metal ions (Mg2+))과 결합하여 DNase의 작용을 억제한다. agarose 용액은 천천히 부어서 최대한 기포가 생기지 않도록 하고 기포가 발생한다면 피펫 팁을 이용해 well comb에서 먼 가장자리로 긁어 내 터뜨려야 한다. agarose 젤의 well에 피펫을 이용해 시료를 집어넣는 것을 loading이라고 하는데, 순수한 DNA 시료만 loading 하면 running buffer보다 밀도가 작아서 well 안에 잘 들어가지 않을 수 있기 때문에 DNA loading dye와 시료를 섞어서 주입해야 한다. 그러므로 loading dye는 글리세롤같이 밀도가 큰 고분자 물질을 함유하고 있다. 하지만 너무 무거우면 running 과정(전기장을 걸어주고 band가 나올 때까지의 과정)의 DNA의 이동속도에 비해 느릴 수 있기 때문에 특정 크기의 DNA마다 비슷한 속도로 움직이는 물질을 사용해줘야 한다. 또한 loading dye는 시료를 염색시켜 육안으로 잘 보이지 않는 DNA가 젤 상에서 어디까지 진행했는지 running 중에 확인하게 해준다.DNA ladder(DNA marker)는 DNA 크기 비교 척도로 시료로 사용한 DNA가 대강 몇 bp인지 수치까지 알 수 있도록 해준다. EtBr(Ethidium bromide)은 평면 구조로 인해 DNA의 염기 사이로 끼어들 수 있고 DNA 염기와 결합하면 형광이 20배 증가하여 UV를 통해 DNA의 위치를 알 수 있게 해주는 염색약이다. DNA가 길수록, DNA 농도가 진할수록 많은 EtBr이 끼어들어 더 밝게 빛나게 된다. 염기 사이로 EtBr이 끼어들어간 핵산이 원래의 유전정보를 잘 유지하는 것은 쉽지 않으므로 돌연변이를 일으키는 효과가 큰 mutagen이며 암을 일으키기도 하는 것으로 알려져 있다.5. 참고문헌: David Freifelder, 분자생물학, 아카데미서적, 1989, pp130-137.T.A.Brown, Gene Cloning: second edition, Chapmand and hall, 1990, pp66-74.Kathleen Park Talaro, Barry Chess, Foundations in Microbiology: Basic Principles 10th Edition, McGraw-Hill Education, 2017, pp305-318.

공학/기술| 2019.12.21| 2페이지| 2,000원| 조회(179)

PCR, 예비보고서, gel electrophoresis

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DNA extraction & gDNA 정량 예비보고서

