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백지의 coumarin성분 분리 실험 결과보고서

1. 실험 제목- 백지로부터 coumarin 성분의 분리2. 실험 목적- 식물 재료의 추출 원리와 방법을 이해한다.- 식물 재료의 총 추출물을 용매극성에 따라 분획하는 원리와 방법을 이해한다.- Column chromatography의 원리와 방법을 익히고, 이를 이용해 천연물로부터 단일 성분을 분리하는 방법을 익힌다.- Coumarin의 NMR spectrum의 특징을 이해한다.3. 실험 재료 및 기구1) 추출- 저울, 백지 300g/컬럼, 믹서기, MeOH 2L, 3L-삼각플라스크, sonicator, 여과기, 거름종이, 감압여과용 funnel, aspirator, 감압농축기, 감압농축용 플라스크2) 분획 & Loading 용 시료준비- ethyl acetate(EA), 2L-separatory funnel, evaporator(감압농축기), 증류수, silica gel(200mesh~), evaporator(감압농축기)3) Open column chromatography- 유리 column, 탈지면 소량, 삼각플라스크(250ml) 20개, 4L-빈 유리병, 유리막대기 Hexane(H), Ethyl acetate(EA), breaker(1L), mass cylinder, 4ml 유리 vial4) NMR을 이용한 구조 분석- NMR tube, NMR용 용매, TLC plate, UV lamp, TLC chamber, 결정여과기, 질소가스, 파스퇴르 피펫, 사진에 NMR기기 사용 신청4. 실험 과정1) 추출① 3L 삼각플라스크에 믹서로 간 백지 300g을 넣고, 100% MeOH 2L를 부은 후 1시간 동안 초음파 추출한 후 30분 뒤다시 1시간 동안 초음파 추출한다.② Over night 시킨 후 다시 1시간 동안 초음파 추출한다.③ 감압 funnel을 사용하여 여과한 후 여과액을 농축 플라스크(빈 무게 측정)에 옮겨 담아 감압농축한 후 무게를 측정한다.2) Ethyl acetate로 분획하기① 백지추출물을 증류수에 현탁하고 분별깔때기에 옮긴다.② EtOAc를 가하고 흔들어 준 후 기포를 빼고 위의 입구를 반쯤 열고 30분 정도 둔다.③ EtOAc층과 물층이 분리되면 2회 반복하여 EtOAc층을 받는다.④ 감압농축한 후 무게를 측정한다.⑤ EtOAc 소량을 가하여 녹인 후 3~5배의 실리카겔을 넣은 후 감압건조하여 실리카겔에 흡착시킨다.※ 감압농축 시 insert부위에 탈지면을 끼워 실리카겔이 evaporator 내부로 들어가지 않도록 한다.※ TLC를 이용해서 백지의 EtOAc분획물 분리조건 찾기3) Column 세우기① Open column에 솜과 용출용매를 소량 넣어 용출구입구를 솜으로 막아 기포를 제거한다.② Loading할 시료양의 20~100배 되는 양(180g)의 silica gel을 준비한다.③ 용출을 시작할 용매(H:E=20:1)에 현탁한다.④ silica gel 현탁액을 column에 붓고 용출용매를 충분히 부어준 후 밤새 안정화하고, 컬럼의 옆면을 고르게 두르려 packing이 잘 되게 한다.4) 시료의 loading 및 용출① 실리카겔에 흡착된 시료를 유발과 유봉을 이용하여 곱게 갈아준다.② A4 용지에 옮겨 담고, A4 용지를 컬럼 윗부분의 안쪽에 두른 후 시료를 컬럼에 붓는다.③ 윗 경계면을 평평하게 해 준 뒤, seasand를 부어준다.④ 용출용매(H:E=20:1)를 부어주고 500ml, 250ml 삼각 플라스크를 이용해서 용출액을 받는다.※ 각 용출액을 감압농축한 후 15ml 시험관에 옮겨 담고 TLC를 실시하여 물질의 분리정도를 평가한다. 같은 패턴을 보이는 분획들을 한 데 모으고 spot이 하나인 분획물을 완전히 감압건조한다.※ 결정이 생성되면 이를 결정여과기로 거른 후 용매를 완전히 건조시킨 후 1H-NMR spectrum을 측정한다.5. 실험 결과 및 고찰- coumarin은 365nm 자외선을 조사했을 때 청색~청자색 또는 황백색의 형광을 나타낸다. 청색의 spot이 관찰되는 15번 25-26번 분획에 백지의 coumarin계 성분이 함유되어 있다고 유추할 수 있다.- Figure 3의 data에서 imperatorin은 Rf0.4부근에서 isoimperatorin은 Rf 0.7부근에서 관찰되므로 Figure 2와 Figure 3의 더 위쪽에서 형광이 관찰되는 15번 분획물에 isoimperatorin성분이 포함되어 있다고 생각했다.- 15번 분획물을 감압건조를 하여 생성된 결정을 결정여과기로 거른 후 NMR tube에 담아 1H-NMR spectrum을 측정한다.- Chloroform-d를 용매로 사용해 NMR을 측정한 결과 교안의 NMR data와 유사한 chemical shift가 관찰되므로 측정 분획물에 백지의 furanocoumarin계 성분인 isoimperatorin이 포함되어 있음을 확인할 수 있다.6. References1) 생약학교수협의회. 생약학∙천연물화학실습서(신일북스). P146-1472) 생약학교재 편찬위원회. 생약학(동명사). P148-1503) 식품의약품안전평가원 생약연구과 자체연구개발과제 보고서(과제번호: 12171한약국415)

