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효소 레포트 A

실험 8. 효소(Enzymes)의 활성 정도 비교일반생물학실험Ⅰ - 5분반Ⅰ. Abstract효소 활성화에 영향을 미치는 요인에는 pH, 기질의 농도, 온도등이 존재한다. 이 실험은 앞서 설명한 요인의 차이를 알아보기 위한 실험이다. 효소는, 생체에서 다양한 화학반응을 촉매하는 단백질 복합체이고, 온도, pH 그리고 기질의 농도 등 주변 환경의 영향을 받는다. 이 때 효소로는 β-galactosidase, 그리고 기질로 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactoside 즉 ONPG를 사용한다. 효소는 Lactose를 glucose,그리고 galactose로 가수분해한다. 또, pH 7.3, 37°C에서 가장 큰 활성도를 가진다고 알려졌다. 이 실험에서는 β-galactosidase인 효소가 기질인 ONPG를 galactose와 ONP(O-nitrophenol)로 분해시키는 것을 촉매하는 것을 이용하였다. 생성물인 ONP는 420nm에서 최대 흡광도를 가지고, 황색을 띈다. 반응종결을 위해서는, 탄산나트륨 용액을 사용하였다. 또, 온도는 water bath,그리고 냉장고로 통제하여 4℃, 20℃(상온), 37℃, 60℃, 80℃의 sample을 실험하였다. pH 조절할때는, Na-phosphate buffer를 사용해, pH 3.0, 5.0, 7.3, 9.0, 마지막으론 12.0로 sample의 pH를 설정하였다. 실험 data를 분석하여 그래프를 통해 분석한 결과는 기질의 농도가 높아질수록 유효충돌수가 증가해, 반응이 잘 일어나 흡광도가 커졌고, 온도가 37℃일 때, pH는 7.3일 때 최적온도와 최적 pH로 흡광도가 높음을 알 수 있었다.Ⅱ. Introduction효소는 단백질 일종으로, 생체 내에서 발생하는, 대부분의 화학 반응에서 촉매와 같은 역할을 한다. 즉 활성화에너지를 낮추어 반응이 잘 일어나게하는 촉매이다. 효소 자신은 소모되지 않으며, 반응 속도를 증가시킴으로써 자신의 기능을 수행한다. 따라서 높은 효율성이있다. 이때 기질은 함께 반응에, 효소의 활성 또한, 사라지게 되는 것이다. 결과적으로 단백질 구조가 바뀌지 않는 최적온도 즉 각 효소들은 각자의 활성 온도를 가지게 된다. 활성온도에서는, 효소의 활성화 정도가 가장 크다.[Figure 3] 온도에 따른 효소의 반응 속도마지막으로, pH또한, 효소 활성에 영향을 미친다. 효소 활성부위에 아미노산 잔기가 이온화되는 정도는, pH에 따라 다르고, 이러한 이온화가 일어나며, 기질과 효소가 빠르게 반응할 수 있게 된다. 효소 그리고 기질에 반응 속도가 빨라진다. 효소 종류에 따라서, 최적 pH는 다르고, 최적 pH에 가까울수록 반응 속도가 빨라진다. [Figure 4]에서 이를 확인할 수 있듯이 우리 신체에 있는 소화 효소인 펩신, 아밀레이스, 카탈레이스, 트립신은 각각의 최적 pH를 가지고 있다.[Figure 4] pH에 따른 소화 효소의 반응 속도이 실험에서 사용하는 효소 β-galactosidase와, 기질인 ONPG를 이용하면, β-D-galactoside 결합을 가수분해하여, glucose와 galactose를 생성한다. 이때, β-galactosidase는 생물체에서, 당의 양 조절에 이용되는 효소이고, 발현되는 장소는 대장균의 오페론 한 부분인 lac operon system의 LacZ이다. 이때 효소는, ONPG의 가수분해를 촉진하는 역할을 한다.[Figure 5] β-galactosidase의 구조식[Figure 6] β-D-galactoside의 구조와 가수분해 반응이번 실험에서 기질로는 ONPG(Ortho-nitrophenyl- β-D-galactoside)를 이용하는데, 이는 효소, β-galactosidase의 활성을 확인하는 수단으로 쓰이게 된다. 기질 ONPG은 ONP(O-nitrophenol) 그리고, galactose의 화합물이고, 두 물질은 β-1,4 linkage로 서로 연결되어 존재한다. 이는 β-galactosidase의 작용으로 결합이 끊어진다. 결합이 끊어지면 ONP가 황색을 띄는 특성에 의해 육안으로 색, 각각의 labeling을 잘 파악해서, pH에 맞게 buffer를 850 씩 첨가해 주어야 한다. 이후, 튜브들에 기질인, 4mM ONPG를 50 씩 첨가한다. 반응을 시작하기 위해서 효소인, -galactosidase를 100씩 넣는다. 이때 pH이외에 조건은 같아야 함으로, 같은 온도에서 실험하기 위해서 37 water bath에서 10분간 반응시켜 준다. 시간이 완료되면, 1M의 Na2CO3를 200씩 첨가해 반응을 종료시켜 준다. 결과를 Spectrophotometer를 통해 파장 420nm에서 흡광도를 확인한다.마지막으로 기질 농도에 따른 효소의 활성을 측정하였다, 마찬가지로 농도를 제외하고 다른 환경은 같게 맞춰줘야 하기 때문에 100mM Na-phosphate buffer(pH 7.3), 2mM ONPG, 37 water bath를 이용한다. 또한, Spectrophotometer를 사용하는데 이용되는 cuvette도 사용된다.