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[생화학실험] 황산암모늄 침전법을 이용한 단백질 염석 실험 보고서

[Introduction]목적: 단백질 용해도에 미치는 염의 영향을 이해하고, 용해도 변화를 통한 단백질 분획 방법을 실습 후 그 원리를 이해한다.이론: 수용액의 염 농도가 일정 수준을 초과해 계속 증가하면, 염으로..

리포트| 2022.02.28| 3페이지| 1,500원| 조회(1,030)

보고서, Report, 생화학실험, 생화학실험보고서, 단백질염석, 황산암모늄 침전법

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[생화학실험] 젤 거름 크로마토그래피

[Introduction]목적: 젤 거름 크로마토그래피의 원리를 이해하고, 젤 거름 크로마토그래피를 이용한 단백질의 분리 방법을 습득한 뒤 단백질 크기 결정 방법을 학습한다.이론: 젤 거름 크로마토그래피란 시료물질을 크기 차이에 의해 분리하는 크로마토그래피이다. 이때 정지상은 gel bead(일정 크기의 pore를 가진 비활성 입자)가 된다. Gel bed volume은 packing된 전체 부피를 일컫는다. void volume은 gel bed volume에서 gel bead가 차지하는 부피를 제외한 틈새 부피를 말한다. 용출부피(Elution volume)은 전체부피(V)-void volume(V0)을 나타낸 값이다. 물질의 크기가 pore size보다 큰 경우 더 빨리 용출되며, 큰 물질 중에서는 무게가 더 무거운 물질이 더 빨리 용출된다. Exclusion limit는 Gel에 의해 배제되는 시료물질의 최소 분자량을 의미하며, Fraction range는 분리 가능한 시료 물질의 분자량 범위를 나타내는데, F.r.의 가장 큰 값이 곧 Exclusion limit가 된다. Gel material은 반응성과 전하가 없어야 하며, 균일한 입자와 pore size를 갖고, 단단해야 한다는 조건을 갖고 있다. Dextran, Agarose, Acrylamide, Combined acrylamide-agarose 등 다양한 종류가 존재하고 있다.[Materials & Methods]재료: Column, Column Reservoir, Stopcock valve, Sephacryl S-200, 50mM Sodium Phosphate, Buffer, Parafilm, Blue Dextran & Cytochrome C.방법)1. 빈 Column에 Buffer를 조심스럽게 붓고 일부 흐르게 하여 컬럼 지지체에 남아있는 공기를 제거한 뒤 배출구 valve를 잠근다.2. DW에 녹아있는 Sephacryl S-200(Gel bead)을 잘 흔들어 슬러리(Slurry)를 만든 뒤 스패츌러에 대고 조심스럽게 붓는다. 여분의 슬러리는 컬럼 상단에 확장 용기(Reservoir)를 연결하여 붓는다.-Gel이 20cm까지 packing될 수 있도록 넣어야 할 양을 계산한다.