1.실험제목: DNA extraction & gDNA 정량2.실험날짜: 2019년 5월 27일3.실험조원:4.실험내용: 유전체 DNA(genomic DNA,gDNA)란 한 종류의 생물체에 있는 모든 유전체 DNA의 모음이다. DNA를 추출하는 방법에는 여러가지 방법이 있는데, 세포 조직 및 DNA 구조에 따라 추출 방법이 다르다. 단계는 lysis, lots of purification step, washing step, elution step 순서이다. Lysis는 세포로부터 DNA를 분리하기 위해서 DNA가 세포 밖으로 나올 수 있도록 세포벽, 세포막 등을 분해시키는 것이다. 이때 세포막을 파괴할 때에는 단백질이나 RNA이 섞이지 않도록 DNA 만을 분리해야한다. Indirect method는 흙, 물 등에서 추출된 cell의 wall을 lysis하는 것이고, direct method는 흙, 물 안에 있는 cell을 isolation 시키는 것이 어렵기 때문에 그 안에서 cell wall을 lysis하는 것이다. 이번 실험에서 사용하는 powersoil DNA isolation kit는 C1,C2,C3,C4,C5,C6의 미지용액을 사용하여 내용을 알지못하나 비슷한 실험에 필요한 용액들을 찾아보았다. Cell lysis를 위한 용액에는 여러가지가 있는데 대표적으로 chemical method에 해당하는 lysozyme은 peptidoglycan cell wall을 분해시키는 enzyme이고 physical method에 해당하는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 hydrophobic한 cell membrane의 인지질 이중막과 세포막 단백질도 녹인다. 이 외에도 초음파를 이용하는 sonication(너무 강해서 세포벽 뿐만 아니라 내부까지 분해되는 단점), 작은 beed를 넣고 흔들어서 부수는 beed beater, temperature을 이용하는 heating induction이 physical에, 킬레이트(두 자리 이상의 리간드가 중심 금속 원자와 배위 결합 하여 고리 모양을 이룬 착화합물)로서 세포벽에 있는 이온과 유기물들을 제거하여 세포벽 파괴가 용이하도록 하는 EDTA는 chemical에 해당한다. 환경시료에는 이온과 humic acid 같은 (+)를 띄는 물질이 많기 때문에 DNA와 protein에 binding하는 것을 방지하는 역할을 한다. 하지만organic은 EDTA로 완벽하게 제거되기 어렵다고 한다. Purification을 위한 용액은 여러가지가 있는데 Proteinase-K는 대부분의 종류의 단백질 불순물 (protein impurities)를 degradation 하는 enzyme, pH buffer는 DNA가 분해되지 않도록 pH을 조절하는 enzyme, phenol, chloroform은 protein과 lipid에 결합하여 DNA를 separation하는 organic solvent이다. 또한 solid phase extraction은 적정한 농도의 염(Na+)과 높은 pH를 갖는 buffer에 DNA를 넣고 column을 통과시키면 실리카 등을 이용한 고체로 된 membrane filter에 정전기적 인력에 의해 DNA가 결합하게 되고 이때 elution buffer로 물이나 TE buffer(Tris-EDTA buffer, Tris는 pH를 조절하는 pH buffer)를 사용하여 membrane bound filter에 결합되어 있는 DNA만 추출할 수 있다. 중간에 Isopropanol이나 ethanol을 넣는데 DNA는 highly insoluble하기 때문에 남아있는 염들을 씻어내고 DNA 순도를 높여주는 역할을 한다. 추출한 DNA의 정량(quantity) 및 정성(quality) 을 확인하기 위해 agarose gel electrophoresis 또는 ultra-violet (UV)- visible spectrophotometer를 사용한다. Extracted DNA의 purity를 확인하기 위해 absorbance ratios at 260 nm/230 nm (DNA / humic acids) 와 260 nm/280 nm (DNA / protein)를 계산한다. 핵산은 파장이 260㎚일 때, 용질은 230㎚일때, 단백질은 280㎚일 때 가장 높은 흡수량을 보이므로 사용하는 것이다. 이때 비어 램버트 법칙을 이용하여 흡수량(A)= 상수(ε) x 몰농도(c) x 빛 투과길이(l)로 구할 수 있다. 높은 OD 260/230 ratio 일 수록(2 이상) organic matter로 오염되지 않은 pure DNA라는 것이며, 높은 OD 260/280 ratio일 수록(1.7 이상) protein으로 오염되지 않은 pure DNA라는 것이다. pH가 증가하면 280 reading이 감소하고 ionic strength가 증가하면 260와 280가 감소하는데 이때는 같은 비율로 감소하는 것이 아니라 260/280 ratio가 증가하며 Phenol은 264nm에서 높은 흡수량을 보이므로 - 260 reading에 영향을 미친다고 한다. Tris, EDTA 과 같은 다른 buffer는 230nm에서 높은 흡광도를 보이기 때문에 230nm는 buffer contamination를 파악하기 위해 유용한 wavelength이며 마찬가지로 solvents와 antibiotics과 같은 organic contaminants도 이 부근에서 높은 값을 보인다고 한다. 사용하는 nanodrop 기기는 1 μL만 집어넣어도 OD를 측정할 수 있는 기기이므로 샘플의 양이 적을 때 사용한다.6.참고문헌: Peter E. Vandeventer, DNA Adsorption to and Elution from Silica Surfaces: Influence of Amino Acid Buffers, J Phys Chem B, 117(37): 2013, pp10742–10749.최명은 외 7인, Denaturing gradient gel electrophoresis를 이용한 한국의 논 토양 미생물 다양성 분석 방법, vol.56, no.2, 2013, pp95-100.