우선, Micro centrifuge tube에 각 항목별 구분이 가능하도록 농도별, 시간별로 12개에 labeling을 해야 한다. 그 후에 아래 표와 동일하게 tube에 buffer과 기질인 ONPG를 넣어야 한다.Na-phosphate buffer (pH 7.3) ()2mM ONPG ()-galactosidase ()최종 ONPG 농도()85**************************0100500이후 37도에 water bath에서 가서 미리 5분간 예열해야 한다. 이후 모든 각각의 tube에 효소인, -galactosidase를 100씩 넣어주어야 한다. 이를 피펫팅으로 잘 섞어주고, 같은 37도씨 water bath에서 0, 5, 10, 15분간 시간별로 반응을 진행시킨다. 이때 0분에 경우, 반응을 진행하지 않음으로 water bath에 넣지 않고, 효소를 첨가하기 전에 Na2CO3를 미리 넣어두어 반응이 아예 진행되지 않도록 해준다. 5분이 지나면, 5분 tube들에 Na2CO3를 넣고 반응을 종결한다. 10]과 같다. 가로축은 시간이고, 세로축은 420nm에 파장에서 흡광도 이다. [Table 4]와 [Figure 10]을 보았을 때. ONPG의 농도가 높아질수록, 10분에서 500um을 제외하면 대체로 흡광도가 증가하였다. 또, 반응 시간이 길어질수록, 420nm파장에서의. 흡광도가 증가하는. 경향을 볼 수 있다.Ⅴ. Discussion이 실험에서는, 기질의 온도, pH 마지막으로 농도에 따라 효소의 활성을 관찰해보고,. 실험에서 효소로 이용한, β-galactosidase의 최적 온도, 최적 pH의 값을 분석해보았다. ONPG가 ONP와 galactose로 분리되어, ONP가 생성되면 황색을 띄므로 색의 짙음을 통해서도, 흡광도 측정으로 효소가 얼마나 활성화되었는지 예측할 수 있다. 또, 420nm에서 흡광도를 측정하였을 경우에. 그 흡광도 값이 클수록 효소 활성이 크다고 이해할 수 있다. 앞선 실험결과를 분석함으로써, 효소 β-galactosidase의 활성도가 가장 큰. 최적의 온도는 37℃, 그리고 최적의 pH는 pH 7.3임을 확인할 수 있다. 또한 시간이 지날수록, 농도가 증가할수록 흡광도가 커짐을 확인할 수 있다.우선, 온도에 따른 효소의. 활성을 관찰하기 위해서 일정한 농도의 기질 그리고 효소를 첨가한 뒤에 온도만을 4℃, 20℃(상온), 37℃, 60℃, 80℃로 통제하여 실험을 진행하였다. 실험 결과는, 37℃에서 sample의 흡광도가. 가장 높게 나타났는데, 이는 효소인, β-galactosidase의 최적 온도가 37℃임을 나타낸다. 최적 온도보다 낮은 온도에서는 온도가 증가할 수록 효소와 기질의 충돌 속도가 증가해, 반응이 일어날 확률이 높아지기 때문에 생성물의 농도가 높아진다. 따라서, 반응이 이루어지는 환경의 온도가 높게되면, 충돌속도가 증가하므로 효소의 활성이 더 높아져 흡광도가 증가하는 경향이있다. 하지만 최적온도보다 높은 온도에서는 흡광도가 급격히 감소하는 경향을 보였다. 이는, 효소는 단백질 복합체로 고온에서는 변성되어. 오차가 존재하여 오차가 발생하였을 가능성이 있다.마지막으로는, 기질의 농도에 따라서, 효소 활성을 알아보기 위해 농도가 100µM, 250µM, 500µM인 기질 ONPG를. 효소인, β-galactosidase와 0분, 5분, 10분, 15분 반응시킨다. 총 12개로 sample의 흡광도를 측정하였는데, 그 결과 농도가 일정할 때에는 반응 시간이 길어질수록, 반응 시간이 동일할 때,. 기질의 농도가 클수록 효소 활성도가 커진다는 것을 흡광도가 증가함으로서 확인할 수 있었다. 이는 기질의 농도가 증가할수록 효소와 기질이 반응하는 유효한 충돌 확률이 커지므로 반응속도가 빨라진다는 이론과 부합하는 실험결과였다. 그러나, 500µM ONPG를 10분 반응시켰을 때 농도가 다른 sample 과의 경향을 고려할때, 예상보다 작은 값이 나왔다. 이 오차의 원인으로는 휴대폰으로 시간을 채크하였지만 정확한 시간을 맞추지 못하였을 가능성이 있다. 또한, spectrophotometer에 cuvett을 넣어주는 경우에, 아랫부분을 잡아 원래의 흡광도 값이 다르게 나올 가능성이 있다. 혹은 buffer 그리고 ONPG등을 마이크로피펫을 이용하여 집어넣을 때 미숙한 피펫사용으로, 잘못 첨가하였을 수 있다. 이러한 오차 원인은, 실험을 많이 해봄으로써 실험 기구에 익숙해져 점차 개선해 해결할 수 있다. 또한, 각 시간이 흐르는 동안에 water bath의 문제이다. Water bath에서 일정한 온도 환경에서 반응을 진행시키기위해 tube를 넣게 되는데, 이때 tube일부만 잠기게 담가놓아 튜브의 아래부분만 온도가 균일해 위와 아랫부분의 온도의 오차가 존재하여 오차가 발생하였을 가능성이 있다.더 나아가 반응 시간을 15분보다 더 늘리게 되었을때, 그래프가 어떻게 그려질지 생각해보았다. 각 tube에 첨가한 기질의. 농도는 일정하게 유지해 주지만, 반응 시간을 연장해준다면 결국 기질 고갈 상태에 도달하게 될 것이다. 즉, 더이상 반응에 참여할 수 있는 기질이 남지 않아, 반응이 종결-232