의/약학| 2021.04.16| 4페이지| 1,500원| 조회(500)

백지, coumarin, 생약학실습

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생약추출물 Brine Shrimp assay 결과보고서

1. 실험 제목- Brine Shrimp assay2. 실험 목적- 임의의 생약 추출물(꽈리 지하부, 갈퀴나물 전초 등)을 농도별로 brine shrimp(Artemia salina)에 처리하여 LD50값을 구함으로써 생약 추출물의 세포독성(cytotoxicity) 유무를 판단한다.3. 실험 방법1) Brine shrimp 부화① 유리용기에 인공 해수를 담고, brine shrimp egg를 적당량(1spatula) 넣어 준다.② 온도 25℃, 형광등 아래에서 24~48시간 방치하여 부화시킨다.2) 시료의 제조① 10% DMSO를 사용하여 추출물시료를 녹인다. (시작농도: 20mg/ml)② Two-fold serial dilution으로 시료의 최종농도가 500, 100, 50 μg/ml가 되게 희석한다.※ DMSO의 최종 농도는 1%이하가 되도록 한다. (DMSO의 독성을 배제하기 위함.)3) Shrimp 분주와 sample 처리- Pasteur pipette을 사용하여 5ml vial에 해수 4ml + shrimp 10마리 + sample 0.2ml 담는다. (최종 눈금 미리 표시.)※ Shrimp 10마리를 담을 때 부화되지 않은 egg는 담지 않는다. (Egg가 부화하여 실험결과에 영향을 줄 수 있다.)4) 24시간 후에 살아있는 brine shrimp nauplii의 마리 수를 세고, 각 sample마다 linear regression method로 LD50을 계산한다.※ LD50가 1000μg/ml 이하가 되어야 유효하다.4. 실험 결과 및 고찰꽈리 추출물 농도(μg/ml)Brine shrimp 생존수(24h)0 (control)850710065005갈퀴나물 추출물 농도(μg/ml)Brine shrimp 생존수 (24h)0 (control)650810085006생약부위Brine shirimp lethality (LC50, μg/ml, 24h)꽈리지하부674.04갈퀴나물전초976.56Table 1. 꽈리 추출물과 갈퀴나물 추출물의 brine shrimp lethality- Brine shrimp assay는 저렴한 가격으로 신속하고 간단하게 생약의 세포 독성을 검색함으로써 생약 추출물의 항종양작용 가능성을 판단할 수 있는 실험 방법이다.- 반수 치사량(Lethal Dose 50, LD50) 또는 반수 치사농도(LC50)은 피실험동물에 실험대상물질을 투여할 때 피실험동물의 절반이 죽게 되는 양을 말한다. 이 양을 측정하여 실험물질의 세포독성 유무를 판단할 수 있다.- 24시간 후 negative control vial의 생존 shrimp수가 8이었으므로 2마리는 자연사 했다고 판단하고 초기 shrimp수를 8로 설정하였다. 꽈리 지하부 추출물을 첨가한 실험 결과 데이터를 linear regression법을 이용하여 구한 LD50값은 674.04μg/ml이다.- 실험2(갈퀴나물 전초 추출물 첨가)의 control vial은 오류로 인해 shrimp의 생존수가 부정확하게 나왔다. 그래서 실험1의 control vial의 생존수를 사용하여 linear regression법으로 LD50구하였다. 갈퀴나물 전초 추출물 첨가 실험의 LD50값은 976.56μg/ml이다.- 꽈리와 갈퀴나물의 LD50 각각 674.04μg/ml와 976.56μg/ml로 1000μg/ml 이하의 값이므로 세포독성이 있다고 판단할 수 있으며 항종양효과의 가능성을 생각해 볼 수 있다.- 꽈리 지하부 추출물의 LD50값이 더 작으므로 갈퀴나물 전초 추출물보다 더 강한 세포독성을 나타낸다.5. Refrences1) 생약학교수협의회. 생약학∙천연물화학 실습서(신일북스). p214-2152) https://ko.wikipedia.org/wiki/반수_치사량