공학/기술| 2019.12.21| 2페이지| 2,000원| 조회(321)

예비보고서, 환경공학실험, DNA extraction, gDNA 정량

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토양미생물활성측정 예비보고서

1.실험제목: 토양미생물활성측정2.실험날짜: 2019년 5월 20일3.실험조원:4.실험내용: 토양에 함유되어 있는 물의 체적 또는 질량과 건조 토양 체적 또는 질량과의 비율을 토양 함수량(수분량)이라 한다. 토양 입자는 표면에 음의 전하를 띄기 때문에 극성을 지니고 있는 물이 토양입자와의 인력에 의해 토양 입자 주변에 흡착되고 물 분자 층이 형성되어 토양 입자 사이사이의 공극에 물이 채워진다. 함수율이 너무 높으면 식물의 호흡에 필요한 산소가 부족하고, 너무 낮으면 뿌리가 수분을 흡수하기가 어려워진다. 그러므로 토양속의 물의 양은 함수량에 따라 토양의 물리성이 달라진다. 토양함수량 측정방법에는 직접법과 간접법이 있는데 직접법은 함수량을 현장에서 직접 채토를 하여 건조 전후의 무게를 측정하여 구하는 방법으로서 시간과 비용이 많이 소요되므로 현장에서는 측정기구를 이용하여 함수량을 측정하는 간접적인 방법이 많이 이용되지만 실험실에서는 직접적인 방법을 사용한다. 즉, 토양을 105-110도의 건조기 안에서 장시간 건조한뒤 건조 전과 건조 후의 질량 차이를 통해 측정하는 것이며 이때 증발접시는 시료의 두께를 10 mm 이하로 넓게 펼 수 있는 정도로 하부 면적이 넓은 것을 사용하여야 하며 가급적 무게가 적은 것을 사용한다. 수분의 양은 %중량으로 (W2-W3)/(W2-W1) X 100으로 계산될 수 있으며 W1 = 증발접시의 무게(g)이며 W2 = 건조 전의 증발접시와 시료의 무게(g)이고 W3 = 건조 후의 증발접시와 시료의 무게(g)이다. 체적(Vt)을 알면 건조밀도(ρd = ms/Vt)도 구할 수도 있다. 어떤 토양 체적 Vt에 포함되는 액상 체적 Vw의 비율은(체적함수율, 부피기준 수분함량) θv=Vw/Vt=wXρd/ρw로 ρd는 흙의 가비중, ρw는 물의 비중을 의미한다.(질량기준 수분함량 θm도 같은 원리로 구할 수 있다.) 공극률이 크면 수분과 공기를 많이 함유하기 때문에 토양안에 있는 수분의 양은 토양의 공극률(토양의 빈공간/토양 체적)과도 관련이 있을 수 있다. 물질의 분해능과 저농도 유기물의 흡수능을 미생물 활성도 (Microbial Activity)라고 하며 이를 측정할 때는 직접적인 활성도를 측정하지 못하므로 여러가지 간접적인 방법으로 측정하는데, 본 실험은 미생물 효소 활성법을 사용한다. 이때 사용되는 효소는 Acid-phosphatase (APA), Arylsulfatase (ASA), β-glucosidase(BGA), Catalase (CAT), Dehydrogenase (DHA), Fluorescein diacetate hydrolase (FDA), Protease (PRT), Urease (UA)가 있다. APA는 lysosomal enzyme으로 acid pH에서 organic phosphates를 