자연과학| 2022.07.12| 12페이지| 2,000원| 조회(278)

일반생물학, 효소활성, 일반생물학1, 일반생물학실험1

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원형질분리 용혈현상 레포트 A

확산( Diffusion ),원형질 분리( Plasmolysis ),용혈 현상( Hemolysis )일반생물학실험 1 - 5분반Abstract4주차 실험은 반투과성막에서 일어나는 삼투현상(osmosis)를 관찰하고, 또한 양파로 식물의 삼투현상을 관찰하고, 적혈구를 이용하여 동물의 삼투현상을 관찰하는것이 목표이다. 세포는 생물의 가장작은 단위로 세포막을 기준으로 안과 밖으로 구분된다. 물질은 다양하게 존재하고 물질에 따라 이동이 달라진다. 이번 실험에서는 여러 확산중에 삼투현상을 관찰하기 위해 진행되었다.Dialysis Membrance를 pipet입구에 파라필름을 이용해 막아주고 2cm의 간격을 둔후 closure을 이용해 밀봉해준다. 그후에 PEG와 0.1%congo red solution의 mixture을 10% PEG, 20% PEG, 30% PEG 로 각각 DIW에 조립체를 넣고 5분 간격으로 60분간 용액의 상승도를 측정한다. 30% PEG mixture에 부피가 가장 크게 변화하기 때문에 삼투현상의 속도가 빠르다는 것을 알 수 있다. 양파의 표피세포를 관찰할때 식물세포의 삼투현상을 알아볼 수 있었는데 이때 DIW, 0.9%의 NaCl, 10%의 NaCl을 각각 10씩 떨어뜨려 현미경으로 관찰하였다. 이때 세포의 모습이 변화하게 되는데 고장액에서 양파 표피세포에서 원형질 분리(Plasmolysis)가 관찰된다. 적혈구를 관찰하여 동물세포동 관찰할 때에도 DIW, 0.9%의 NaCl, 10%의 NaCl을 각각 10씩 떨어뜨려 현미경으로 관찰하였다. 이때에도 세포 모습이 변화하게 되는데 저장액에서 적혈구는 용혈현상(Hemolysis)이 관찰된다. 또, 0.9%의 NaCl 용액은 등장액으로 작용하여 세포에 변화가 없으며, DIW는 저장액으로 작용해 각 세포에 부피가 증가하여 적혈구는 용혈현상이 관찰되었고, 양파표피에서는 세포벽이 존재하여 용혈현상이 관찰되지 않고 부피만 증가한다. 10% NaCl 용액은 고장액으로 작용하여 세포의 부피가 줄어들었고, 양파 다. 확산은 물질이 균등하게 분포될 때 까지 진행되며 이때가 되면 더 이상 움직이지 않는것처럼 보이는 역동적 평형상태가 된다. 단순확산은 농도기울기에 따라 물질이 인지질 이중층을 통과하는것을 말한다. 그 예시는 폐포와 모세혈관의 산소와 이산화탄소 교환하는 것 등이 있다. 촉진확산은 수송단백질에 의해 물질이 통과하는 것을 말한다. 즉 극성분자와 이온은 인지질 이중층을 통과하지 못하는데 세포막을 관통하게 존재하는 수송단백질을 통해서 확산을 가능하게 한다. 수송단백질 종류는 통로 단백질과 운반체 단백질이 있다. 통로단백질은 분자 또는 이온이 세포막을 통과할 경우 통로역할을 한다. 운반체 단백질은 물질이 운반될 때 모양을 약간 변화시킨다. 따라서 촉진확산은 농도에따라 확산이 진행되며 단순확산에비해 속도가 빠르다.마지막으로 이번실험에서 관찰하는 삼투현상은 반투과성 막에서 일어나는 확산이다. 주로 물인용매가 저농도에서 고농도로 이동하는 현상이다. 이때 용매가 이동함으로써 발생하는 압력차를 삼투압이라 한다. 이는 저농도에서 고농도로 용매가 이동하는 정도를 나타냄으로 용질 농도차에 의해 결정된다. 이번 실험에서는 12 kDa의 MWCO값을갖는 Cellulose dialysis memvrane를 사용하여 삼투현상을 관찰하였다. 세포막 또한 반투과성으로 삼투현상이 진행된다.[Figure 3] 용액의 농도에 따른 동물세포와 식물세포Figure 3에서처럼 세포막에 고장액(Hypertonic solution)을 넣게되면 세포 내부농도보다 높은 용액으로 물이 저농도에서 고농도로 빠져 나가기 때문에 세포안의 물이 고농도인 외부로 빠져나가 세포가 쪼그라든다. 이때 식물세포는 세포벽이 존재하기 때문에 물이 빠져나가 세포질과 세포벽이 떨어지는 원형질 분리가 일어나게 된다.Figure 3에서처럼 세포막에 등장액(Isotonic solution)은 세포 내부 농도와 동일한 농도의 용액을 말한다. 이를 동물세포와 식물세포의 넣어두게 되면 농도가 동일함으로 빠져나가는 물의 양과 들어오는 물의 양이 re, Cellulose dialysis MWCO가 12 kDa인 membrane, Clamp & stand, (10%, 20%, 30% PEG 와 Congo red solution (final 0.1%), 또한 이때의 PEG(polyethylene glycol는 분자량이 17600 Da이다.), DIW, gloves, Pipette tips, 타이머(휴대폰) 그리고 parafilm의 재료가 필요하다.이 재료들로 실험을 진행할 때 다음과 같은 과정을 거치게 된다. 처음에는 Dialysis membrane을 DIW에 activationd을 30분 이상 진행시켜야 한다. 그후에 Membrane를 5mL pipette 입구 부분에parafilm을 이용하여 연결시켜준다. 이때 연결부를 tight 하게 밀봉한다. 그 후에 pipette과 closure 사이 거리가 약2cm가 되게 closure로 밀봉해 준다. 