의/약학| 2021.04.15| 2페이지| 1,500원| 조회(278)

생약학, 꽈리, Brine, 갈퀴나물

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생약학 근류, 근경류, 종자류 시험대비 정리 자료입니다. 평가A+최고예요

1. 근류생약명학명∙과명성분약리∙응용기타★★갈근Puerariae Radix칡 Pueraria lobate-Isoflavonoid: puerarin, daidzein, daidzin-Triterpenoid-해열∙진경, 순환계, 혈당강하, 간세포보호, 항혈전, 항알러지, 알코올섭취억제 (puerarin, daidzin, daidzein)-한방에서 감기약, 해열∙진통∙소염약콩과 (Leguminosae)갈화Puerariae Flos칡 pueraria lobate-Isoflavonoid: tectorigenin-Saponin: kaikasaponin-갈증 없애고, 주독 풀어줌-숙취해소콩과 (Leguminosae)★★감초Glycyrrhizae Radix et Rhizoma감초 Glycyrrhiza uralensis-Trieterpene glycoside: glycyrrhizin-Flavanone: liquiritigenin-Glycyrrhizin은 부신피질호르몬 유사작용-Flavonoind 분획물은 항궤양, 위액분비억제작용-Isoliquiritigenin은 항진경작용-소화기성 궤양치료약, 진경약, glycyrrhizin제조 원료, 완화, 진통, 해독-독성약물의 독성 경감, 생약 약효 조화-gylcyrrhizin에 의한 부종, 저칼륨혈증, 고혈압, 근수축이상, 심장기능이상의 알도스테론증을 초래-결정세포열-Glycyrrhizin에 의한 부종, 저칼륨혈증, 고혈압, 근수축이상, 알도스테론증콩과 (Leguminosae)강활Osterici seu Notopterygii Radix et Rhizoma강활 Ostericum loreanum-Coumarin-진통, 항염증, 항암항알러지, 항산화-감기로 인한 두통이나 몸살미나리과 (Umbelliferae)고삼Sophorae Radix고삼 Sophora flavescens-Alkaloid: matrine, oxymatrine-Flavonoid, Triterpenoid, Quinone-항부정맥, 항미생물, 항암, 이뇨∙해열, 항알러지∙항염증paconitine)-염부자-제부자-포부자-aconitine(Dragendorff 시액)-팔미지황환미나리아재비과 (Ranunculaceae)천오Aconiti Tuber오두 Aconitum carmichaeli-aconitine계: aconitine, hypaconitine, mesaconitine-진통, 진경 및 강장-감초와 검은콩으로 법제미나리아재비과 (Ranunculaceae)초오Aconiti Ciliare Tuber이삭바꽃 Aconitum kesnezoffi놋젓가락나물 A. ciliare세잎돌쩌귀 A. triphyllum-Diterpene alkaloid: aconitine, hypaconitine, mesaconitine-Alkaloid: higenamine-부자와 같음-Maye시액: 황백색 침전-중독주의, 법제필미나리아재비과 (Ranunculaceae)삼칠Notoginseng Radix et Rhizoma삼칠 Panax notoginseng-Saponin: notoginsenoside-심혈관계에 대한 작용-면역증강-간세포 성장 촉진, 신장독성 감소, 기억력 감퇴 개선-신경염증 억제, 신경생성작용-지혈작용(dencichine)두릅나무과 (Araliaceae)★★세네가Senegae