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식중독세균 동정실험(유전학적 동정법)

식중독세균 동정실험(유전학적 동정법)1. Introduction중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적 기술로 1983년 생명공학 회사 시터스의 연구원 Kary Mullis에 의해 최초로 고안되었다. 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 기술이며, 전자동기계를 사용할 수 있어 실험과정이 단순하고 증폭에 필요한 시간이 짧아 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물 분류 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 본 실험에서는 PCR을 이용하여 미지의 시료에서 E. coli 동정을 위한 실험을 실습하고자 한다.* 16S ribosomal RNA 의 사용 및 이점16S rRNA는 모든 생물에 존재하는 유전자이며, 따라서 이론적으로 모든 세균 사이의 연관 관계를 밝힐 수 있는 가능성을 가지고 있다는 이점을 통해 특정 관계를 추정하는 잣대로 이용된다(2008. 고관수). 필수적인 부위가 아닌 경우 약간의 돌연변이를 허용하기도 한다.대부분의 생물의 16S rRNA 유전자가 매우 비슷하기 때문에 특히 그중에서 보존된 지역이 있으며 여기에 전혀 모르는 세균도 프라이머를 이용해 디자인 하면 증폭한 후 염기서열을 분석하면 무슨 균인지 판정이 가능하다.16S rRNA 유전자를 비롯한 여러 유전자의 염기서열을 이용하여 미동정 세균을 동정하는 것은 기존의 방법을 보완할 뿐만 아니라 더 정확한 동정을 제시할 수 있다는 점에서 아주 유용하다. 또한 배양하기 힘든 세균이나 배양할 수 없는 세균에 대해서도 동정이 가능하다는 면에서 더 많이 활용될 수 있을 것이다. 그리고 이를 통하여 기존에 밝혀지지 않았던 병원균이 발견되는 등 많은 성과가 있어왔고, 앞으로도 그러한 성과가 증가할 것이라 예상한다(2008. 고관수).* PCR빠르고 자동화된 기계로 특정 DNA 서열을 증폭시켜 무슨 균인지 파악하는 기계이다. 이점으로는 간편하고, 빠르며 예민하기에 균 재현성, NA polymerase라 해도 활성을 잃게 되므로 주의가 필요하다.(2) Primer의 Annealing : 한 가닥 변성 DNA와 primer를 공존시킨 후 온도를 낮추면 두 종류의 primer가 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 시간은 때때로 다르지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다.(3) 신장반응(Extension) : 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 변한다. 최근 primer의 annealing 단계, 신장반응 단계를 동일한 온도에서 하는 shuttle PCR도 실행되고 있다. 장점은 반응시간을 단축하고 고온에서 annealing하기 때문에 높은 특이성인 PCR을 기대할 수있다는 것이다. 72℃에서 주로 처리한다.(4) Cycle 수 : PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA polymerase의 실활 및 증폭단편의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족, ② 증폭단편간의 annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합하기 때문에 ③phosphate의 축적 때문이라 볼 수 있다.2. The objectives of this study① 식중독세균의 분자유전학적 동정법 PCR의 기본 원리를 이해한다.② 장출혈성대장균의 16S rRNA와 병원성 인자(virulence factor)를 이용하여 동정하는 실험법을 실습한다.* virulence factorVIrulence factor은 미생물의 병원성에 기여하는 병원균에 의해 생산되며, virulence 특징을 가진다. 그러므로 virulence genes의 존재는 식중독의 잠재적인 위험균 이다. 예시로는 오늘 분석할 EHEC가 있다.- 장출혈성 대장균(Enterohemor O-157은 생물학적 변이를 일으킨 병원성 세균으로 베로톡신 등 치명적인 독소를 지니고 있기에 동정함으로써 파악하여 본다.3. Materials and methods(1) Materials● 실험복, latex glove, 위생장갑● 시료: 시료 A-E● 기구: Pipette 1000P, 100 or 200P, 10P, 멸균 pipette tip, hazard bag, 알코올 램프, 멸균 EP tube, Ice + Ice box, 70% 알코올분무기● 시약: 멸균 3차 증류수, Taq polymerase, PCR buffer, dNTP, primer mixture, agarose, 1X TAE buffer, DNA ladder, RedSafe™(Nucleic Acid Staining Solution)* PCR buffer : 복제될 DNA 시편이다.* dNTP : A, G, T, C의 염기입니다. Taq polymerase에 의해 이 염기들이 하나씩 하나씩 붙으면서 DNA template가 복제가 되는 것이다.