가수분해하므로 활성도를 알 수 있다. ASA는 cerebroside 3-sulfate 를 가수분해하여 cerebroside와 sulfate로 바꾸고, CAT는 H2O2를 H2O와 O2로 가수분해하고, DHA는 유기화합물로부터 산소까지의 호흡계 중의 탈수소반응(생체 내에서 대사물질의 산화) 즉 수소원자와 전자가 제거되는 반응을 촉매하고, FDA는 효소활성도가 높으면 bright yellow-green glow가 생성되는 것을 이용하는 방법이다. 본 실험은 QuantiChrom β-Glucosidase Assay kit를 사용하는데, β-Glucosidase에 의해 가수분해 되면 노란색으로 변하는 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(β-NPG substrate)를 이용하며 이는 405nm에서 최대 흡광도를 보인다. β-Glucosidase는 유기물이 셀룰로스를 가수분해 하여 영양원이나 에너지 원으로 이용할 수 있게 도와주는 역할을 담당하는 효소이며 1,4-glycosidic bond으로 연결되어 있는 두개의 glucose나 glucose-substituted molecules에 대해 절대적인 특이성을 보이는 glucoside 효소이다. 즉, β-glucosidase + pNPβG -> glucose + pNP 와 같은 반응을 보인다. 효소는 기질 특이성이 존재하므로 substrate와 결합해 효소기질복합체(ES)를 형성하고 생성물이 효소와 분리되면 효소는 다시 원상태로 돌아와 다른 substrate에 작용할 수 있는 특징을 가지고 있다. 그러므로 토양 시료에 있는 미생물에 β-Glucosidase 효소가 많으면 substrate와 반응을 많이 한다는 것이므로 반응속도는 효소의 활성도와 비례한다. 효소 반응의 최적 pH는 때에 따라 다른데 대부분 3~7이므로 assay buffer와 phosphate buffer를 사용하여 pH를 조절해야 한다. 또한 subtrate마다 optimal temperature를 참고해야 한다. β-glucosidase activity (U/L)는 β - Glucosidase Activity = (OD20 - OD0) / (ODCALIBRATOR - ODH2O) = ×250 (U/L)이다. 이때 OD20,OD0는 0분 20분일 때 샘플의 OD405nm 이고, ODCALIBRATOR and ODH2O are 20분일 때 Calibrator와 H2O의 OD405nm 값이다. 음수값은 활성도가 없는 것으로 보고 0으로 보정한다.5. 참고문헌: 김수진, Characterization of a New β -Glucosidase Encoded in Metagenome of Non-cultured Soil Microorganisms, 부산대학교 : 미생물학과, 2008, pp2-19.Ray R. Weil, Nyle C. Brady, The Nature and Properties of Soils, Pearson, 2017, pp217-238.이용근 외 5인, 분석화학2 제4판, 희중당, 1992, pp102-105.

