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A+ 미생물학실험 - 그람염색법

Report미생물학실험: 그람염색법Title그람염색법 (Gram Stain Method)1. Principle(원리) & Theory(이론)그람염색은 세균의 동정 또는 구분에 쓰이는 방법 중 가장 중요한 것의 하나로서, 배양된 세균의 형태학적 관찰을 현미경과 염색액을 이용해서 실시하여 그람양성과 그람음성의 두군으로 세균을 대별시키는 방법이다.그람염색법은 박테리아가 전체적으로 음의 전하를 띄고 있는 점을 이용한 것으로 양의 전하를 지닌 염색약을 처리하면 박테리아 세포막, 세포내로 침투하게 되므로 관찰을 쉽게 할 수 있다는 장점으로 박테리아를 구분하는 지표로서 사용된다.그람염색을 하게 되면 그람양성은 보라색을 띄고 있으며 그람음성은 적색을 띄는 것을 관찰할 수 있다. 과거 미생물학자들이 그람염색을 행할 때 어떤 박테리아는 보라색을 띄었고 어떤 박테리아는 붉은색을 띄자 의문을 가지고 박테리아 구조를 살펴보게 되었다.그람양성균을 관찰한 결과 세포막 바깥쪽에 두껍고 단단한 세포벽을 갖고 있으며 그람음성균은 상대적으로 얇은 세포벽을 가지고 있으며 세포벽 바깥에 또 하나의 지질로 이루어진 이중막을 가지고 있다. 이렇듯 세포벽의 구조가 달라 그람염색 시 다른 색을 가지게 되는 것이다.2. Purpose(목적)그람염색 실험을 통해 어떤 실험과정을 거치고 결과를 얻음으로서 실험하는 박테리아가 그람음성인지 그람양성인지 구분할 수 있는 능력을 기를 수 있다. 그리고 실험 결과에 따라 미생물 실험할 때 어디에서 오염이 되었는지 등등의 잘못된 실험방법을 바로 잡아주며 실험에 대해 심화과정을 거칠 수 있게 한다.그람염색실험 시 염색이 잘 되어 비교적 육안으로 확인하기 쉬운 대장균(Escherichia coli), 비병원성포도상구균(Staphylococcus spp)를 사용하여 실험하게 될 것이며 염색약을 입히게 되면서 왜 그람양성은 보라색을 띄고 그람음성은 붉은색을 띄는지에 대하여 고찰할 수 있게 된다.3. Procedure(실험방법) & Picture(사진)① 실험대 위에 살균액을 뿌린 후 닦아준 후 알코올램프에 점화한 후 마킹해둔 슬라이드 글라스에 집게를 집고 증류수 1방울을 떨어뜨린다.② Escherichia coli를 배양한 시험관 입구와 백금이를 가열멸균한 뒤 채취한 후 증류수1방울에 넓게 펴 바른 후 시험관 입구를 다시 가열멸균 하여 닫는다.③ 넓게 펴 바른 Escherichia coli를 알코올램프 위에서 멸균되지 않게 주의하며 열 건조를 한 후 백금이를 가열멸균 하여 내려놓는다.④ 수평을 유지한 상태로 Crystal violet sol.로 1분간 염색을 한 후 물로 헹군다.⑤ 그 후 Iodine Lugol sol.로 1분간 염색한 후 물로 헹군다.⑥ 그 후 Alcohol decolorizer.로 1분간 탈색 후 물로 헹군다.⑦ 마지막으로 Safranine sol.로 1분간 염색한 후 물로 헹군 뒤 Blotting paper로 물기를 최대한 없앤 뒤 남은 수분은 열 건조 한다.⑧ 슬라이드 글라스에 Immersion oil. 한방울을 넣고 현미경에 놓은 뒤 관찰한다.⑨ 위 실험방식과 동일하게 Staphylococcus spp.를 염색한 후 관찰한다.4. Result(결과) & Discussion(고찰)1) 결과① Escherichia coli(대장균)은 그람염색 후 현미경으로 관찰해보니 붉은색을 띄고 있었다.② Staphylococcus spp(비병원성포도상구균)은 그람염색 후 현미경으로 관찰해보니 보라색을 띄고 있었다.2) 고찰당일 실험 날 교수님께서 22시간 인큐베이터에서 Escherichia coli와 Staphylococcus spp를 사면배지에서 배양해 준비 해주시며 말씀해주신 것이 박테리아 1마리가 10시간 증식했을 때 약 10억 마리가 되며 이렇게 증식하는 것을 기하급수적이다 라고 표현한다고 하셨다. 사람이 병원성 박테리아에 노출된 음식을 섭취하게 되면 왜 질병에 걸릴까에 대한 의문이 풀리게 되었다. 일반적으로 한 마리의 박테리아를 섭취한 것이 아닌 수십억의 박테리아를 섭취하는데 병에 안 걸릴 수가 없지 않은가 생각하게 되었으며 해당 실험을 통해 각각의 모양과 색을 확인해 볼 수 있게 되었다.미생물 실험에서 중요하다고 생각한 것은 아무래도 멸균에 신경 써야 한다. 아직은 실험을 몇 번 못했지만 오염을 방지해야하므로 사용하는 도구들을 멸균해야 된다는 것을 통해 미생물 실험에 대한 멸균에 중요성을 깨닫게 되었다. 졸업하고 난 후에도 미생물실험에 대해 떠올릴 때 오염방지, 멸균에 대해 생각이 될 것이다. 그 중 알코올램프를 켜놓는 이유 중 하나가 시험대 위를 멸균한다고 해도 공기 중에도 박테리아가 존재하므로 대류현상을 일으켜 오염을 방지할 수 있다는 것을 새로 깨닫게 되었으며 굉장히 흥미로웠다.“그람염색이 왜 박테리아를 분류하는 지표가 되었는가?” 하는 의문이 들어 찾아보게 되었다. 대부분의 박테리아는 무색이며 물과 비슷한 밀도를 가지고 있어 현미경으로 관찰할 때 투명하게 나타나 관찰하기 어렵다고 한다. 그래서 미생물학자인 그람이 전체적으로 박테리아는 음의 전하를 띄고 있으며 양의 전하를 띄고 있는 염색약을 사용하면 쉽게 세포로 침투하여 염색이 잘 된다는 것에 초점을 두어 염색법을 고안하게 되었다. 이 염색법을 토대로 그람양성균과 그람음성균으로 나눌 수 있게 되었으며 지표가 되었다는 것을 알게 되었다.그리고 그람 염색을 했을 때 어떤 것은 보라색을 띄고 어떤 것은 붉은색을 띄는 것에서 왜 그럴까 생각이 들었다. 그 이유는 다음과 같았다. 그람양성균은 세포막 바깥쪽에 두껍고 단단한 세포벽을 갖고 있으며 그람음성균은 상대적으로 얇은 세포벽을 가지고 있고 세포벽 바깥에 또 하나의 지질로 이루어진 이중막을 가지고 있어 염색하게 되면 다른 색을 가지게 된다는 것을 알게 되었다. 같은 사람일지라도 DNA에 따라서 모두가 다르다는 것을 떠올리며 세포 내 구조가 생물체의 특성을 결정하는 것이므로 실험을 행할 때 심화적인 생각을 해보는 것을 적용한다면 더욱 좋을 것 같다고 생각했다.