-DW의 부피까지 고려하여 슬러리는 계산한 양의 2배만큼 넣는다.3. valve를 닫은 상태에서 20분간 중력에 의해 Gel이 packing 될 수 있도록 기다린다.4. 이후 valve를 살짝 열어서 buffer가 조금씩 떨어지게 한다.5. buffer가 gel 상단부까지 내려오면 추가로 buffer를 위에서 계산한 양만큼 넣고 다시 내려올 때까지 기다린다.6. packing이 완료되면 valve를 잠그고 column 상단을 parafilm으로 실링한다.1. 젤이 충전된 Column에 Blue Dextran & Cytochrome C 샘플을 400ul 적재한다.2. 샘플이 젤 내부로 모두 내려가면 버퍼를 소량 적재한다.3. 소량 적재된 버퍼가 젤 내부로 모두 내려가면 이후 충분한 양의 버퍼를 적재한다.4. Elution되는 샘플들을 E-tube로 1ml씩 받고 번호를 매긴다.5. Blue Dextran이 내려올 때까지 포집된 tube는 620nm 파장에서, Cytochrome C가 내려올 때 포집된 tube는 410nm 파장에서 흡광도를 측정하여 그래프를 그린다.[Results]▲ 각 tube에서 도출된 결과로 보아, 5~6 tube에서 Blue Dextran이, 8~9 tube에서 Cytochrome C가 도출됐음을 알 수 있다.▲ 흡광도를 측정하고 이를 바탕으로 그래프를 그린 결과 다음과 같은 그래프를 확인할 수 있었다.[Discussion]1. 컬럼 충전 과정에서, 윗부분이 dry한 상태로 진행하면 crack이 생기면서 벌어지게 될 수 있다. 따라서 buffer를 넣어 마르지 않도록 해주어야 한다. 또한 sample과 bead는 최대한 반응성이 없어야 하는데, 이는 sample에도 전하의 영향을 받지 않게끔 하기 위해서이다. sample을 넣다가 bead가 깨질 수도 있으므로 Gel은 단단해야 한다는 특징이 있다.2. Buffer로 사용한 Sodium Phosphate Buffer는 NaCl이 들어있다. 이 이유는 앞서 sample, bead가 반응성이 없어야 하는 이유와 동일하게, 최대한 ionic interaction을 없애기 위함이다.3. Gel의 소재 중 Dextran은 특히나 Fraction range가 작은 편이다. 이는 pore size를 크게 만들 시 내구도가 약해지기 때문에 불가피하게 작아진 것이다. 이번 실험에서 사용한 Sephacryl S-200의 경우, agarose와 acrylamide, 즉 내구도가 강한 material를 mix함으로써 내구도를 더욱 증가시킨 Gel이다.4. 이론상 크기가 작은 sample이 bead의 pore를 관통하므로 더 늦게 떨어지지만, 작은 sample들도 void vol.에 들어갈 수 있다. 큰 size의 sample도 크기가 애매하면 pore 안에 들어갈 수 있다. 그러나 확률상, 작은 sample이 pore에 들어갈 확률이 더 높고, 크면 클수록 그 확률이 낮기 때문에 chromatography가 가능한 것이다.5. 실제 실험을 진행하던 중 일부 조에서 sample이 사선으로 내려오는 것이 관찰되었다. packing이 잘못되어 균일하게 내려오지 못한 경우로, 이럴 땐 resolution이 잘못될 확률이 높아진다.