공학/기술| 2019.12.21| 3페이지| 2,000원| 조회(233)

환경공학실험, 토양미생물활성측정, 토양미생물활성측정 예비보고서

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미생물 관찰(현미경)과 plate counting 예비보고서

1.실험제목: 미생물 관찰(현미경)과 plate counting2.실험날짜: 2019년 5월 13일3.실험조원:4.실험내용: 미생물 colony를 관찰할 때에는 가시광선을 이용한 광학 현미경을 대부분 사용한다. 광학현미경에는 여러가지 종류가 존재하는데, 첫번째로 실체 현미경은 두 눈으로 표본의 실체적 관찰을 하는 현미경으로 반사광에 의한 조명으로 덮개유리를 얹지 않고 입체적으로 관찰할 수 있으며 총합 배율(대물렌즈와 대안렌즈를 갖추고 있는 복합현미경일 때, 총합 배율은 각 렌즈의 배율을 곱한 것)은 100배 이하이고 resolution (식별되는 물체 위의 2점 사이의 거리 또는 시각)은 μm정도이다. 두번째로 위상차 현미경은 물질을 통과한 빛이 물질의 굴절률의 차이에 의해 위상이 다른 직접광과 회절광으로 분리되고 서로 간섭시켜 명암으로 바꾸어 관찰하는 것이다. 세번째로 미분간섭 현미경은 편광(빛의 전기장의 방향이 일정하게 고정되거나 규칙적으로 바뀌는 빛)을 이용하여 약간 빗나간 두 개의 광선을 간섭시켜 세포 표면과 내부를 입체적으로 관찰할 수 있다. 마지막으로 형광 현미경은 표본에 특유한 친화성이 높은 형광물질을 결합시켜 관찰하는 것이다. 현미경의 렌즈는 대물렌즈의 성능이 중요한데, 이 성능을 개구수(numerical aperture)가 결정하며 개구수가 큰 대물렌즈를 사용하면 resolution이 높아진다고 한다. 또한 1000배 이상의 고배율 렌즈일 경우에는 oil immersion 과정을 거쳐 굴절률을 증가시켜 resolution을 좋게 하는 방법을 사용하기도 한다. 표본을 제조할 시에는 무염색법과 염색법으로 나뉘는데, 무염색은 현탁법, 현적법, 슬라이드 배양법, 고형배지 배양법 등이 있고 염색은 단염색, gram 염색, 편모 염색, 항산성 염색, 격벽 염색, 협막 염색 등이 있다. 본 실험에서는 crystal violet을 이용한 단염색법으로 세포 형태만을 관찰할 때 자주 사용되어진다. crystal violet은 보라색을 띄며 basic dye, positive staining 기법으로 (-)를 띄고 있는 표본에 (+) 염료를 이용하여 cell 내부를 염색시키는 것이다. 한천배지에서 colony의 수를 측정하는 방법은 집락계수법(colony count)라고 하는데 살아있는 균은 colony를 형성한다는 것을 전제로 하므로 배지에 형성된 colony의 수는 살아있는 균의 숫자에 비례한다는 원리를 사용한다. 이때 plate counting(평판 계수법)에는 표면 평판법과 주입 평판법이 있다. 평판도말법은 고체배지 위에 미생물 배양액을 접종하는 반면, 주입평판법은 고체배지와 미생물 배양액을 함께 섞어서 접종한다. 따라서 평판도말법은 고체배지 표면에만 colony가 형성되는 반면, 주입평판법은 고체배지의 표면뿐만 아니라 배지의 내부에서도 colony가 형성되어지게 된다. 장단점이 존재하는데, 평판도말법은 단일 colony를 사용하여 순수분리나 배양 등의 실험을 추가적으로 진행할 수 있다는 장점이 있으나, 접종을 위해 spreader으로 문질러줘야 하기 때문에 미생물 배양액의 수가 많으면 오랜 시간이 필요하다는 단점이 있다. 반면, 주입평판법은 미생물의 배양액을 고체 배지와 함께 섞어서 굳히기 때문에 평판도말법보다 상대적으로 편하고 많은 시간을 소요할 필요가 없다는 장점이 있으나, 대부분의 미생물 집락들이 표면보다는 내부에서 형성되기 때문에 순수분리나 배양 등의 추가적인 실험을 진행하기 곤란하다는 단점이 있다. 또한, 미생물 배양액을 고체배지와 함께 섞이도록 하려면 고체배지가 굳지 않은 상태로 존재해야 하므로 45~50 °C의 온도를 유지한 상태로 함께 접종이 되어 미생물의 종에 따라 열에 의한 손실이 있을 수 있다. 또한 균의 수를 알기 위해서는 Petroff-Hausser counting chamber와 같은 방법으로 현미경을 이용한 직접계수를 구하여 세는 방법도 있지만 영양한천배지에서 생장하여 통계적으로 계수가 가능한 집락의 수는 30~300 colony(집락)이다. 이처럼 시료 내에 미생물의 수가 많을 경우 균의 수가 많을 경우에는 dilution 과정을 거쳐 colony의 수를 세는 것이 더 간편한 방법이다. dilution은 serial dilution 방법을 사용하는데 이는 연속적인 희석을 의미하고 시료를 희석하는 방법은 1/10 희석을 원칙으로 하여 1배, 10배, 100배, 1000배로 희석한다. 즉 균의 수는 colony의 수X희석배수가 되는 것이다. 이때 희석 용액으로는 0.9% NaCl을 사용하는데 균의 채액과 비슷한 염 농도를 가지고 있어 미생물이 최대한 물리화학적인 영향을 받지 않는 조건을 만들어 주는 것이다. 이때 균의 수는 집락형성단위(colony forming unit)로 CFU를 사용하고 단위는 1㎖ 당 생균수이다.5. 참고문헌: Erin R. Sanders, Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods, Journal of visualized experiments : JoVE(63), 2012, pp1-18.정동효, 미생물실험 매뉴얼(세포대량배양과 물질생산), 대광서림, 1989, pp90-97.I. Mytilinaios, Growth curve prediction from optical density data, International Journal of Food Microbiology, Volume 154, Issue 3, 2012, pp 62-85.