Radix세네가 Polygala senega-Triterpene saponin: senegin-methylsalicylate-진해∙거담, 이뇨-항남성호르몬작용: androgen 관련 질환-거담, 진해약-용각산(길경, 세네가)원지과 (Polygalaceae)세신Asari Radix et Rhizoma민족두리풀 Asarum heterotropoides var. mandshuricum서울족두리풀 A. sieboldii-methyleugenol(정유)-acidamide-lignan-aristolochic acid: 신장독성, 발암물질, 전초에 함유-평활근이완-살충작용-해열, 진해, 진통, 거담, 이뇨약-감기나 축농증-소청룡탕-여로와 혼용 금지-건조한 기침에 주의-급성독성-만성독성쥐방울백화전호 Peucedanum praeruptorum바다나물 Angelica decursiva-Lignan: podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin-Coumarin-거담작용∙해열작용-항암작용-해열, 거담, 진해, 진통약, 기침, 천식, 두통미나리과 (Umbelliferae)지유Sanguisorbae Radix오이풀 Sanguisorba officinalis장엽지유 S. officinalis-Tannin: sanguiin H-1~H-11-수렴작용(tannin)-피부보호, 항세균, 항염증-수렴, 지혈약(초탄하여 사용)장미과 (Rosaceae)★★지황Rehmanniae Radix지황 Rehmannia glutinosa-Iridoid: catalpol★-당류-강심, 이뇨, 혈당강하-뇌세포보호(catapol)-간세포보호-아토피성 염증 완화-생지황: stachyose↑manninotriose↓-건지황 숙지황은 반대현삼과 (Scrophulariaceae)★★숙지황Rehmanniae Radix Preparata지황 R. glutinosa-5-hydroxymethyl-2-furaldehyde-숙지황만의 약리: 말초혈관 순환장애의 개선, 골형성촉진작용-술, 사인, 진피를 보조재로 찌고 햇볕에 말림-육미, 팔미지황환현삼과 (Scrophulariaceae)천초근Rubiae Radix꼭두서니 Rubia akane-Anthraquinone: alizarin-Naphthoquinone-지혈, 진해, 항세균, 항암, 항산화, 간세포보호-염료꼭두서니과 (Rubiaceae)칼룸바Calumbae Radix칼룸바나무 Jateorhiza calumba-Alkaloid-Furanoditerpene: columbin-건위작용: 겐티아나 틴크와 같은 효력(위액분비 촉진)-고미건위, 정장지사약-동부 아프리카방기과 (Menispermaceae)★토근Ipecacuanhae Radix et Rhizoma리오토근 Cephaelis ipecacuanha카르타게나토근 C. acuminatVitali 반응: tropic acid 검출-다량 복용시 광분가지과 (Solanaceae)벨라돈나근Belladonnae Radix벨라돈나 Atropa belladonna-Alkaloid: hyoscyamine, atropine, scopolamine-부교감신경억제: 언어구사장애, 운동장애, 지적능력에 영향-진통, 진경, 지한, 동공산대약-벨라돈나 식물의 모든 부분에 독성 있음. 