자연과학| 2022.04.21| 5페이지| 1,500원| 조회(601)

그람염색법, 미생물학실험, A+ 과목

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A+ 미생물학실험 세균의 세대기간 측정

Report세균의 세대기간 측정TitleEstimation of Generation time of Bacteria1. Principle(원리) & Theory(이론)이 실험은 미생물의 성장곡선을 알아내기 위한 실험적 기법으로서, 동일한 배지가 담긴 test tube에 조별로 배정된 균을 접종하고 배양시간(총 5시간)에 따라 균수를 측정함으로서 균의 성장속도인 세대시간을 확인한다.미생물의 세대시간이란 한 마리의 미생물이 분열하여 두 개의 미생물로 되는 데 걸리는 시간을 말하며 이 세대시간은 균주와 배지의 성분, 온도 등 생육환경에 따라 달라진다. 미생물의 세대시간은 보통의 세균이라면 20분마다 세대시간이 일어나며 이 때2 ^{n}만큼 늘어나게 된다. 이 것을 기하급수적으로 증식한다고 말한다.만약 최초의 균수를 a라 칭하고 세대 수를 n 균수를 b라고 할 때 이들의 관계를 지켜보면b=`a`` TIMES `2 ^{n}이라고 할 수 있다. 이론적으로는 24시간이 지나게 되면2 ^{72}까지 증식하지만 실제로는 생육 중 영양물질의 소모, 대사산물의 축정 등의 요인들로 증식이 제한받기 때문에 이론적 수치와 실제 수치는 다를 수 있다.2. Purpose(목적)해당 실험을 통해 미생물이 자라는 기간, 즉 세대시간을 확인할 수 있다. 이 것은 식품 속에 존재할 수 있는 미생물이 사람에게 피해를 끼치는 미생물이라고 가정할 때 이 균의 세대기간을 확인함으로서 해당 식품의 섭취가 가능한지를 확인할 수 있게 된다.3. Procedure(실험방법) & Picture(사진)- 실험에 있어서 주의해야 할 것 -* 모든 실험관(test tube)을 다를 때 채취하거나 넣기 전에 입구를 가열 멸균한다.* petri dish에 plate할 때를 제외하고 희석할 때마다 팁을 새 거로 교체하여 사용한다.① 실험대 위에 살균액을 뿌리고 알코올램프를 킨 후 petri dish에 6개에 마킹 해둔다.② 1000ug 설정 된 마이크로 피펫으로 포도상구균에서 1ml를 채취한 후 99ml 희석 멸균액에 넣은 뒤 잘 섞어준다.③ 첫 번째 희석액에서 1ml 채취하여 두 번째 99ml 희석액에 넣어준 뒤 잘 섞어주고 동일하게 한 번 더 희석시켜준다.첫 번째 99ml 희석 멸균액 -> 두 번째 99ml 희석 멸균액 -> 세 번째 99ml 희석 멸균액(10 ^{`-2} ) (10 ^{`-4} ) (10 ^{`-6} )④ 세 번 채취한 멸균액에서 1ml 채취하여 TSB 배지 두 개에 넣어주고 잘 섞어준다.0시간:10 ^{`-1} ,`10 ^{`-2} ,`10 ^{-3} -> 99ml 멸균액에 한번만 희석1시간:10 ^{`-1} ,`10 ^{`-2} ,`10 ^{-3} -> 99ml 멸균액에 한번만 희석3시간:10 ^{`-2} ,`10 ^{`-3} ,`10 ^{-4} -> 99ml 멸균액에 두 번 희석5시간:10 ^{`-3} ,`10 ^{`-4} ,`10 ^{-5} -> 99ml 멸균액에 두 번 희석⑤ TSB배지 두개를 가지고 0시간, 1시간, 3시간, 5시간 마다 6개의 petri dish에 같은 방법으로 희석 배율에 맞춰 배양시켜 24시간 뒤 균수를 측정하여 세대시간을 측정한다.4. Result(결과) & Discussion(고찰)1) 결과* 빈칸은 해당 배율로 측정하지 않았다는 의미희석배율배양시간10 ^{-1}10 ^{-2}10 ^{-3}10 ^{-4}10 ^{-5}0시간 배양5732031시간 배양4100053시간 배양1011105시간 배양2303012) 고찰실험결과를 통해 실험결과가 왜 이렇게 나왔을까 생각이 들었다. 