공학/기술| 2019.12.21| 2페이지| 2,000원| 조회(168)

현미경, 미생물 관찰, Plate Counting, 미생물 예비보고서

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미생물 배양/생장속도 측정 예비보고서

1.실험제목: 미생물 배양/생장속도 측정2.실험날짜: 2019년 4월 29일3.실험조원:4.실험내용: 미생물을 배지에 접종하고 특정 조건 하에서 증식시키는 과정을 배양(culture)이라고 한다. 특정 조건은 일반적으로 온도, pH, 통기, 배지 조성을 의미하며 배지는 생물 조직을 배양하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 인위적으로 조성해 주는 것을 의미한다. 배지의 성상에 따라 액체배지와 고체배지로 나뉘는데 액체배지는 미생물의 일반적인 생육과 물질의 생산을 목적으로 하는 실험 등에 사용되고 고체배지는 액체배지에 agar를 0.5-2.5% 또는 gelatin을 15-20% 첨가하여 고화시킨 것이다. 고체 배양법에는 여러가지 종류가 있다. 먼저 사면배양은 세균이나 효모를 접종할 때 백금이 또는 백금선으로 사면 배지에 일직선으로 끌어당기거나 전면에 도말하는 방법이다. 곰팡이의 경우는 갈구리 모양의 백금구로 포자 또는 균사의 일부를 긁어내서 사면 위에 부착시켜서 배양한다. 평면배양은 평판배지에 세균이나 효모를 적당하게 도말하는 것이고 곰팡이와 같은 경우에는 plate를 뒤집어서 아래에서 살며시 한점을 접종하고 뒤집어서 배양한다. 천자배양은 통성혐기성 세균의 보존에 사용되는데 고층배지에 백금선을 이용하여 배양하고 가스를 발생하는 균은 균열을 일으키기도 한다. 배양을 통해 접종 당시에는 보이지 않던 미생물들이 성장, 번식하여 colony를 형성하여 macroscopic하게 관찰할 수 있게 된다. 미생물을 액체배지에서 배양할 때에는 일반적으로 회분배양(batch culture)이나 closed system을 이용하는데, 회분배양이란 일정한 양의 배지가 담긴 닫힌 배양기에서 미생물을 접종하고 중간에 새로운 배지를 첨가하거나 빼지 않고 배양하는 방법을 의미한다. 따라서 이런 방법은 배지의 양을 한정하여 세포를 생장시키는 것으로서 pH, 온도, 용존 산소 농도만 조절하는 것으로, 배지의 필요영양소가 생장하는 세포에 의해 완전히 흡수 이용되어 고갈되면 생장이 중지된다. 이 때, 미생물의 생장과정을 배양시간은 x축으로, 균의 수에 로그를 취한 값은 y축으로 하여 그래프로 그리면 생장곡선(growth curve)이 얻어지게 된다. 생장곡선은 네 시기를 갖는데, 유도기(lag phase), 대수증식기(logarithmic/exponential phase), 정지기(stationary phase), 사멸기(death phase)가 있다. 유도기는 미생물들이 새로운 환경에 적응하는 시기로 수가 바로 증가하지 않고 필요한 전구물질이나 효소를 합성하는 단계이다. 