Cis-splicing is needed to decode split eukaryotic genes- 일반적으로 알려진 Splicing은 Cis-splicing → 인트론을 제외하는 것- Trans-splicing은 서로 다른 gene의 exon 조합임The longest human gene dystrophin- 2.5Mb (2.5 million bases), contains 78 introns-99.4% of the full length of the dystrophin gene comprises intron sequences, not used for protein coding-RNA pol2의 속도는 초당 50bp 가량이다 → Splicing 없이 translation 할 경우 하루이상 소요Introns increase eukaryotic gene expression levels인트론은 여러 수준에서 진핵생물 유전자 발현을 향상시킴Introns can have a positive impact on transcriptionIntrons can themselves contain genes(snoRNAs, miRNAs, long ncRNAs)인트론은 단백질 크기와 무관하게 유전자 크기의 유연성을 제공할 수 있음(gene expression timing과 관련) →dystrophin의 예시the levels of mRNAs produced from introncontaining genes are high- mRNA 수준에서 인트론의 중요성이 커짐Introns can positively affect transcription- Splicing Factor- exon junction 부분에 binding하는 factor- RNA Pol이 더 잘 지나가게 하고, RNA Export 관련 Factor들을 끌어들인다- Cytoplasm Export가 잘되어 translation Rate가 향상되도록 한다
12.1 Essential elements of transgenic plant analysis형질전환 식물 확인 방법Antibiotic selectionVisual selection or expression of another reporter gene(s) ~ GFP등 활용GOI analysis: insertion, copy number, expression, Mendelian segregation12.2. Assays for transgenicity, insert copy number, and segregationPolymerase chain reaction: to check transgenic gene or expression of the transgenic gene식물에 존재하지 않는 primer vector를 활용함Forward, reverse primersDenaturation (95℃) -> annealing of primers (55℃) -> extension (72℃)Primer DesignDNA는 5’→3’ 방향으로 합성된다는 것을 고려DNA 이중가닥은 상보적 염기쌍으로 Antiparallel함RT-PCR: reverse transcriptase 이용해 RNA를 DNA로 바꾸어 PCR 반응을 일으키는 것Quantitative PCR: 형질전환된 유전자의 발현을 정량적으로 알아보기 위한 방법Real-time, or quantitative PCR합성 중에 PCR 증폭 생성물을 감지Ct (cycle threshold): 형광 신호가 임계값을 넘는 데 필요한 사이클 수Ct = 17이 Ct = 18 보다 mRNA가 2배 더 많이 발현Internal control: 대부분 발달 단계 및 식물 기관에서 일정하게 발현되는 유전자.예) GAPc, ubiquitin 등등
11.1. Overview of plant transformationTwo main plant transformation methodsAgrobacteriumParticle bombardment: physical methodDNA delivery: Into plant cells (nucleus)Target tissue statusPlant cell with high ability of regenerationHigh totipotency를 가지고 있어야 함 ~ 어리거나 미성숙한 세포Selection and regenerationkanamycin(쌍자엽) and hygromycin(단자엽)herbicide (bar gene)GFP11.2. Agrobacterium tumefaciensBiology of Agrobacterium tumefaciensGram-negative, 쌍떡잎 식물에 감염(dicotyledon plants)Crown gall disease: 옥신과 사이토키닌을 1:1 비율로 분비(callus 만드는 것과유사)Wounding in plants -> chemicals (sugars and phenolic molecules) ->Agrobacterium은 wounding sites에 infection됨 -> Ti (tumorinducing) plasmid의 일부, T-DNA (transfer DNA)가 식물체의 nucleargenome상으로 integrationT-DNAHormone biosynthesis (auxin, cytokinin) -> 무한 분열 유도Biosynthesis of novel plant metabolites (opines, agropines)Opines: 아미노산 유도체Agropines: 당 유도체Agrobacterium에 의해서만 energy/carbon source로 사용될 수있음
The organization of eukaryotic and prokaryotic cellsEukaryote만 mRNA nuclear export가 필요함Major steps in the nuclear export of mRNAmRNA는 nuclear export adaptors로 export를 위한 dressing 과정을 거친다mRNA transcript는 random nuclear diffusion에 의하여 nuclear pore에 도달, 막 통과Disassembly of the export competent mRNPExport receptor는 nucleus와 cytoplasm 사이를 이동함<중 략>Important mRNA nuclear export adaptorsTREX complex는 mRNA export adaptor로 작용한다export adaptor REFRNA helicase UAP56THO complexThe role of SR proteins as RNA export adaptorsSR protein들은 mRNA adaptor protein이다splicing reaction 도중 SR protein의 Phosphate group이 제거됨hypophosphorylated SR protein은 export receptor TAP와 상호작용하여 mRNA complex가 export된다.
Different types of alternative splicingUse of alternative promotersUse of alternative poly(A) sites → alternative exon도 mRNA에 포함시킬 수 있음Alternative splicing patterns can be detected by RT-PCRexon-specific primer를 활용해 alternative Splicing pattern을 연구할 수 있다High-throughput -omic’ approaches developed to study RNA structure오믹스 기반의 접근법RNA seq를 이용해 RNA Composition 확인가능Splicing code comprises binding sites for splicing related proteinsexonic splicing enhancers, ESEsintronic splicing enhancers, ISEsExonic splicing silencers, ESSsintronic splicing silencers, ISSs