실질적으로 이론상10 ^{-8}만큼 희석된 것이므로 적은 수만 측정되거나 안 되는 것이 당연하지 않을까 생각해보았다. 우리 조의 실험 결과만 놓고 이론상으로 본다면 0시간과 1시간까지의 세대시간의 결과를 설명할 수 있겠지만 3시간 5시간의 세대시간의 결과를 설명하긴 어렵다고 할 수 있다. 그 이유는 일반 세대시간을 20분이라 가정할 때 0시간에서 1시간에 나온 균수의 수가 적은 것을 이해 할 수 있지만 3시간 5시간의 세대시간을 측정하게 되면 못해도 30~300의 균수가 나와야 하는 것이다.또 한 가지는 같은 균으로 측정한 다른 조와 비교했을 때 0시간 배지 한 군데에서 200여 군락이 발견되었지만 그 외에는 측정되지 않았다. 이는 위의 생각을 뒤집는 균수가 측정되었기 때문에 기존에 시작한 TSB배지에 들어있는 포도상구균의 균수가 많이 있다고 생각해 볼 수 있고 반대로 2조의 실험에서 한 배지에만 다른 균의 혼입이 된 것일 수도 있겠다고 추측해볼 수 있을 것이다해당 실험에서 모든 균수가 0이 아니었기 때문에 포도상구균이 배양된 TSB배지가 문제 있는 것은 아니라고 할 수 있으며 미생물이 증식하기 위한 충분한 영양분인 배지와 온도가 잘 맞추어 졌으므로 외부요인에 의한 것임은 아니었다. 따라서 실험 결과를 통해 실험이 잘못되었다는 것을 알 수 있었다. 즉, 교수님이 지시한 실험 방법대로 그대로 했지만 균수가 측정되지 않은 것을 통해 다음 두 가지 요인을 통해 균수가 제대로 측정되지 않았음을 추측하고 있다.① 포도상구균을 채취하는 과정에서 TSB배지를 잘 섞지 않고 채취했다.② 희석을 총 3번시키는 과정이므로 처음 TSB배지에서 충분히 잘 섞고 채취했더라도 두 번, 세 번 희석시킬 때 각각 잘 섞이지 않은 상태로 채취했다10 ^{-6}희석한 것을 두 개의 TSB배지에 넣었다. 그렇다면 위의 두 요인 외에 두 개의 TSB배지를 잘 안 섞고 채취한 것 아니냐고 생각 될 수 있겠지만 0h, 1h, 3h, 5h 채취하기 전 각각 충분히 잘 흔들어 주었기 때문에 요인에서 제외했다.세대시간이란 환경에 따라 달라지기 때문에 절대적인 수치는 아니었지만 일반적으로 보통 미생물은 20분의 세대시간을 가진다고 얘기하기 때문에 미생물이 어디에나 존재한다는 것에 중점을 두어야 한다. 그렇다면 이 실험을 하는 목적은 위에서도 말했지만 식품 속 미생물이 생각보다 많은 량이 존재한다는 것은 이전의 식품 속 미생물 동정실험을 통하여 확인할 수 있었다. 그리고 공기 중에서 미생물의 혼입 또는 한 가지의 식품을 만들기 위해서 여러 재료를 손질할 때 부주의 하여 발생되는 교차오염 등이 발생 될 수 있다. 이처럼 식품의 재료와 조리 후에도 기존에 존재하던 미생물이나 추가적으로 혼입되는 미생물이 있기 때문에 세대시간을 측정한다는 것은 큰 의미가 있는 것이다.왜 그런가 하면 식품 속에 존재하는 미생물이 비병원성 미생물이라면 그 수가 조금 증식한다 하더라도 식품의 신선도 저하를 일으키고 최종적으론 부패를 일으켜 식품에서 악취가 나겠지만 섭취하더라도 큰 문제는 없는 것이다. 반대로 식품 속에 존재하는 미생물이 병원성 미생물이라면 일정 균수 이상이 우리 몸에 들어오게 된다면 문제를 일으킬 수 밖에 없다. 물론 소량의 병원성 미생물이라면 우리 몸에 들어오더라도 위산이나 여러 요인에 의해 사멸되므로 큰 문제가 없다. 하지만 병원성 미생물이 식품에서 여러 세대시간을 거쳐 증식하게 되었고 그 식품을 섭취하게 된다면 병원성 미생물이 발생하는 여러 독소에 의해 여러 장기의 기능에 문제가 생기고 심하게 되면 사망할 수 있게 되는 것이다. 그렇기 때문에 이 실험을 통해서 미생물이자라는 세대시간을 확인함으로서 사람에게 피해를 주지 않을 정도의 세대시간을 계측하여 식품의 섭취 가이드를 얘기해 줄 수 있는 것이다. 미생물의 이해를 통해 가급적 조리 후 4시간 이내에 섭취를 해야 하며 조리할 때 오염되지 않도록 청결에 주의하고 식품 취급에 있어서 올바른 보관을 할 수 있도록 해야 한다고 말이다.