열매에 더 강한 독성-neostigmine(해독)가지과 (Solanaceae)다투라엽Daturae Folium독말풀 Datura stramonium흰독말풀 D. metel-Alkaloid: hyoscyamine, atropine, scopolamine-열대아메리카가지과 (Solanaceae)승마Cimicifugae Rhizoma승마 Cimicifuga heracleifolia-cycloartane-Chromone: visamminol, visnagin-발한 및 피부의 발진을 촉진-진경작용(visamminol, visnagin)-여성호르몬유사작용-발한, 해열, 해독, 소염약미나리아재비과 (Ranunculaceae)아출Curcumae Rhizoma-봉아출 Curcuma phaeocaulis-광서아출 C. kwangsiensis-온울금 C. wenyujin-Sesquiterpenoid-Monoterpenoid-Curcuminoid-방향성 건위약, 간질환 치료제, 소화불량-임부, 월경과다인 경우 금기생강과 (Zingiberaceae)★여로Veratri Rhizoma참여로 Veratrum nigrum박새 V. oxysepalumSteroidal alkaloid-Jerveratrum alk.: pseudojervine 유도체-Ceveratrum alk.: 고수준의 수산화된 화합물, 7~9원자의 산소 내포, eter alk.가 혈압강하작용의 주체-혈압강하작용: 치료량과 중독량의 차이가 매우 적음-농업용 살충제-독성-임부금지(최기형성)백합과 (Liliaceae)★절패모Fritillariae Thun Semen하늘타리 Trichosanthes kirilowii-Cucurbitane계 triterpenoid-소염, 완화, 진해, 거담약으로 흉통, 변비, 기침, 천식, 협심증에 사용박과 (Cucurbitaceae)내복자Raphani Semen무 Raphanus sativus-지방유-sulphoraphene(항암성분)-돌연변이억제작용: isothiocyanate계 성분인 sulphoraphene십자화과 (Cruciferae)대풍자Hydnocarpi Semen대풍자 Hydnocarpus anthelmintica-대풍자유: hydnocarpic acid, chaulmoogric acid(cyclic fatty acid), gorlic acid-내산성균인 나균(Bacillus leprae)의 성장을 억제-한센병치료, 대풍자유의 제조원료-유독함이나무과 (Flacourtiaceae)백자인Thujae Semen-지방유 방울-통변작용(지방유)-자양, 강장약, 윤장작용-천왕보심단백편두Dolichos Semen편두 Dolichos lablab-Saponin: lablab-Steroid: dolicholide-비위허약, 식욕부진, 조육중독-납작한 타원형~난원형콩과 (Leguminosae)보골지Psoraleae Semen보골지 Psoralea corylifolia-Coumarin: psoralen-멜라닌생성촉진(psoralen), 골형성촉진작용-관상동맥 확장제, 자궁출혈, 백반병콩과 (Leguminosae)비자Torreyae Semen비자나무 Torreya nucifera-씨: 지방유(linoleic acid)-구충 및 촌충 구제주목과 (Taxaceae)★빈랑자Arecae Semen빈랑나무 Areca catechu-Pyridine alkaloid: arecoline-Steroid-Tannin: catechin-구충작용-부교감신경흥분작용: arecoline(무스카린성 수용체에 작용)-중추신경흥분작용-건위, 소화, 수렴, 구충약 (조충구제약), arecoline~HCl의 제조원료-임e)

학교| 2021.03.22| 16페이지| 2,000원| 조회(265)

생약학, 근경류, 근류

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