이후 전동 피펫으로 밀봉이 잘 되었는지 확인하고, PEG와 0.1% Congo red의 혼합물을 피펫 위로 주입해 준다. 이때 공기가 liquid 사이에 갇히지 않게 주의해서 실험을 진행해야한다. 그다음 DIW에 조립체를 넣고 5분 간격으로 용액의 상승을 60분동안 타이머를 이용해 시간을 확인하며 기록한다. 10%, 20%, 30% PEG로 각각 실험하여 용액 상승 정도를 비교해준다. 이때에 Congo red는 toxic한 물질이기 때문에 dialysis membrane 자체를 맨 손으로 만지지 않도록 조심해야한다. 그렇기 때문에 전 실험 과정을 polygloves를 착용하고 실험해야 한다. 또 Congo red는 분자량이 696.67로 dialysis membrane을 통과해 외부 DIW 영역으로 확산해야 할 것 같지만, 실제로는 Congo red가 단백질 계열과 셀룰로오스 계열 물질에 대해 친화도가 매우 크기 때문에 빠져나가기 전에 membrane에 흡착되어서 빠져나가는 congo red 분자를 관찰하기는 힘들다.두번째로는 원형질분리(plasmolysis)이다후 손을 깨끗이 씻고 손가락 끝을 70% EtOH이나 알코올 솜으로 닦아 소독하여준다. 그 후에 말려주고 Lancet로 찔러 피가 나오게 한다. 그 다음 용액 위에 한 방울씩 떨어트려 준다. 이때 피를 억지로 짜내면 혈청만 나오게 되어 적혈구를 관찰하는 실험에 어려움이 생기므로 억지로 짜지 않아야 한다. 이후에는 Tip으로 잘 섞은 후 10초간 기다린 다음 cover glass로 잘 도말하여 400배율 microscope로 관찰한다. 이 실험도 NaCl이 결정이 쉽게 생겨 관찰이 어려울 수 있기 때문에 5%, 10%의 glucose로 대체가 가능하다.ResultsIV-1. 삼투현상 실험[Table1] 시간(분)에 따른 PGE용액의 부피(mL)시간(분)/sample*************5404550556010% PEG3.63.63.73.93.83.83.83.853.954.004.004.024.0520% PEG5.35.355.475.525.615.75.85.895.926.086.146.206.2730% PEG4.74.95.15.45.65.86.16.356.556.757.157.47.8[Figure4] 시간(분)에 따른 PGE용액의 부피(mL)Figure4 에서 x축은 시간(분), y축은 PEG 용액의 부피. PEG 농도가 클수록 그래프의 기울기 크다.[Table 2] 시간(분)에 따른 용액의 부피(mL) 변화 기록시간(분)/sample*************5404550556010% PEG000.10.30.20.20.20.250.350.40.40.420.4520% PEG00.050.140.220.310.40.50.590.620.780.870.90.9730% PEG00.20.40.70.91.11.41.651.852.052.452.73.1[Figure 5] 시간(분)에 따른 용액의 부피(mL) 변화 기록- Figure5 에서 x축은 시간(분), y축은 부피 증가량. PEG 농도가 클수록 그래프의 기울기 크다.IV-2. 원형질 분리 실험[Table 3] 원형질분리 실 용매의 이동이 일어나는 현상이다.첫번째 실험 결과인 Figure 5에서는 시간(분)에 따른 용액의 부피(mL) 변화 기록을 나타낸 것이다. 이때 추세선의 기울기는 시간에 따른 용액의 부피변화량이다. 추세선의 기울기는 30%PEG는0.251로 가장 큰 값을 가졌으며 20%PEG는 0.085로 그다음으로 컸으며, 10% PEG는 0.036으로 가장 작작은 것 확인할 수 있었다. 즉 삼투압은 농도차에 따라 결정되기에 이를 고려했을 때 물에 비해 농도가 높은 PEG일수록 삼투현상의 속도가 빠르다는 사실을 알 수 있다. 따라서 농도차이가 클수록 삼투현상이 빠르게 일어나 30% PEG의 변화 정도와 속도가 가장 빠르다는 사실을 알 수 있다. 첫번째 실험에서 10%PEG는 최소제곱법인 R2의 값이 0.863으로 0.99보다 작기 때문에 오차가 존재함을 알 수 있다. Table2를 확인하였을때 15분에서 20분사이의 값이 주된 원인이다. 오차 원인으로는 liquid사이에 갇혀있던 약간의 공기가 빠져나오면서 오차가 발생하였다.두번째 실험은 원형질분리 실험으로 용액의 농도에 따라 양파세포의 모습을 관찰한 것이다. DIW에 담근 양파 표피세포는 DIW가 상대적으로 세포 내에 비해 저농도로 DIW는 hypotonic solution으로 작용한다. 또, 세포가 다른 세포에 비해 부피가 커지는 특징을 관찰할 수 있다. 0.9% NaCl은 isotonic solution로 작용하며, 부피가 변화가 없음을 관찰할 수 있다. 10% NaCl은 hypertonic solution으로 작용하며 부피가 다른 세포보다 작게 관찰된다. 이때 양파는 Plant이므로 세포벽과 세포질이 분리되는 원형질분리 현상이 관찰된다.세번째 실험은 용혈현상에 관련된 실험이다. 용혈현상을 관찰하기 위해서는 적혈구를 사용해야한다. 적혈구의 특징으로는 일반적인 체세포보다 작은 크기이다. 때문에 400배율로 확대하여 관찰해야한다. DIW에 넣은 적혈구는 두번째 실험설명에서 서술하였듯이 DIW가 hypotonic solut37