자연과학| 2022.04.21| 5페이지| 1,500원| 조회(251)

미생물학실험, A+ 과목, 세대기간측정실험

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A+ 미생물학실험 최확수법 방법을 이용한 Coliform 계수 - 대장균 분리동정

Report최확수법(Most Probable Number: MPN)방법을 이용한 Coliform계수와 대장균 분리 동정 실험Title최확수법(Most Probable Number: MPN)방법을 이용한 Coliform 계수와 대장균 분리 동정 실험1. Principle(원리) & Theory(이론)Coliform group의 bacteria는 gram-negative, 무포자 형성, 간균으로써 32℃에서 48시간 이내로 배양시켰을 때 lactose를 발효하여 산과 가스를 생산할 수 있는 세균이다. 이 미생물은 Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter 등의 4개의 속으로 구분되며 식품 산업에 있어서 분변물질 오염지표에 대한 지표미생물(Indicator Microorganism)으로 사용된다.대장균군수를 측정하는 방법은 Violet Red Bile Agar에 접종된 후35±1 CENTIGRADE 에서24±2시간 배양시켰을 때 전형적인 dark red colony(적어도 0.5 mm이상)을 계수하는 방법과 Durham tube를 함유한 Lactose broth에서CO _{2}가스 생성수를 계수하여 통계적으로 분석된 최확수표에서 대장균군수를 계수하는 최확수 산출방법이 있다.2. Purpose(목적)해당 실험을 통해 위생 지표군인 대장균군을 분리 동정하는 것으로 두 가지의 방법을 통해 식품이 오염되었는지 확인할 수 있게 된다. 저번 실험에서 VRBA배지를 사용하여 대장균군만 선택하여 배양 후 관찰 했다. 이번 실험에서는 Lactose broth를 사용하여 대장균군의 존재의 유무를 살펴봄으로서 식품의 오염정도를 확인 할 수 있게 된다.- 실험에 있어서 주의해야 할 것 -* 모든 실험관(test tube)을 다를 때 채취하거나 넣기 전에 입구를 가열 멸균한다.3. Procedure(실험방법) & Picture(사진)① 실험대 위에 살균액을 뿌리고 알코올램프를 킨 후 돼지고기를 25g 측정한다.② 측정한 25g 돼지고기와 225ml 희석멸균액을 Stomacher bag에 넣은 뒤 Stomacher한다.③ Stomacher가 끝난 뒤 5ml pipette으로 두 번 채취하여 2배 Lactose broth 5개에 투입한다.④ 1ml pipette으로 1ml를 측정하여 1배 Lactose broth 5개에 투입한다.⑤ 0.1ml pipette으로 0.1ml를 측정하여 1배 Lactose broth 5개에 투입한다.⑤ 35℃ 배양기에 집어넣고 24시간 뒤 확인한다.* 당일 실험은 혼자 진행한 이유로 Lactose broth에 10ml, 1m, 0.1ml투입한 사진은 2조 사진을 인용했다.4. Result(결과) & Discussion(고찰)1) 결과실험결과를 확인해보니 24시간 배양 후 10ml, 1ml, 0.1ml 총 15개의 Lactose broth속 Durham tube에 가스가 포집되어 있는 것이 관찰 되었고, 최확수표를 이용하여 Coliform의 계수를 측정해보면 다음과 같았다.* 최확수표희석배율1010.1100ml/ 균수측정 수55518002) 고찰돼지고기에서 25g, 희석멸균액 225ml 측정하여 Stomacher bag에 넣고 Stomacher시킨 것이므로 이미10 ^{-1}만큼 희석 된 것이다. 따라서 100ml에 18000마리가 있는 것이며 1ml(g)에 180마리가 있는 것이다. 이를 Coliform계수로 나타낸다면1.8` TIMES `10 ^{2} ````ColiformsColiforms/g of pork로 나타낼 수 있다.결과 1: 10ml에서 3개, 1ml에서 5개, 0.1ml에서 2개 측정결과 2: 10ml에서 5개. 1ml에서 4개, 0.1ml에서 3개 측정희석배율1010.1균수측정 수35232* 최확수표 결과 1 * 최확수표 결과 2* 균수는 시료 100ml에 대한 균수의 수를 나타내고 있다.희석배율1010.1균수측정 수543280예를 들어서 두 가지의 경우를 더 해본다면 다음과 같이 나타낼 수 있다.