자연과학| 2022.06.10| 3페이지| 1,500원| 조회(115)

Chromatography, 보고서, Report, 생화학실험, 생화학실험보고서, 젤거름크로마토그래피

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[생화학실험] 이온 교환 크로마토그래피

[Introduction]목적: Ion-exchange chromatography의 원리를 이해하고, 종류와 선택을 학습하며, Ion-exchange chromatography를 이용한 물질의 분리 방법을 습득한다.이론: Ion-exchange chromatography란, Adsorption chromatography의 일종으로 이온 교환체와 이온성 시료 사이의 electrostatic interaction을 이용하여 물질을 분리하는 방법이다. Ion-exchanger는 전하를 띤 Functional group과 이를 붙잡아줄 matrix로 구성된다. Anion exchanger는 Positive functional group이 결합하는데, (-) charge를 가진 물질을 붙잡는다. Cation exchanger는 Negative functional group이 결합하며, (+) charge를 가진 물질을 붙잡는다. Matrix에는 주로 dextran, agarose, polysaccharide gel, Cellulose, Polystyrene 등이 사용된다. Ion exchanger는 initial stage-Adsorption of target-starting of elution-End of elution-Regeneration 순으로 진행된다. 만일 물질이 단일 전하가 아닐 시, 이러한 생체화합물은 양전하와 음전하를 모두 갖는데, 이 물질들의 net charge는 pH에 따라 변한다. 주로 pH값이 pI값보다 클 경우 Negative net charge를, pH값이 pI값보다 작을 경우 Positive net charge를 갖는다.[Materials & Methods]재료: Column, DEAE-Sepharose, 50mM Tris-Cl buffer(pH 7.5), 5M NaCl, BSA·Cytochrome C, D.W방법)[충전(Packing)]1. 빈 Column에 충분히 inverting한 DEAE-Sepharose 2ml을 조심스럽게 적재한다.2. Column 내부에 buffer가 다 내려가면 initial buffer(50ml Tris-Cl buffer, pH 7.5) 1ml를 흘려주어 평형화시킨다.[적재(Loading)]3. BSA·Cytochrome C sample 0.5ml를 Column에 조심스럽게 적재한다.→이때부터 용출액을 튜브에 모은다. (Tube①: Flow Through)[세척(Washing)]4. Tris buffer 1ml를 Column에 적재하여 Washing하고 이 과정을 두 번 반복한다.→Tube②: Washing 1, Tube③: Washing 25. 0.1M부터 0.5M까지 NaCl이 포함된 buffer 1ml를 Column에 적재하여 단계적으로 용출한다. 각 농도별로 2차례씩 반복한다.