자연과학| 2022.07.12| 9페이지| 2,000원| 조회(182)

일반생물학, 일반생물학1, 일반생물학실험1, 원형질분리 실험

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plasmid DNA의 제한효소 절단 및 전기영동 A 평가A+최고예요

실험11. Plasmid DNA의 제한효소 절단 및 전기영동Ⅰ. Abstract이번 실험에서는plasmid DNA인 pUC4K를 절단하는1ulBamH1을 이용한 Cut과BamH1이 없는 uncut인pUC4K의 크기를1퍼센트의 아가로스겔에서 전기 영동을 통해 확인할 수 있다.전기 영동을 진행하면1XTAE buffer에서 진행하는데 크기가 큰 것은 아가로스겔의 그물 구조를 통과하는데 어렵기 때문에 well근처에 존재하고,DNA의 크기가 작을수록 멀리 이동하는 특징을 이용해 실험을 진행하였다.이때 UV를 이용하면,redsafe가 DNA의 염기 쌍에 염색되어 관찰할 수 잇고, 다양한 크기의 DNA가 있어 실험한 DNA의 크기를 알 수 있도록하는 ladder을 통해 cut과 uncut의 DNA 조각의 크기를 알 수 있다.하지만 실험결과 cut과 uncut의 DNA크기가 같게 나와 오차가 발생했다.이때 오차 원인으로는 다양한 요인이 존재하지만 그중에서 BamH1의 변성으로인해 제기능을 못하였다.이론상의 실험결과에서는 cut이 uncut보다 작은 조각을 확인할 수 있었고, 2702,1264bp에서 조각이 있음을 통해서 BamH1인 제한효소가 DNA를 잘랏음을 확인할 수 있다.이때 gel 농도를 올려주면 그물이 촘촘하여 더 작은 단위의 DNA를 관찰할 수 있고 gel농도를 내려주면 그물이 느슨해 큰 단위의 DNA를 분리하는데 유리함을 알 수 있다.또 BamH1이 아닌 다른 제한효소를 사용하였을 경우 pUC4K map에서 DNA의 조각의 크기를 알 수 있다.Ⅱ. IntroductionPlasmidPlasmid는 백터의 한 종류로 몇몇의 eukaryotic cell에 존재하거나보통 bacteria에 extrachromosomal. circular, double stranded. DNA molecules로 존재한다.이는 생존에 필수적이지 않고 chromosomal. DNA와는 별개로 독립적으로 재생산 할 수 있다.따라서 원하는 우전자를 증폭하여 얻는데 사용된다.이때 백터는 유전 7도애소 1시간동안 1ugDNA를 자르는 BamH1을 사용한다.또 BamH1은 세균인 Bacilus amyloliquefaciens에서 추출한 제한효소이고,5’-GGATCC-3’의 염기를 인식한다.평면 말단을 설명하면 절단부위에 DNA이중 가닥이 같은위치에서 자르는 것이며 점착성말단은 앞과 같지만 다른위치에서 자르는것이다.보통 유전공학에선점착성말단이 유리한데 상보적 염기서열이 노출되어있어 결합하여 염기쌍을 이루기 편하기 때문이다.전기영동전기영동은 단백질이나RNA, DNA를 크기 및 전하량에 따라 분리할 수있다.이번실험에서는 DNA크기에 따라 DNA를 분리할 수 있다.그원리로는 DNA의 인산으로 인해 음전하를 띄고 있어 전기를 걸어주면 중성 pH에서 +극으로 이동하여 분리할 수 있으며 sieving effect로 전기영동시 젤을 이용하는데 젤의 망구조로 인해서 길이기 짧은 분자는 빨리 분리되고 길이가 긴 분자는 천천히 분리된다.이번 실험에서는 아가로스겔을 이용한다.전기영동시 DNA의 이동속도에 영향을 미치는 요인이 존재한다.첫번째로는 DNA의 크기며,크기가 클수록 느리게 이동하는 특징이 있다.두번째로는 buffer에 영향을 받는다. Buffer의 조성에 따라서 이온의 강도에 따라서 DNA 이동성이 달라진다.세번째으로는 사용하는 겔 이번실험에서는 아가로스겔을 이용하기에 아가로스겔의 농도에 따라 영향을 받는다.농도가 높아질수록 크기가 동일한 DNA이동속도는 느려지지만 더 작은 분자까지도 분리할 수 있다.마지막으로는 DNA의 형태가 있다. Nicked, linear, supercolied등의 종류가 존재하며 일반적으로는 동일한 조건에서 supercolied는 응축되어있어 가장 잘 이동하며 그다음으로는 linear, 그다음으로는 nicked순으로 이동하게 된다.추가적으로 설명하자면, 플라스미드 DNA를 사용하는데 플라스미드는 supercolied에 속한다.이번 실험에 사용되는 plasmid는 pUC4K vector로 Kanamycin의, 내성 유전자 양끝에는 4개에 제 넣어준 EtBr, 즉 Ethidium bromide때문이다.이것은 DNA에 염기쌍 사이에 들어가게 되면 302nm인 UV에서, fluorescent가 발현되어. 눈으로 확인할. 수 있게 되는 것 이다.이때 주의할 점은 발암물질이기 때문에 조심해야하거나,발암성이 EtBr보다 작은 EtBr 2분자를 결합한 Redsafe를 이용해 줄 수 있다.Ⅲ. Materials and Methods우선 첫번째로 제한효소를 반응시키기 위해서는 cut라고 효시한 e-tube에 아래 표와 같은 조성을 섞어서, 37도의 waterbath에서 30분동안 반응시킨다.[Table 1] Enzyme cutPlasmid ,DNA(pUC4K, 480ng/ul)4 ulBamH12ul10Xbuffer2ulDIW12ulTotal20ul또한, e-tube에 uncut이라 표시한곳에 아래와 같은 조성을 이용해 water bath에서 37도, 30분동안 반응시켜준다.