결과 1은10 ^{-1}희석된 100ml속 32마리가 있는 것이므로 100ml당 320마리가 있는 것으로 확인 되며 1ml당 3.2마리가 있는 것으로 측정되었다. 따라서 이 것을 Coliform계수로 나타내면3.2` TIMES `10 ^{0} Coliforms/g of pork로 표시할 수 있다.결과 2는10 ^{-1}희석된 100ml속 280마리가 있는 것이므로 100ml당 2800마리가 있는 것으로 확인 되며 1ml당 28마리가 있는 것으로 측정되었다. 따라서 이 것을 Coliform계수로 나타내면2.8` TIMES `10 ^{1} Coliforms/g of pork로 표시할 수 있다.이 실험 내용을 통해 유추할 수 있는 사실이 두 가지 있다. 첫 번째는 식품에서 채취한 미생물 중에 Lactose를 분해하여 영양분을 얻어 증식하는 균이 존재하고 Durham tube에 무엇인지 모르는 가스가 포집 되어있다고 할 때 Lactose를 분해해서 증식하는 균이 대사산물로 특정한 가스를 발생한다는 것을 유추해 볼 수 있었다.두 번째는 돼지고기에 대장균군이 존재한다는 것을 확인할 수 있었다. 일전에 소고기를 사용하여 평판배양하고 식품 속 미생물을 측정한 결과 1g당7.5 TIMES 10 ^{6}만큼 존재했었다. 실제로 우리가 다루는 식품에서는 상당히 많은 미생물이 존재한다는 것을 다시금 깨닫게 되었으며 그 중에는 대장균군이 포함되어 있다는 것을 알게 되었다.실험 대상은 식품에서 채취한 것이므로 Lactose broth에 처음 들어간 균은 대장균군 외에 많은 균들이 존재하게 된다. 미생물이 성장하기 위해서 필요한 영양분과 환경이 맞추어져야 하는데 일반 세균의 경우는 Lactose를 분해하지 못하기 때문에 에너지를 얻지 못하여 사멸하게 된다. 따라서 Durham tube에 기포가 생긴 Test tube에는 Lactose를 분해할 수 있는 미생물만 양분을 이용해 증식했다는 것을 알 수 있었으며 여러 가지 특징을 통해 대장균군이라고 할 수 있다.위의 내용을 토대로 미생물의 종류와 특성을 제대로 모르는 사람들 중에 한 가지 의문점을 묻는 이들도 있을 것이다. “식품에는 다양한 미생물이 존재한다고 했는데 추정시험이 끝난 배지에서 사면배지로 접종배양 시킬 때 대장균이 아닌 다른 균 중에서도 Lactose를 분해하는 균이 있을지도 모르니까 100% 대장균군이라고 할 수 없지 않겠느냐” 이렇게 물어본다면 다음과 같이 얘기해 줄 수 있을 것이다.첫 번째 실험은 추정실험이라고 하며 해당 과정에서 Lactose를 분해시키고 특정한 가스를 생성하는 미생물을 관찰할 수 있으며 이러한 특징을 가지는 미생물들을 대장균군이라고 부른다. 이 말을 뒷받침 해주기 위한 두 가지 실험이 있는데 대장균군임을 확실하게 지정하기 위해서는 확정시험과 완전시험을 거쳐야만 한다.① 확정시험은 Durham tube에 가스가 포집되어있는 Lactose broth에서 균을 채취하여 사면배지에 접종 배양 시킨 후 EMB 배지에 Streaking하여 24시간 배양하고 지켜볼 때 만약 EMB 배지에 배양된 것이 대장균군이라면 금속성 광택을 가지게 되는 것이다. 금속성 광택을 가지지 않는다면 대장균군이 아닌 것임을 알 수 있다. 따라서 해당 실험을 통해 금속성 광택이 나타났다면 다음 완전시험을 통해 대장균군임을 지정할 수 있는 것이다.② 완전시험은 위 확정시험에서 금속성 광택을 가지는 군락을 채취하여 사면배지에 접종배양 시킨 후 한 번 더 Lactose broth에 넣고 배양한 뒤 반응을 확인하는 것과 일반 배지에 배양시킨 뒤 그람염색을 통해 그람음성균인지 확인하는 과정을 거쳐 비로소 대장균군이라고 특정 지을 수 있게 되는 것이다.위의 과정을 거쳐 이러한 특성을 가지는 균들이 대장균군인 것이 확인되었기 때문에 첫 번째 실험을 가지고도 대장균군일 가능성이 높다고 말할 수 있는 것이다. 그렇다면 대장균군 중에 각각 어떤 종류의 미생물들인지 확인하기 위해서는 다음과 같은 방법을 사용하면 된다.indol test, Voges-Proskauer test, methylred test, cirate test 이 4가지 실험을 통해 어떤 세균인지 구분할 수 있게 된다. 이렇게 식품의 오염정도를 확인하기 위해서는 대상 식품 속에서 대장균군만 측정할 수 있는 VRBA혹은 추정·확정·완전 시험을 통해 알 수 있다는 것을 확인하게 되었다.

