2020.04.07.신경생물학 실험 EXP.1 Cardiac perfusion, H&E staining1. 실험 목적현미경 관찰을 위해 조직표본을 제작하는 법 중 cardiac perfusion을 배우고, 조직학이나 의학 진단에 사용되는 가장 일반적이고 대표적인 조직 염색 방법인 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색법을 익힌다. 최종적으로 조직 표본에서 쥐의 뇌 구조를 보는 것이 목적이다.2. 실험 과정A. cardiac perfusion-마취한 쥐의 사지를 해부대 위에 고정한다.-피부를 절개한 뒤(개복) 복막을 절개한다.-횡격막을 절개한 뒤(개흉) 갈비뼈 고정한다.-집게로 심장을 고정하고 좌심실에 바늘을 삽입한다.-우심방을 절개한다.-PBS 관류로 혈액을 제거한다.-PFA 관류로 고정한다.(fixation)-목을 절개하고, 두피 및 두개골을 절개한 뒤 뇌를 적출한다.-4% PFA에서 4시간동안 사후고정한다.-30% sucrose in PBS에서 dehydration.B. Embedding, brain section-원형 필름에 OCT compound 붓는다.-mouse brain의 소뇌 끝을 잘라 바닥에 고정할 단면을 만들고 고정한다.-OCT로 chuck과 원형 필름을 고정하고 brain이 잠길 때까지 채워준다.-동결박편기에 chuck을 고정한 뒤 section을 진행한다.C. H&E staining-PBS에 washing ?10min 2번-1% hematoxylin soln.로 염색 -10min-찬 H20로 washing ?10dips 2번-acid EtOH ?5dips-찬 H2O로 washing ?10dips 2번-1% Eosin soln.로 염색 ?5min-찬 H2O로 wahsing ?10dips 2번-Dehydration (70%, 80%, 90%, 95% EtOH에 각 10 dips 후 100% EtOH에 2분)-xylene ?10min-mounting3. 실험 결과-표본 A(x40)(x100)(x200)(x400)-관찰 결과 대체적으로 분홍색으로 염색되었다. 이는 산성 염료인 eosin에 의해 붉게 염색된 세포질과 단백질 등이다.-더 진하게 염색된 부분은 확대해보면 보라색, 또는 푸른색을 띄었다. 이는 염기성 염료인 hematoxylin에 의해 파랗게 염색된 핵, 유전체 등이다.-하얗게 남아있는 부분은 빈 공간으로 보인다.-brain map에서 관찰된 표본과 유사한 층을 찾아 비교해보니 화살표가 표시된(본 레포트에는 빨간 동그라미가 표시됨) 부분은 dentate gyrus granule cell layer인 것으로 보인다. 참고 사진은 아래와 같다.-표본 B(x20)(x100)(x200)(x200)-표본 B는 20배율에서 구겨진 듯한 모양인 것으로 보아 표본의 가장자리인 것으로 추정했다.-200배율에서 층 구조가 관찰되어 brain map에서 가장자리 층 구조를 찾았다.-화살표로 표시된(본 레포트에서는 빨간색 동그라미로 표시됨) 부분은 island of calleja 라고 추정한다. 참고 사진은 아래와 같다.4. 토의-실험 결과에서 찾은 소뇌의 region에 대해 추가 조사해보았다. 먼저 dentate gyrus granule cell layer는 한국어로 치아이랑 분비소포 세포막을 뜻한다. 먼저 치아이람은 대뇌변연계(대뇌피질과 시상하부 사이의 경계에 있다)에 속하는데, 대뇌변연계는 기본적인 생명활동에 관한 본능행동을 주관한다. 예를 들어 섭식행동이 있다. 이 외로도 자율기능의 조절 등을 한다. 그 중에서도 치아이랑은 새로운 기억의 형성에 관여하는 부분이다.
신경생물학실험 레포트 cardiac pefusion H&E staining 결과