[Table 2] Control (uncut)Plasmid ,DNA(pUC4K)4ulDIW16ulTotal20ul이때 효소인 BamH1은 온도에 민감하기 때문에 반응 직전에 마지막에 넣어주고,피페팅을 할시 기포가 생기지 않도록하여 정확한 양을 취해야한다.또한 재료가 섞이지 않도록 시료를 취할 때 마다 피펫 팁을 갈아주어야 한다.30분동안 반응시키며 실험시간을 줄이기 위해 Agarosegel을 제조한다.이때 2개의 조에서 한개의 아가로스 겔이 필요하기 때문에 대표 한명이 제조한다.이번 실험에서 1%의 Agarose gel을 제조함으로 아래 조성에 따라서 플라스크에 취한 후 전자렌인지에서 완전히 녹여준다.전자레인전자 사용할 때 아가로스가 들어있는 플라스크는 뜨겁기 때문에 조심해야한다.[Table 3] 1% Agarose gel1%(w/v) Agarose gelagarose1g1X TAE Buffer100mL이때 1XTAE Buffer(~pH8.3)은 3가지 조성으로 구성되는데 40mM의 Tris 또, 20mM의 Acetic Acid, 마지막으로는l에 넣고 uncut와 cut를 20ul을 gel의 홈에 넣어준후 뚜껑을 닫고 전기영동을 40분간 실시한다.이때 150V로 진행하고 양극에 빨간도선을 음극에 검정도선을 연결해준다. 전기영동이 끝나면 gel을 자외선을 쬐어 이동한 DNAd의 절편을 관찰해준다.Ⅳ. Results[figure 1] 전기영동 실험 결과이번 실험을 통해 UV를 이용해 측정한 결과 uncut과 BamH1을 넣어 cut해준 시료의 실험 결과가 차이가 없었음이론상, BamH1의 절단단 위치를 Ladder를 통해 유추할 수 있고, pUC4K의 map을 이용하면 BamH1즉 cut의 DNA의 Bp를 확인할 수 있다.하지만 이론상 2702, 1264bp여야 하지만 큰 오차를 보인다,[Figure 2] 실험이 잘된 전기영동의 실험결과위 사진과 같이 cut한 부분이 uncut부분보다 DNA가 작아 멀리까지 이동하였고,실제로 pUC4K map에서 확인할 수 있는 2702, 1264bp가 labber를 통해 유추할 수 있게끔 3000-2000, 1500-1000사이에 존재함으로 실험결과가 잘나왔다고 할 수 있다.Ⅴ. Discussion이번 실험을 통해 확인하고자 했던 것은 제한효소 BamH1을 이용해 DNA를 자르고, DNA의 크기에 따라 전기영동을 실시해 UV를 이용해 크기에 따른 분류를 확인하는 실험이였다.이때 전기영동에 대해 알아야했으며 다양한 크기에 DNA가 존재하여 크기를 예측할 수 있게 해주는Ladder등이 필요했다.최종적으로 figure1의 결과를 확인할 수 있으며, 제한효소로 잘리지 않은, plasmid는 크기가 커야 하지만(well과. 가장 가까움) BamH1으로 자른 plasmid와 크기가 같은 결과가 나왔다.이론상으로는, uncut은 크기가 cut한것에 비해 커야하고,BamH1이 작용한 것은, 잘리지 않은 것보다는 크기가 작으며, 작은 조각이 두개임을, 두조각으로 나뉜결과인 Figure2를 통해 알 수 있어야한다.이때는두 조각중에서,well과 더 가까운 것이, bp가 큰 것이다.오차을 마지막에 넣어주는 것이 좋다,하지만 이번 실험에서 BamH1을 마지막에 넣지 않아 BamH1이 제대로 작동하지 않아 오차가 발생했다.또 BamH1을넣기 전에 이미 효소가 변성되엇을 가능성도 존재한다.만약 EcoRⅠ이라는 제한효소를. 같은 plasmid DNA한테 처리해,전기영동한 결과를 BamH1에처리했을 때의, 결과랑 비교하여 각각의 bp를 구하고자 한다면 다음과 같은 결과가 예측된다.[Figure 3]BamH1과 EcoR1의 차이그 이유로는 pUC4K vector의 map에 있다.이를 조사하게 되면,BamH1는 plasmid상에서405, 1669bp에 위치해있음을 알 수 있다.또한,이를통해서 살펴보면EcoR1는 396, 1678bp에 존재해있다.따라서 BamH1로 잘리는 조각의 크기1264bp와 2702bp를EcoR1에 이용함으로서,1282bp그리고,2684bp에 plasmid조각이 나온다고 생각할 수 있다.이결과를 그림을 통해 도식화 한다면,위와 같은 결과를그릴 수 있다.이번 실험에서는 1%의 농도를 이용하였다.아가로스겔의 농도는 DNA의 이동에도 영향을 미치기 때문에 이보다 더 작은 농도인, 0.8%일 경우를 생각해보자면 1%에 비해 농도가 작아지기 때문에 gel속 그물망의 구조가 촘촘하지 않고 구멍이 커지기 때문에 같은 시간동안 실험을 진행할 시에 DNA의 이동속도가 빠 다.따라서 0.8%의 아가로스 겔은 큰 DNA를 분리하는데에,적합하다.또,DNA가 빨리 이동해버려, well과 가장 먼곳에 작은 DNA들이 쌓이게 되어, 크기를 구분하기 힘든 경우가 생길것이다.만약 본 실험에서 0.8%를이용했지만,농도에 비해 과도하게 큰 전압을 사용한다면,활모양처럼 구부러져서,정확한 band 크기를 가늠할 수 없는 상황이 생길 수 있다. 추가로 1%보다 더 큰 농도임 5%의 아가로스 겔을 이용한다면,Gel의 구멍이 더 촘촘해져 더 작은 단위의 DNA까지도 구분할 수 있다. 그러나, band 사이의 간격이 너무 좁아져오히려 구분하지 못할 가능성이 생긴다.또한 원래 5