자연과학| 2022.04.21| 6페이지| 1,500원| 조회(228)

미생물학실험, 최확수법, A+ 과목, 대장균분리동정실험

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A+ 미생물학실험 표준평판 배양법

Report미생물학실험: 표준평판 배양법Title표준평판배양법 (Standard Plate Count Method)1. Principle(원리) & Theory(이론)표준평판배양법은 식품 중 존재하는 미생물의 수를 측정함으로서 제품의 위생상태를 확인하는 검사방법으로 미생물을 순차적으로 희석시켜 여러 Petri dish에 배양한 후 발생한 군락의 수를 측정함으로서 세균수를 확인하는 방법이다.평판배양법은 독일의 과학자인 코흐가 처음 개발하였으며 이를 통해 미생물을 순수 분리 및 배양할 수 있게 되었으며 그 외 여러 학자에 의해 100여년 밖에 안 되는 기간 동안 미생물학의 진보가 눈부시게 발전하게 되었다. 미생물의 순수 분리가 되었기 때문에 각종 질병을 일으키는 병원성 미생물을 분리 및 배양하여 질병에 대한 문제점의 해결방안과 치료법이 개발되었다.평판배양법에서 중요한 두 가지가 있다. 첫 번째는 모든 실험에서 마찬가지로 잡균의 혼입을 방지해야 하기 때문에 멸균과 오염방지에 유의해야 한다. 두 번째는 배양기에 넣기 전 Petri dish를 뒤집어서 넣어야 한다는 것이다. 그 이유는 미생물들은 저마다 수분활성도를 가지는데 증식에 필요한 수분이 손실될 수 있기 때문에 수분손실을 방지하기 위함과 뚜껑에 맺히는 물방울이 배지에 떨어지게 되면 잡균의 혼입이 생길 수 있으므로 뒤집어서 넣어야 하는 것이다.2. Purpose(목적)표준평판배양법의 연습을 통해 우유에 존재하는 미생물을 분리하고 배양함으로서 우유에 들어있는 미생물이 면적당 균수가 어느 정도 존재하는지 생균수를 통해 계산하는 능력을 키울 수 있다. 연습을 토대로 다른 식품 중에 존재하는 모든 미생물을 각각 분리 및 배양을 통해 어떤 미생물이 존재하는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 금일 실험의 가장 큰 목적 중 하나인 미생물을 분리 및 배양하는 모든 기술을 향상시키기 위함이다.3. Procedure(실험방법) & Picture(사진)① 실험대 위에 살균액을 뿌린 후 닦아준 후 알코올램프에 점화하여 잡균의 오염을 방지한 후 Petri dish 바닥에 희석 배수를 적어두고 두 개 씩 세팅 해둔다.② 1000ug 설정된 마이크로 피펫에 손을 대지 않고 유리 팁을 끼어 넣은 뒤 시유를 열고 채취하여 99ml 멸균액에 넣고 잘 섞어준다.③ 희석 멸균액에서 마이크로 피펫 팁을 교체한 후에 1000ug을 채취 후 2개의 Petri dish에 (10 ^{-2}배 희석)뚜껑을 살짝 열고 넣어준 뒤 바로 닫는다.④ 그 후 마이크로 피펫을 100ug으로 맞춘 뒤 희석 멸균액에서 채취 후 다른 2개의 Petri dish에(10 ^{-3}배 희석) 뚜껑을 살짝 열고 넣어준 뒤 바로 닫는다.⑤ 그 후 시유에서 100ug을 마이크로 피펫으로 채취 후 남은 2개의 Petri dish에(10 ^{-1}배 희석) 뚜껑을 살 짝 열고 넣어준 뒤 바로 닫는다.⑥ 액체 상태의 TSA를 개봉하고 입구를 가열 멸균 시켜 준 뒤 6개의 Petri dish에 충분하게 부어준 뒤 가볍게 좌우로 흔들어 주며 Plating 시킨다.⑦ 잘 섞어준 배지를 상온에서 응고 될 때 까지 기다린 후 6개를 쌓아올려 테이프로 고정 시킨 뒤 뒤집어서 배양기에 집어넣는다.⑧ 배양 후 Petri dish에 있는 Colony 수를 계산한다.4. Result(결과) & Discussion(고찰)1) 결과① 우리 조의 Petri dish에는10 ^{-3}배 희석 배양한 곳 중 한 개에서 1개의 군집만 관찰 되었다.② 생균수 계산식을 이용하지 않고 측정한 균수는10 ^{-3}배 중 1개의 Petri dish에서 1개의 군집만 발견 되었으므로1000`` TIMES `1``=`1000이 나오게 되었다.2) 고찰다음과 같이 실험 결과를 통해 생각해 볼 수 있는 것은 우유에서 희석 배양 했을 때 이렇게 군집이 제대로 측정이 되지 않는 다는 것은 다음과 같다고 볼 수 있다.① 시유로 사용했기 때문에 이미 저온, 고온, 초고온 살균법을 거쳐 유통되는 것이므로 우유 속 미생물의 수가 현저히 작거나 없기 때문에 시유에서 채취한 배지와 그 외 희석시켜 채취한 배지에 증식을 하지 않았다.② 미생물이 증식하기 위한 환경적 요건이 맞지 않았다. 이는 우유에 있는 미생물이 증식할 수 있는 온도와 영양분, 수분 등 여러 요인이 맞지 않아 증식하지 않았다.①의 경우라고 하면 실험하는 우리가 취할 수 있는 방법은 딱히 없는 것 같다고 생각되며 다른 우유를 사용하는 방안으로 할 것 같다. ②의 경우라고 하면 미생물이 자랄 수 있는 영양원(배지), 온도는 충분히 맞추어 졌다고 생각한다. 다만 만약 환경적 요인에 의해서 증식을 하지 못했다고 한다면 보통 세균의 최저수분활성도인 0.90보다 낮아 증식을 하지 못하지 않았나 생각이 되었다.매번 미생물 실험에서 중요하다고 느끼는 것은 무조건 멸균에 신경 써야 한다는 것이다. 몇 번의 실험에 걸쳐 학습한 결과 사용하게 될 모든 기자재와 배지 등등 여러 가지 멸균방법을 거치거나 혹은 멸균된 것을 사용하는 것을 지켜볼 수 있었는데 이는 우리가 미생물을 왜 분리 하는 가와 접합하여 생각해보면 잡균의 혼입방지란 우리가 살면서 숨 쉬는 것처럼 당연하게 이루어져야 하는 것임을 생각하게 되었고 앞으로도 미생물학 실험 = 멸균, 오염방지 이것 하나 만큼은 평생 기억 속에 남을 것 같다.그리고 금일 실험을 통해 우유에서 미생물을 분리해내는 것과 그 이후에 행할 다른 식재료에서 미생물을 분리하는 것을 토대로 알 수 있는 것이 있었다. 우유나 다른 식재료가 상온에서 며칠간 보관하면 왜 부패와 변패가 일어나게 되는 것인지에 대해서였다. 이는 우유 및 다른 식재료에 존재하는 미생물들이 존재하고 각각 길항작용, 공생작용을 통해 식품 속 영양분을 호흡 및 대사에 이용하고 며칠간에 세대시간을 거쳐 기하급수적으로 증식하는 등의 이유 때문이라는 것을 다시 한 번 더 생각하게 되었다.