④: 0.1M 1차, ⑤: 0.1M 2차, ⑥: 0.2M 1차, ⑦: 0.2M 2차, ⑧: 0.3M 1차, ⑨: 0.3M 2차, ⑩: 0.5M 1차, ⑪: 0.5M 2차1. Column에 1M NaCl이 포함된 buffer를 1ml씩 두 번 흘려주어 resin을 세척한다.2. Tris-Cl buffer를 추가로 넣어준 다음 pipet을 이용해 resin을 회수한다.1. 용집한 11개의 튜브 속 sample들을 Bradford 시약으로 염색한다. (Blank도 제작)2. 큐벳에 염색한 sample을 옮긴 후 O.D.값을 측정하고 Excel로 그래프를 그린다.[Results]▲ Bradford 시약으로 용집한 sample을 염색한 결과,2, 6, 7 tube에서 푸른색으로 변했음을 구분되게 확인할 수 있었다.▲ O.D.값을 측정하고 그래프로 나타낸 결과[Discussion]1. 실험 초반 때 DEAE-Sepharose를 inverting하는 경우, voltexing하지 않는 이유는 voltexing으로 인해 안의 침전물이 깨지거나 손상될 우려가 있기 때문이다. 특히나 Sepharose는 덩어리이기 때문에 옮길 때에도 조심해야 하는데, pipet으로 옮길 때 구멍을 막을 수도 있고 압에 의해 나가면서 깨질 가능성도 있기 때문에 그 끝을 잘라주기도 한다.2. 실험을 진행하면서 내용물이 pipet에 제대로 들어오지 못하고 기포가 들어차는 걸 확인하였는데, 이는 너무 빠르게 진행하려고 해서 끝까지 빨려오지 못한 것이며, 이렇게 진행할 시 안에 물이 들어가서 녹이 슬 확률도 있다. 이러한 요인들은 실험에 오류를 줄 수도 있으므로, pipet으로 옮길 때에는 천천히 정확하게 하도록 주의해야 한다.3. buffer등을 Column 내부에 적재할 시, 위에서 떨어뜨리는 게 아니라 벽면을 타고 돌면서 흘려주어야 한다. 떨어뜨리게 되면 Packing된 것이 파일 수도 있고, 그렇게 되면 용출할 때 균일하지 못하기 때문이다. 뿐만 아니라 공기가 밑에 깔릴 수도 있게 된다. 또한, 줄이 생길 수 있으니 여러 번 나눠 넣는 게 아니라 한번에 다 넣을 수 있도록 해야 한다.4. 용출 때 쓰지도 않지만 1M짜리 NaCl이 포함된 buffer를 만드는 이유는, 모든 실험을 끝내고 resin을 세척해주기 위해서이다. 1M짜리는 그 농도가 매우 높기 때문에 적재하게 되면 붙어있을 자리가 없어 이전에 넣어뒀던 sample 중 남아있던 물질들은 모두 내려가게 된다. 그러한 이유로 고농도의 buffer를 만든 것이다.5. 11개의 튜브를 모두 용집하고 단백질 검출을 확인해보고자 Bradford 시약으로 염색한 결과, 2번, 6번, 7번 튜브에서 단백질이 검출된 것을 확인할 수 있었다. BSA의 pI는 5.3이고 Tris buffer의 pH는 7.5인 것으로 미루어보아, BSA는 Negative net charge를 띠고 있었을 반면, Cytochrome C의 pI는 10이므로 Positive net charge를 띠고 있었을 것이다. DEAE는 anion exchanger이므로 가장 먼저 Cytochrome C가 내려왔을 것이고, BSA는 시간이 조금 흐른 후에야 내려올 것이다. 따라서, 먼저 검출된 2번 튜브에는 Cytochrome C가, 이후에 검출된 6, 7번 튜브에는 BSA가 존재했을 것으로 추론할 수 있다.