자연과학| 2022.07.12| 7페이지| 2,500원| 조회(817)

전기영동, 일반생물학, 일반생물학1, 일반생물학실험1

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GFP 단백질과 단백질 정량 A

GFP 단백질과 단백질 정량(Protein Measurements)일반생물학실험ⅠⅠ. AbstractEGFP는 녹색형광단백질이고, 488nm 파장에서 excitation max를 가지고있는 단백질이다. EGFP 질량 농도를 측정하기 위해서는 단백질 정량 방법 중에서, Lowry assay 그리고 Extinction coefficient assay를 사용해 정량할 수 있고, 두가지의 결과 값을 비교하였다.처음 실험인 Lowry assay는, Biuret reaction 그리고 Folin reaction을 합한 과정으로 이루어진 방식이다. 이때 Folin reaction까지 마치게되면, 진한 파란색을 띄게된다. 이러한 Lowry assay에서는 표준곡선이 사용되는데, 이때 표준으로 설정된 단백질이 존재하게 된다. 이번 실험에선, 소에 혈청에서 분리된 단백질인 BSA가 일반적으로 표준 단백질로 사용된다. 6개의 well plate에 DIW 그리고 BSA의 비율을 달리해서 넣어준후, 750nm 파장에서 흡광도를 측정해 표준 곡선을 그리고, 추세선과 단백질 농도 관계식을 이용해 EGFP의 질량 농도를 측정하였다. 최종적으로 이를 통해 계산하면 1.625mg/mL 값을 구할 수 있다.두 번째로는 Extinction coefficient assay로 특정한 아미노산이 가지는 흡광도 그리고 특정 단백질의 3차구조가 가지는 흡광도를 이용해 단백질 농도를 측정하는 것이다. PBS와 EGFP를 섞어서 488nm에서의 흡광도를 측정한후, Lambert-Beer's Law 공식에 대입해 몰농도를 구하고 EGFP의 질량 농도를 계산해 0.849mg/mL 값을 구할 수 있었다.실험의 결과적으로는, 약 0.776mg/mL의 차이가 존재하였다. 그 원인으로는, 두 측정 방식에서 기인한 차이라고 결론지었다. 정확도를 높이기 위해서는, 파이펫팅을 통한 용액 혼합을 제대로 실시하여 잘 섞이게 하고, 세게 하여 용액이 밖으로 튀지 않도록 해야한다.Ⅱ. IntroductionⅡ-1. 단백질우리 몸에자 앞에 GFP 유전자를 연결시키는 방식으로 활용할 수 있다. 또한 GFP 단백질은 독성을 지니지 않는다는 특징을 가지고 있다. GFP 뿐만 아니라 적색 형광을 발산하는 RFP라는 단백질도 존재하지만, 이번 실험에 활용하는 단백질은 EGFP이다.EGFP에 대해 설명하자면 이는 mutant된 GFP로서 GFP 64번 amino acid인 phenylalanine을 leucine로 바꾸었으며, 65번인 serine을 threonine로 바꾼 것을 말하게 된다. GFP가 아닌 EGFP를 사용하는 이유는 EGFP가 GFP보다 분광광도법을 이용하면, 더 높은 효율을 띄기 때문이다. 그 이유는 EGFP의 extinction coefficient가 GFP보다 더욱 높기 때문이다. 추가적으로 EGFP를 설명하면 최대 파장은 488nm이다.Ⅱ-2. 분광광도법을 통한 흡광도분광광도법은 모든 생물학적 분자가 갖고 있는, 고유한 흡광 패턴을 분석하기 위해서 사용하는 방법이다. 특정 분자가 갖고 있는 특수한 파장을 흡수하는 정도를 흡광도라고 하는데, 이는 Absorbance나 Optical Density라고도 한다. 여기서 가장 높은 흡광도를 나타내는 봉우리같은 부분을 peak라고 부르는데, 이때가 최대 파장을 갖게 되는 순간이다. 또한, 이때의 값이 시료 고유한 특성이 된다.이러한 고유 특성을 측정하기 위해서, 분광 광도계를 활용하는 것이다. 흡광도는 흡광도를 측정할 수 있는 파장의 영역인 광원(light source) 그리고 단색화장치(monochromator)에 따라서 다르게 나타날 수 있다. 하지만, 자외선 영역 그리고 가시광선 영역에선 모두 흡광도를 측정할 수 있도록 분광광도계에서 설정되어 있다. 분광 광도계를 활용할 때에는, cuvette으로 들어가는 빛을 입사광(incident light)이라 하며, 나온 빛이 투과광(transmitted light)이라 하게된다.[Figure 2] 분광광도계의 구조입사광과 투과광의 강도 즉, 세기의 차이를 비교하는 것이 흡광도 결정의 광도계의 신뢰구간Ⅱ-4. Lowry assay실험에서 사용되는 두가지 방법중 처음으로 진행하는 방법은 Lowry assay이다. 이것은 Biuret reaction에 Folin reaction이 추가되어, Folin reagent가 진파랑을 띄게 되고, 750nm파장에서 최대 파장을 가지게 된다. Biuret reaction은, NaOH를 이용해 약한 알칼리성을 띄고 있는 시료 용액을 만들고, Cu2+ 이온을 첨가해 violet 색을 띄게 만든다. 구리 이온이 peptide bond 속에서, 질소와 complex 이룬 것이다. 하지만 이 반응에 민감도는 1~20mg이므로, 펩타이드 결합의 유무만을 확인하는 용도로 사용된다. 정밀한 실험을 위해선, Folin reaction을 이어 진행한다. 즉 앞서 설명한 biuret reaction에서 형성된 complex 속에는 구리 이온과 Trp, Tyr, Cys 아미노산들이 산화되며, Folin reagent가 환원되는 것으로, 이는 750nm파장에서 최대 파장을 가진다. 이 반응이 더 많이 진행될수록 진한 진파랑색을 관찰 할 수 있다. 또한, 전체 Lowry assay에 민감도는{μg}1이다.Lowry assay에서는 같은 농도의 단백질 시료를 사용하게 되더라도, 그 속에 포함된 아미노산 Trp, Tyr, Cys 아미노산 세 개의 종류에 각각의 수가 다르기 때문에, 결과값이 다르게 나온다. 따라서 표준곡선을 통해 이를 보정하여 농도를 구해야 한다. 표준곡선에 주로 사용되는 표준단백질은 소의 혈청에 있는 알부민 단백질인, BSA이다. 이것은 보통 표준 단백질로 많이 활용된다. 하지만 immunohistochemistry, immunoblots 등 다양한 생화학 분야에서도 활용된다. 또한, 작고 안정적이고, 반응을 하지 않는 특성을 지닌 단백질임으로 면역조직화학에서 차단제로 사용된다. 또한, 중합효소 연쇄 반응을 방해하는 용도로도 사용될 수 있다.EGFP는 특정 파장에서 높은 흡광도를 지니기 때문에, 아미노산 수에 따라준다. 이때 B, 1, 2, 3, 4, 5의 위치를 순서대로 기억해주는 것을 잊지 않도록한다. 다 넣어준 후에는 Solution A 250{μl}를 6 well에 각각 똑같이 넣어주고, 잘 섞이도록 파이펫팅을 해준다. 그 다음으로는 Solution B 2mL를 1000{μl}을 2번 파이펫으로 6 well에 각각 넣어주고 전과 마찬가지로 피펫팅을 진행 해준다. 다 넣은 후에는 빛이 들어오지 못하도록, 빠르게 호일로 24 Well plate를 덮고, 휴대폰으로 15분 타이머를 설정하고 기다린다. 15분이 지나게 되면, 각 용액의 색이 푸른색으로 바뀌고, 이때 각 용액의 농도가 다르기 때문에 색의 짙음정도가 다르다. 6 well에 있는 물질을 각각 1mL씩 B, 1, 2, 3, 4, 5가 라벨링된 cuvette으로 옮겨준다. 이때 BSA가 들어있지 않은 B cuvette을 'blank'이다. 그 후 분광광도계로 750nm에서 흡광도를 측정한다. 마지막으로는 BSA standard curve를 그린 다음, 사용한 EGFP의 질량농도(g/L)를 계산하여 구한다. 추가적으로 설명하자면 여기서 BSA는 Bovine Serum Albumin의 약자이며, 소의 혈청에서 분리되었고 Standard curve를 설정할 때의 표준단백질로 자주 쓰이는 것이다. 이때 standard curve의{{R}} ^ {{2}} 이 0.99보다 아래인 경우 위와같은 과정을 한번더 반복해준다.[Table 1.] 24 well plate 구성Cuvette No.DIWB{~μl}SA stock(2mg/mL) ()Final concentration(mg/ml)B50000149550.022490100.043485150.064480200.085480E{~μl}GFP 20?2. Extinction coefficient assay이번 실험은 긴 시간이 소요되지 않아, 실험1을 수행하고 15분간 기다리는 시간동안 빠르게 수행할 수 있다. 우선, cuvette에 PBS를 1mL 즉 1000{~μl} 을 넣고, 188575071.260.147위에 나타난 실험결과 data를 토대로, 표준곡선을 그려본 결과 흡광도 값은 샘플2를 제외하여 일정한 추세로 나타났다. 이때, 추세선 식은 y=2.35x ? 0.006이고 의{{R}} ^ {{2}} 값은 0.9684이다.[Figure 4] BSA의 농도에 따른 750nm에서의 흡광도 그래프(추세선 포함)Table 2의 흡광도 값을 이용하여 가로축은 BSA의 농도 그리고 세로축은 750nm에서의 흡광도를 나타낸다. 이때 추세선은 선형(A 750)은 흡광도 값이다. 농도를 알고자하는 5번의{{A}} _ {{750}} 는 0.147임을 Table2를 통해 알 수 있다.BSA standard curve에서의 추세선 식을 이용해 EGFP의 질량 농도를 다음과 같이 구할 수 있다.-희석한 EGFP의 질량 농도 (mg/mL) = (흡광도 - y절편){÷} (기울기)= (0.147 + 0.006){÷} (2.35)= 0.065mg/mL- 최종적으로 희석 배수를 고려하여 구한 EGFP의 질량 농도EGFP의 질량 농도 (mg/mL) = (희석한 EGFP의 질량농도){×} (희석 배수)= 0.065mg/mL{×} {{500}{μL}} OVER {{20}{μL}}= 1.625mg/mLExtinction Coefficient assay488nm에서 측정한 결과, 흡광도는 0.077이 나온다. 이때 EGFP의 몰농도를 구하는 식은 아래와 같다.EGFP 몰농도=(측정A){÷}(extinction coefficient){~÷}(cuvette length){×}(dilution factor).이때 흡광도(A)는 0.077이고, extinction coefficient는 61,000({{M}} ^ {{-1}} {{cm}} ^ {{-1}} )이고, cuvette length는 1cm이다. Dilution factor은 희석 계수인데, PBS 960{~μl}와 EGFP 40{~μl}이 섞인 용액을 사용한 것이므로 희석 계수는 1000/40=25이다. 따라서 식에 대있다.