대수 증식기는 이미 새로운 환경에 적응한 상태로 빠르게 높은 속도로 분열 증식하며 세포수가 증가하는 속도와 전체 세포 질량이 증가하는 속도가 같은 균형생장(balanced growth)을 하는 것을 의미한다. 또한 미생물의 수와 질량이 지수적으로 증가하여 log scale의 y축 그래프에서는 생장곡선이 거의 직선으로 나타나진다. 이때 specific growth rate(비증식속도)는 세포 단위 질량당 시간당 증식하는 세포량이며 미생물의 생장속도를 의미하고 식은 μ = (1/X)∙(dx/dt) 이며 X는 미생물의 농도(g/l), t는 시간(h), μ는 비증식속도h-1이다. 비증식속도에 영향을 미치는 요인은 온도, pH, 산소, 영양소, 생산물, 독성물질이 있다. 종류에 따라 저온성, 중온성, 호열성, 호염기성, 호산성, 혐기성, 호기성 미생물이 존재하는 것처럼 미생물의 특성에 따라 요인을 적절히 조절해야한다. 또한 세포의 배가시간 (doubling time, td)은 앞의 식을 응용하여 td = 0.693/μ를 통해 구할 수 있다. (이때 μ는 lnC(t)=lnC(0)+ μt의 그래프를 그려 그 기울기인 μ를 계산할 수 있다.) 정지기는 미생물의 수가 최대로 증가하여 성장이 멈추는 시기로 일부의 세포는 사멸하고 일부의 세포는 분열을 계속하여 평형을 이루거나(net growth가 0이 되어 생장속도와 사멸속도가 같아진다) 한 개 혹은 그 이상의 영양물질이 부족해지는 시기로 불균형성장이 일어나기도 한다. 사멸기는 노폐물의 양이 축적되는 시기이며 미생물의 수가 점점 감소하게 된다. 미생물 농도의 정량은(미생물이 가지고 있는 분자 구조에 ring을 가지고 있는 tyrosin, histidine 같은 아미노산이 600nm의 빛을 흡수하므로) 파장 600nm을 투과하여 나온 혼탁도의 계수를 이용하여 대략적인 값을 알 수 있는데 OD를 측정하는 것은 미생물이 빛을 산란시키는 것을 바탕으로 Spectrophotometer를 이용해 A =εcb처럼 농도에 정비례하여 빛이 산란된 정도를 측정하게 되는 것이다. 일반적으로 OD의 값이 2 이상이면 신뢰할 수 없다고 하므로 희석하여 다시 측정해야한다.5. 참고문헌 : 1. Kathleen Park Talaro, Barry Chess, Foundations in Microbiology: Basic Principles 10th Edition, McGraw-Hill Education, 2017, pp212-219.2. 정동효, 미생물실험 매뉴얼(세포대량배양과 물질생산), 대광서림, 1989, pp15-37.3. I. Mytilinaios, Growth curve prediction from optical density data, International Journal of Food Microbiology, Volume 154, Issue 3, 2012, pp 169-176.

공학/기술| 2019.12.21| 2페이지| 2,000원| 조회(229)

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