자연과학| 2022.06.10| 3페이지| 1,500원| 조회(172)

Chromatography, 보고서, Report, 생화학실험, 이온크로마토그래..

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[생화학실험] 분배 크로마토그래피

[Introduction]목적: 분배 크로마토그래피의 원리를 이해하고 종류와 방법을 학습하며, 분배 크로마토그래피를 이용한 물질의 분리 및 동정 방법을 학습한다.이론: 크로마토그래피란, 시료 물질을 이동상과 정지상에서 분리하고 동정하는 방법이다. 이때 이동상이란 물질이 이동하는 추진력을 주는 액체 또는 기체를 의미하며, 정지상이란 물질의 이동을 저지하는 머무름 효과를 주는 고체 또는 액체이다. 시료 성분을 이루고 있는 물질들은 이동상/정지상과의 친화도에 따라 동하는데, 상대적 이동성 차이에 의해 서로 분리된다. 분리 원리에 따라 분배 크로마토그래피/흡착 크로마토그래피로 나눌 수 있으며, 실험 형태에 따라 평면 크로마토그래피/컬럼 크로마토그래피로 나눌 수 있다. 분배 크로마토그래피는 고정상과 이동상에 대한 분배계수의 차를 이용해 물질을 분리하는 크로마토그래피이다. 종이 크로마토그래피는 Cellulose로 만든 크로마토그래피 종이를 사용하며, Cellulose에 결합된 물 분자가 정지상으로 작용하고 주로 극성 물질 분리에 사용된다. 전개 용매도는 주로 극성용매를 사용한다. 얇은 막 크로마토그래피는 TLC라고도 하며, 유리, 알루미늄 또는 플라스틱 판 위에 가루형태의 지지체로 균일하게 얇은 막을 입힌 판이다. 지지체 선택이 가능하여 극성과 관계없이 다양한 물질의 분리가 가능하고, 종이 크로마토그래피보다 분리능이 좋으며 실험 소요시간이 짧다는 장점이 있다. 시료 검출에는 색소 화합물 고유색/형광물질 자외선 조사/진한 황산, 아이오딘 등 발색시약/Ninhydrin 염색 등이 있다.[Materials & Methods]재료: TLC판, 연필, 아미노산 sample, 70% 1-Propanol, 0.1% Ninhydrin, 비커, 호일방법)1. TLC판 하단 1cm 지점에 연필로 선을 긋고, 점 5개를 찍는다.2. 각 점의 labeling 후 1ul만큼 sample을 loading한다.3. 비커에 70% 1-Propanol을 10~15ml가량 넣고 TLC판을 담근 후 호일로 덮는다.4. 전개액이 TLC판 상단까지 올라오면 꺼낸 후 티슈에 얹어서 말리고, 전개 완료 선을 연필로 표시한다.5. TLC판을 충분히 말린 후 0.1% Ninhydrin 용액에 담가 염색한다.6. 드라이기로 TLC판을 건조시키면서 색을 관찰한다.7. 각 sample별 Rf값을 구한다.[Results]Solvent의 전체 이동거리=4.6Met의 이동거리=2.9, Rf=2.9/4.6=0.63Thr의 이동거리=2.0, Rf=2.0/4.6=0.43Phe의 이동거리=3.2, Rf=3.2/4.6=0.69Pho의 이동거리=1.7, Rf=1.7/4.6=0.37, x의 이동거리=1.7, Rf=0.37따라서 unknown은 Proline과 이동거리가 같으며 발색도 동일하게 노란색으로 나타났으므로 Proline라고 할 수 있다.[Discussion]1. 실험을 진행할 때 TLC판을 손으로 만지지 않도록 주의해야 한다. 이번 실험에서는 아미노산이 중요하므로 손의 단백질이 묻으면 실험에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 또한, TLC판에 글씨를 쓸 때 연필이나 샤프로 써야 하는데, 이는 크로마토그래피를 진행할 때 볼펜을 사용하면 잉크가 같이 올라갈 수 있기 때문이다. 힘을 주어 글씨를 쓰면 TLC판이 파이면서 홈이 생길 수 있다. 따라서 홈이 생겨 제대로 separate되지 않는 경우를 방지하기 위해 최대한 힘을 빼고 쓰도록 유의해야 한다.2. Solvent로 사용하는 propanol은 acetone의 제조원료이므로 플라스틱에 닿을 시 플라스틱이 녹게 되므로 조심해야 한다. 비커에 propanol과 TLC판을 담근 후 호일로 덮는 이유는, propanol이 기화가 잘 되기 때문에 비커가 덮여 있어야 resolution이 잘 일어나기 때문이다. TLC판을 담글 때에는 특히나 벽에 닿지 않도록 해야 한다. 벽에 닿게 되면 판 끝에 solvent들이 위로 타고 올라가면서 옆에서 타고 들어올 수 있으므로 resolution이 제대로 일어나는 데 방해가 될 수 있다.3. TLC판에 점을 찍은 후 sample을 떨어뜨릴 때, resolutiondl 좋게 하려면 조금씩 떨어뜨리고 말리는 걸 반복하는 것이 제일 좋다. 정확성을 높이기 위해서이다.