자연과학| 2022.07.12| 9페이지| 2,000원| 조회(220)

일반생물학, 일반생물학1, 일반생물학실험1, 단백질정량 실험

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기체상수의 결정 실험 결과레포트 A

기체상수의 결정Data&Result가열전 시료의 무게:0.100+1.000=1.1g가열후 시료의 무게: 23.5091-23.3981=0.1110g발생한 산소의 기체 무게: 1.1-0.1110=1.0g발생한 기체의 몰수: 1.032=0.031 mol대기압: 1atm=760mmHg발생한 기체의 부피: 216mL=0.216L물의 온도: 288K(1515에서 물의 증기압력: 0.0기체의 부분압력=1atm-0.0168atm=0.9832기체상수: PV=nRT를 이용하여 구한다R=PVnT)=0.98320.216L=0.028 L오차율=Discussion이번 실험은 발생하는 산소기체를 이용하여 기체상수 R을 계산해보는 실험이다. 이번 실험에서 사용되는 화학반응식은 아래와 같다. MnO2는 촉매 역할을 하고 산소기체가 발생하는 실험이다.실험결과 R은 0.028 L으로 실제 이론적인 R의 값인 0.082 L보다 작게 나왔다.그 원인을 살펴보면 우선적으로 PV=nRT는 이상기체 상태방정식으로 실제기체를 이상기체로 가정하여 오차가 발생하였다. 또한 온도를 측정하지 않아 15로 예측하여 측정한 것에서 실제 온도와 다를 수 있기에 오차가 발생하였다. 시험관이 실온으로 식기 전에 부피를 측정하게 된다면 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다. 또한 제대로 입구를 막지 못해 기체가 빠져나올 가능성이 있다. 기체가 빠져나가면서 압력에 변화가 생겨서 오차가 발생할 것이다. 마지막 원인으로는 열분해 반응이 완전히 진행되지 않았을 가능성이 있다. 이러한 오차를 줄이기 위해서는 이상기체 상태방정식의 오차를 줄인 아래의 반데르 발스 상태 방정식을 사용한다면 오차를 줄일 수 있을 것이다.이상기체는 기체의 부피를 생각해주지 않는다는 가정이 존재하지만 실제 기체는 부피가 존재하기 때문에 이를 고려하여 보정을하여 오차를 줄일 수 있다.실험에서 생각해 볼 점은 반응에서 발생한 기체의 부분압력을 구할 때 수증기압을 빼주었다. 예비 레포트에도 작성하였던 돌턴의 부분압력법칙을 생각하며 이 이유에 대해서 생각해보면 용기 내부의 수증기가 존재하게 됨으로 대기압을 이용해 R을 구해준다면 실제보다 많은 양으로 계산하여 오차가 발생하기 때문이다. 이번 실험에서는 KClO3를 이용하였지만 NaHCO3를 이용하였을때도 생각해 보면 발생하는 기체 종류가 달라 분자량도 다르기 때문에 결과값이 달라지게 된다.위의 화학반응식을 참고하여 본다면NaHCO3를 이용하게 된다면 이상기체가 아닌 실제 기체로 실험을 했기 때문에 이산화 탄소가 발생하여 산소가 발생하는 이번 실험과 다른 값이 나타나게 될 것이다.Reference대한화학회, 표준 일반화학실험 제 7판, 천문각, 2011, p실험6, 부록 5

자연과학| 2022.03.11| 3페이지| 1,500원| 조회(165)

일반화학실험, 실험, 기체상수

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