자연과학| 2022.04.21| 6페이지| 1,500원| 조회(704)

미생물학실험, A+ 과목, 표준평판배양법

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A+ 미생물학실험 빵 곰팡이 관찰, 식품 속 세균의 그람염색 평가A+최고예요

Report빵 곰팡이 관찰, 식품 속 세균의 그람염색Title빵 곰팡이 관찰, 식품 속 세균의 그람염색1. Principle(원리) & Theory(이론)1) 식빵에 번식하는 곰팡이와 방부제의 유무이 것은 방부제에 따라서 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 일반적인 빵집에서는 방부제를 사용하지 않기 때문에 제조과정 속에서 공기 중에 있는 곰팡이가 들어가게 될 것이고 그에 따라 보관을 잘못하게 된다면 곰팡이가 피게 될 것이다. 다른 한 가지 슈퍼나 큰 마켓에서 유통되어 제공되는 빵에는 제조 후 유통되고 판매될 때 까지 시간이 걸리기 때문에 일반적으로 방부제를 사용하게 된다. 그렇기 때문에 균이 자라기가 힘들다. 따라서 실험을 하기위해서는 방부제가 들어가지 않은 빵을 준비해야 한다.2) 식품에서 분리한 세균의 그람염색관찰해당 식품에 존재하는 균을 채취하여 그람 염색을 통해 확인할 수 있게 된다. 그람염색법은 박테리아가 전체적으로 음의 전하를 띄고 있는 점을 이용한 것으로 양의 전하를 지닌 염색약을 처리하면 박테리아 세포막, 세포내로 침투하게 되므로 관찰을 쉽게 할 수 있다는 장점으로 미생물을 구분하는 지표로서 사용된다. 추가적으로 염색의 차이가 나는 이유는 세포막의 구조가 다르기 때문에 다른 색을 가지게 되는 것이다.2. Purpose(목적)1) 식빵에 번식하는 곰팡이의 형태학적 구조를 확인하는 방법식빵에서 존재하는 곰팡이의 구조를 확인하고 균사에 포자가 있는 것을 확인하여 식빵에서 자란 미생물이 세균과 효모가 아닌 곰팡이라는 것을 알 수 있게 된다. 즉 균사에 포자를 형성하는 곰팡이라는 것 이다.2) 식품에서 분리한 세균의 그람염색관찰2번째 실험에서 배운 그람염색법을 통해 지난 실험에서 소고기를 대상으로 하여 채취 후 배양시킨 배지에서 관찰하게 된 것이다. 이 것은 식품 대상 속에 들어있는 미생물이 그람양성균과 그람음성균으로 동정할 수 있게 된다.3. Procedure(실험방법) & Picture(사진)1) 빵과 양파껍질의 곰팡이 관찰① 슬라이드 글라스에 멸균 핀셋으로 곰팡이가 자란 식빵에서 균을 채취한 뒤 현미경 40 배율로 초점을 맞추어 확인한다.② 현미경 100배율로 균사와 포자를 확인한다.③ 마찬가지로 양파 껍질에 곰팡이가 존재하는지 확인하기 위해 똑같이 실험한다.2) 식품에서 분리한 세균의 그람염색① 실험대에 살균액을 뿌리고 알코올램프를 킨 뒤 마킹해둔 스테이드 글라스에 집게를 집고 증류수 1방울을 떨어뜨린다.② 백금이와 총균수 배지 입구를 가열 멸균하여 채취한 뒤 스테이드 글라스에 있는 증류수 1방울에 넓게 펴준 뒤 알코올램프 위에서 왔다 갔다 하며 수분을 증발시켜준다.③ Crystal violet sol -> Iodine Lugol sol -> Alcohol decolorize -> Safranine sol 순서로 스테이드 글라스위에 뿌리고 1분간 염색 후 수세한 뒤 물기를 제거한다.④ 남은 수분은 알코올램프 위에서 열 건조한 뒤 슬라이드 글라스에 Immersion oil 한 방울 떨어뜨리고 현미경에 놓고 관찰한 뒤 VRBA 배지도 똑같은 순서로 실험한다.4. Result(결과) & Discussion(고찰)1) 결과(1) 빵과 양파껍질의 곰팡이 관찰① 빵: 40배율로 보았을 때 덩어리에서 얇은 나뭇가지모양이 보였고 100배율로 보았을 때 가지에 달린 포자가 보였다.② 양파 껍질: 40배율로 보았을 때 한 가닥 나뭇가지모양에 3개의 포자가 달려있는 것이 어렴풋이 보였고 100배율로 보았을 때는 더 선명하게 보였다.(2) 식품에서 분리한 세균의 그람염색① 총균수: 대부분은 빨간색인 그람음성균 중 간균으로 보였고 일부분에 보라색인 그람양성균 중 구균과 간균이 보였다.