자연과학| 2022.06.10| 3페이지| 1,500원| 조회(219)

Chromatography, 보고서, Report, 생화학실험, 생화학실험보고서, 분배크로마토그래피

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[생화학실험] 황산암모늄 침전법을 이용한 단백질 염석 실험 보고서

[Introduction]목적: 단백질 용해도에 미치는 염의 영향을 이해하고, 용해도 변화를 통한 단백질 분획 방법을 실습 후 그 원리를 이해한다.이론: 수용액의 염 농도가 일정 수준을 초과해 계속 증가하면, 염으로부터 해리된 이온이 물 분자와 상호작용함으로써 단백질과 상호작용할 수 있는 물 분자가 감소하고, 그 결과 단백질-단백질 상호작용이 물-단백질 상호작용보다 강해져 이로 인한 단백질 간 응집이 발생해 침전이 되는데, 이를 염석이라고 한다. 황산 암모늄은 암모늄 이온과 황산이온으로 이온화되는데, 이들 이온은 높은 염석 활성을 보이나 일반적으로 단백질 구조에는 큰 영향을 미치지 않거나 오히려 안정시키는 것으로 알려져 있으며, 황산 암모늄의 포화용액 밀도는 다른 염에 비해 낮은 편이기 때문에 염석실험에 사용되고 있다.염해란, 수용액에 염을 첨가하면 일정 낮은 농도까지는 단백질 표면의 양전하 또는 음전하 부위 간의 중화시키는 작용을 해 단백질의 응집을 막고 용해도가 증가하는 것을 의미한다. 염석 후 원심분리로 얻게 된 침전물을 적절한 완충액에 녹이면 일정 농도의 황산 암모늄 포화도로 분획한 단백질을 얻게 된다.[Materials & Methods]재료: 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), BSA(2mg/ml), Bradford 시약방법)1. e-tube 4개에 BSA를 1ml씩 넣고, 황산 암모늄 20%, 40%, 60%, 80%라고 각각 적는다.2. 각 e-tube별 농도에 맞게 황산 암모늄을 넣는다. (전자저울, 유산지 사용)[20%: 0.107g, 40%: 0.229g, 60%: 0.366g, 80%: 0.523g]3. 황산 암모늄이 용액에 잘 녹도록 충분히 voltexing 또는 inverting한다.4. 얼음이 든 스티로폼 상자에 4개의 tube를 넣고 30분간 염석 반응을 진행한다.5. 15,000g에서 20분간 원심분리한다.6. 새로운 e-tube를 준비해 각 원심분리된 tube의 상층액만 따서 옮기고, pellet만 남은 tube에는 1ml만큼 buffer를 넣고 resuspension시킨다.→tube 8개 완성(각 황산 암모늄 농도별 상층액 4개, pellet 녹인 용액 4개)1. 새로운 e-tube 9개를 준비하고 DW 780ul씩 넣는다.2. 8개의 tube에는 위에서 준비한 용액들을 각각 20ul씩 넣고, 한 tube에는 BSA 20ul씩 넣는다.3. 9개의 tube에는 Bradford 시약을 200ul씩 넣고 voltexing한 후 색 변화를 관찰한다.[Results]Bradford 염색 결과, BSA에서 가장 진한 푸른색이 나왔고20~60%의 pellet+buffer tube에서는 갈색,20~60%의 supernatant tube에서는 푸른색,80%의 pellet+buffer tube에서는 푸른색,80%의 supernatant tube에서는 갈색이 나왔다.따라서 60~80%의 용해도에서 BSA가 용해됨을 알 수 있다.[Discussion]1. 실험을 진행할 때 e-tube를 만질 시 손이 닿지 않도록 조심해야 한다. 이 실험은 단백질과 관련된 실험이기 때문에, 손에 있던 단백질이 실험에 영향을 줄 수도 있기 때문이다.2. 실험 결과를 확인하기 전 결과에 대해 예상해보았다. BSA를 넣은 e-tube에서는 protein이 가장 많기 때문에 가장 진한 색의 blue가 나올 것이고, 만약 30%에서 용해된다면(그렇다고 가정해 보았을 때) 20% pellet+buffer tube는 갈색이, 20% Supernatant tube에서는 파란색이 나올 것이다. 또한 40% pellet+buffer tube에는 파란색이, 40% supernatant tube에서는 갈색이 나올 것이다. 30%에서 염석반응이 진행되었기 때문이다.그런데 실제 실험 결과, 60%까지는 pellet+buffer tube가 푸른색, supernatant가 갈색이 나왔으나 80%에는 반대로 나왔다. 실제 Bradford 염색 전 원심분리한 tube를 확인했을 때도 80%에서는 육안으로 침전물을 관찰할 수 있었다. 즉, 60~80%, 약 70% 정도의 포화도에서 염석반응이 진행됨을 알 수 있는 성공적인 결과를 도출할 수 있었다.3. 원심분리 시 온도는 4°C정도로, 낮은 온도로 맞추고 진행하였는데, 이는 낮은 온도에서 침전이 더 잘되기 때문에 그렇게 한 것이다. 또한 농도가 각각 달라 무게도 다르기 때문에 아무 tube나 대칭 맞춰 넣으면 안 되고, 농도를 고려하여 넣어야 한다. (이번 실험에서는 4개조였기 때문에 각각 조별로 대칭을 맞춰 넣었다.) 상층액을 따서 옮길 때에는 e-tube가 원심분리기에서 밖으로 회전하기 때문에 pellet이 한 방향으로 쏠리므로, pellet을 아래로 하여 기울인 후 따야 pellet을 건드리지 않고 상층액만 딸 수 있다.