* Primer stock : PCR 하기위해서 처음에 Primer 로부터 DNA가 복제가 되는 시약이다.* Template DNA : 복제될 DNA 시편이다. 또한 가장 마지막에 넣어주어야 하는 시약이다.* Taq polymerase는 DNA를 합성하는 효소이며, 이 효소가 가장 활성을 좋게 한다. 다시말해, 고온에서도 변성이 되지 않아, PCR이 작동되도록 하는 가장 중요한 인자이며 PCR을 위해 꼭 필요한 시약이다.* D.W : composition을 조정하기 위해 넣는 시약이다.● 기기: Water bath, PCR machine, 전기영동기, Gel-Doc 기기* Agarose gel Electrophoresis : agarose matrix의 단백질이나 DNA 의 population을 분리하는 기계이다. DNA 혹은 RNA 는 길이에 의해 분리되고, 단백질은 charge 나 size에 의해 분리된다.* Agarose gel Electropho 있다.- 위에 만들어 놓은 gel 이 굳었는지 확인한다. gel 이 완전히 굳지 않은 상태에서 전기영동을 하면 band 의 분리가 잘 되지 않으므로 주의한다.(2) Methods1) Template DNA와 agarose gel 준비① 분리균주의 single colony를 멸균 3차 증류수 50 μl에 현탁한 후 95℃, 10-30분간 가열한다.② 세포를 완전히 파쇄하여 ice 위에서 1분 이상 냉각한 후 13,000 rpm에서 15분간 원심분리한다.③ 상층으로부터 DNA를 회수하여 template DNA로 사용한다.- DNA extraction 과정이다. 동정을 원하는 균체로 부터 DNA를 추출한다.④ 삼각플라스크에 agarose 1.5 g과 TAE buffer 100 ml을 잘 섞어 (1.5% agarose gel 제조) 전자레인지에 2분 가열한 후 RedSafe를 5 μl를 첨가하여 잘 흔들어 준 후 tray에 붇는다.2) PCR 반응① PCR tube에 샘플 번호를 표기한 후 아이스박스 안에 든 얼음 안에 tube를 꽂은 채 다음 표와 같이 각 요소를 분주한다.- 튜브를 아이스박스 안에 든 얼음 안에 꽂는 이유는 시료자체가 온도에 민감하기 때문이다. 즉, 대사반응이 활성화 되지 않도록 온도를 낮춰 차갑게 유지하기 위함이다.- 본 실험에서는 연습용으로 sample loading을 한 후 정확한 결과값을 위해 박사님께서 미리 진행하신 것으로 대체하였다.- loading 에 들어가는 공간은 작지만, 염료의 밀도가 gel의 밀도보다 크기 때문에 염료가 주위로 분산되지 않으며 많은 힘을 들이지 않고도 염료가 잘 가라앉게 된다.이때 본 실험에 사용한 primer의 sequence와 size는 다음과 같다.② PCR machine에 다음 표와 같이 프로그램을 입력한다.③ PCR machine을 작동시킨 후 block의 온도가 70℃ 이상이 되면 신속히 tube 삽입 후 반응을 진행한다.3) 전기영동① 굳은 gel에 DNA lader와 PCR 산물 5 μl를 각각 이며 다음으로 밝은 것은 1,000 bp 이다.- 위의 DNA size marker(radder)를 분석해보면, dna marker, negative control, a, b, c, dna marker, negative control, a, b, c, dna marker 순으로 되어있다. negative control은 sample을 넣은 lane보다 덜 되거나 band가 뜨지 않는 것이 맞다.- Control (negative control) 이란, 반응액에서 template만 제외한 것이다. 이것이 증폭된다면, 시약에 DNA가 오염되었을 가능성이 있기에 Aerosol 방지 filter를 부착한 tip을 사용, 기구를 세척하는 등 다양한 방법으로 해결해야 한다.- DNA size marker을 사이에 두고 왼쪽줄은 독소생성에 관한 PCR 이고, 오른쪽줄은 E.coli에 대한 PCR이다.- DNA size marker 보면서 a, b, c 가 몇 bp를 가지는지 찾아내는 것이다. 오른쪽 독소생성 PCR을 확인해보면 stx1(150bp) 에는 a와 c만 있고 stx2(584bp)는 a와 b에만 있다. 하지만, stx2(584bp)는 c에서도 옅게 보이는데 이는 더 고찰해 보아야 한다고 생각한다.- 오른쪽 독소 생성 부분에 stx2(584bp)는 a와 b의 band가 진하게 형성되어 있는데 이것은 많은 독소생성에 의하여 진해진 것이라 추정한다. 시료 C의 stx2 부분의 색상이 연한 것을 보니 시료 내의 독소가 매우 적다고 판단된다.- 베로독소 생성균인 stx1, stx2는 염기서열에 따라 독소를 나눈 것이다. 차이에 대해 더 고찰해보아야 한다.* EHEC의 혈청형에는 O157 이외에도 여러가지 혈청형이 알려져 있지만, 모든 EHEC 균주가 독성이 강한 시가 독소를 생산하는 것은 아니기 때문에 균의 시가 독소 생산 여부를 검사해야 한다. 또한 시가 독소를 생산하는 대장균에서도 Stx1만을 생산하는 것과 Stx2만을 생산하는 것 그리고 모두를 동시에 생산하는 것으로.

자연과학| 2019.12.28| 8페이지| 3,000원| 조회(313)

미생물, 식품미생물, 식품위생, 동정실험, 식중독세균 동정실험(유전학적 동정법)

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