② VRBA: 모두 빨간색을 띄고 있었으며 그람음성균인 것을 알 수 있었다.2) 고찰금일 2가지 실험 결과를 통해 각각에서 알 수 있는 사실들이 있다. 이는 다음과 같다.① 빵과 양파껍질에서 곰팡이를 확인할 수 있었다. 처음에 빵에 푸른색과 검은색의 오염부위가 있었는데 다른 조들은 푸른색의 일부에서 채취했었고 우리 조는 검은색이면 흑국균 이겠구나 하고 소량만 채취하였으나 측정되지 않았다. 그래서 다시 푸른색에 있는 것을 채취하여 확인한 결과 40배율로 보았을 때 가지가 달려있는 것을 확인할 수 있었고 100배율로 보았을 때 가지에 포자가 발견되었다. 이는 균사를 가지고 있으며 포자를 형성하는 곰팡이 인 것으로 확인 할 수 있었으며 푸른색이라는 점에서 Penicillium속 곰팡이라는 것을 추측할 수 있었다. 따라서 해당 실험 배율은 40배 100배를 이용하여 확인한 것으로 일반 세균이 있었다면 측정되지 않았을 것이라는 것을 알게 되었다.이어서 우리 조는 양파 껍질을 관찰하게 되었는데 찾기가 힘들었는데 교수님께서 도와주신 덕분에 한 가닥의 곰팡이를 확인할 수 있었다. 따라서 양파 껍질에도 일반 세균이 아닌 곰팡이도 자란다는 것을 확인 할 수 있게 되었다. 그리고 ①번의 실험에서 한 가지 의문점이 생겼다. “분명 빵에서 생기는 곰팡이 중 검은색을 띄는 균은 Aspergillus niger일 텐데 왜 관찰이 되지 않았는가?” 에 대한 것이다. 채취할 때 관찰하기 쉽게 매우 소량만 채취했지만 빵의 조직만 관찰되었고 곰팡이의 모습은 보기 힘들었다. 따라서 곰팡이가 핀 부위에 있는 검은색은 흑국균이 아니라는 것이었다. 즉 일반적인 식빵이 아닌 조리하여 만들어진 빵으로 빵 표면이 검게 그을린 위치에 곰팡이가 핀 것이기 때문에 검은색 곰팡이라고 착각하게 된 것이다.② 4번째 실험에서 소고기에서 일반배지와 선택배지에서 배양한 배지를 배양했으며 5번째 실험에서는 그 배양한 배지에서 사면배지로 옮겨 배양했다. 그렇게 사면배지에서 각각 총균수를 배양한 배지와 VRBA 배양한 것에서 채취하여 그람염색을 실시했다. 그 결과로 둘 다 육안으로는 빨간색을 띄고 있었다. 이 것은 세포막이 이중막으로 구성되어 있는 그람음성균이라는 것을 알 수 있었다. 하지만 염색된 세포를 자세히 관찰한 결과 총균수 배지 염색에서 다른 점을 캐치했다. 대부분이 빨간색을 띄고 있었지만 일부분은 보라색을 띈 간균과 구균이 있는 것을 확인 할 수 있었다. 즉, 그람양성 간균과 구균역시 검출되었 다는 의미이다.따라서 6번째 ②번의 실험을 통해 4번째 -> 5번째 -> 6번째 실험을 걸쳐 비로소 큰 사실을 알게 되었다. 이는 4번째 실험에서 소고기에는2.4` TIMES `10 ^{`4} `````CFU```/`1g`````of`````beef인 것을 확인 할 수 있었고 5번째 실험에서 균을 분리 및 배양하는 기술을 향상시키게 된다. 이어서 6번째 실험에서 그람염색을 한 결과 VRBA는 대장균만 자라게 하는 화학적인 물질이 들어간 배지이기 때문에 그람 음성으로 측정될 수밖에 없다. 총균수의 배지는 대부분이 그람음성이었지만 그람 양성균도 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서 소고기에는 1g당 24,000마리의 미생물이 존재하고 그 중에는 대장균포함 그람음성균과 그람양성균이 있다는 것을 알 수 있었다.해당 실험을 통해 현미경을 조작하는 것이 어렵다는 것을 다시 느끼게 되었다. 일전의 다른 실험에서는 해당 실험의 원리와 목표를 확실하게 인지하여 기술을 터득하고 숙련하는 등 점점 나아간다는 것을 느꼈지만 현미경 앞에서는 초라해지는 것을 알게 되었다. 따라서 앞으로 현미경을 사용하는 기술에 대해 좀 더 집중하고 노력해야겠다고 생각했다.

자연과학| 2022.04.21| 6페이지| 1,500원| 조회(366)

그람염색, 미생물학실험, 곰팡이관찰, A+ 과목

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