자연과학| 2022.02.28| 3페이지| 1,500원| 조회(1,030)

보고서, Report, 생화학실험, 생화학실험보고서, 단백질염석, 황산암모늄 침전..

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[생화학실험] 단백질 정량 실험 보고서

[Introduction]목표: 단백질 정량의 목적과 다양한 정량법의 원리를 이해하며, 적절한 단백질 정량법을 사용하여 단백질의 양을 측정할 수 있다.이론: 단백질 정량법은 자외부흡수법, 뷰렛정량법, BCA 정량법, Lowry 정량법, Bradford 정량법 등이 있다.1. 자외부흡수법: 특별한 시약의 첨가나, 반응을 위한 배양시간이 필요치 않으며 표준곡선도 필요치 않다.→분광광도계: 분광광도계는 물질이 가진 특이적 흡수 스펙트럼을 기반으로 화합물의 정량분석에 사용된다. 일정 강도를 가진 단일 파장의 빛이 시료를 통과해 검출되는 투과량에 대한 상대적 흡광도를 측정한다.2. Lowry-folin 정량법: Biuret 반응과 Folin-Ciocalteu 반응에 의한 발색의 원리를 이용하여 단백질의 Trp, Tyr의 radical group이 Folin-Ciocalteu 시약 복합체를 환원시키며 색을 변환시킨다.3. Bradford 정량법: 산성조건에서 Coomassie brililiant blue G-250이 단백질의 염기성과 방향족 아미노산의 겹사슬과 결합하여 빨간색에서 파란색을 띠게 된다는 특성을 이용한 것이다.4. Biuret법: 알칼리조건에서 Cu2+과 단백질의 펩티드 질소간의 결합으로 생성된 화합물의 흡광도를 측정한다.5. BCA 정량법: 단백질 용액에 Cu2+을 반응시켜 생성된 Cu+을 Trp, Tyr 또는 Cys의 도움으로 첨가된 BCA와 복합체를 형성하게 함으로써 측정한다.[Materials & Methods]재료: 단백질 sample, BSA 용액, Bradford 시약, Spectrophotometer, 큐벳, 엑셀방법) 1. E.coli 세포에서 뽑은 단백질 sample을 준비하고 spectrophotometer 전원을 미리 켜놓는다.2. E-tube 7개를 준비하여 6개에는 DW 780ul씩 넣고, 1개에는 DW 800ul를 넣는다.3. 표준 곡선 작성을 위해 농도를 아는 BSA용액(50, 100, 200, 400ul/ml)을 DW가 담긴 e-tube에 20ul씩 넣는다.4. 남은 한 tube에는 농도를 알고자 하는 단백질 sample을 20ul씩 넣는다.5. 모든 튜브에 Bradford 시약 200ul씩 넣어서 Total 1000ul를 만들고 voltexing한다.6. Spectrophotometer의 측정 파장을 595nm로 맞춘 후 Blank로 0점을 잡고 나머지 튜브들의 O.D.(optical density)를 측정한다.7. BSA O.D. 값을 가지고 표준 곡선을 만든 다음 단백질 sample의 O.D값을 통해 역으로 농도를 계산한다.[Results]▲ spectrophotometer에 넣기 위해 구분한 큐벳들▲ 단백질의 농도에 따라 가시적으로 차이를 확인할 수 있다.▲ 실험결과를 토대로 만든 추세선(y=0.0077x-0.2595)R²=0.965이므로 신뢰할 만한 표준곡선. 이 표준곡선을 바탕으로 계산해봤을 때,Sonication 농도) x=(0.835+0.2595)/0.0077=142.142857x=142.14, 142.14*10=1421.4. 따라서 농도=1421.4ug/mlF&T 농도) x=(0.344+0.2595)/0.0077=78.376623x=78.38따라서 농도=78.38ug/ml[Discussion]1. Spectrophotometer를 이용한 단백질 정량의 원리는, 특정 파장의 빛을 흡수/반사함으로써 흡광도를 측정해서 단백질량을 측정하는 것이다. 특히나 Phe, Tyr, Trp의 벤젠고리를 갖는 방향족 아미노산의 경우 약 280nm의 파장을 흡수하기 때문에 단백질 정량에 쓰이게 되는데, Trytophan(Trp)-Tyrosine(Tyr)-Phenylalanine(Phe) 순으로 잘 흡수한다.2. 큐벳을 사용할 때에는 만질 때 주의해야 한다. 큐벳 아래층에 투명하고 얇은 쪽으로 빛이 들어오기 때문에(spectrophotometer 사용시에) 그 부분에 지문이 남는 등 흔적이 생기면 흡광도를 측정할 때 문제가 생겨 error가 발생할 수 있다.3. Bradford 시약을 넣었을 때 색이 변하는 이유: Coomassie brililiant blue G-250은 단백질과 결합하면서 최대 흡광 파장이 465nm에서 595nm로 바뀌게 되는데, 이때 파란색으로 색이 변하게 된다. 즉 염색약과 단백질의 결합이 Coomassie blue 염색약의 파란색 형태를 안정시키므로, 이와 비례하는 단백질의 농도를 대략적으로 확인할 수 있다.4. 이전 실험에서 Sonication으로 추출한 E.coli protein의 농도가 너무 높게 나왔는데, 이처럼 농도가 너무 높을 때에는 Dilution을 한 후 O.D.를 측정하면 된다. 그러나 이때 주의해야 할 점은 최종 뷰렛을 1/10 희석해서는 안된다는 점이다. 이렇게 되면 protein 농도뿐만 아니라 Bradford 시약 등도 함께 희석되기 때문에, 희석한 것을 뷰렛에 넣어야 한다. 정리하자면 DW 780, sample 20 → DW 798, sample 2로 sample 자체를 1/10로 희석한 다음 뷰렛에 넣어 진행해야 한다.(희석하였어도 Freezing&Thawing에 비해 높게 나왔다.)

자연과학| 2022.02.28| 3페이지| 1,500원| 조회(335)

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