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Anti-inflammatory effect of dexamethasone in LPS-treated Raw264.7 cells

Anti-inflammatory effect of dexamethasone in LPS-treated Raw264.7 cells실험일자 : 2020.10.13. / 2020.10.27.1. Introductiondexamethasone(이하 dexa)은 항염증 효과가 있는 것으로 알려진 합성 부신피질호르몬제로, 프로스타글란딘(PG)의 전구물질인 아라키돈산의 생성을 막거나 면역 세포의 활성을 낮추는 기전을 갖는다. 한편, Raw264.7 cell에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하면, TLR-4에 의해 신호가 전달되어 NF-κB가 활성화되고 PG 생성에 관여하는 COX-2의 발현양이 증가하게 된다.이번 실험은 염증반응이 유도된 세포에 dexa를 처리하여 dexa가 COX-2 mRNA의 양을 줄임으로써 항염증효과를 나타내는지 확인하는 것이 목적이다. 따라서 mRNA의 정량을 위해 cell로부터 순수한 mRNA를 추출하고 이를 cDNA로 바꾼 뒤 PCR을 통해 증폭시킨 후 전기영동을 한다. 이후 대조군과 intensity를 비교하면 dexa의 항염증효과를 파악할 수 있다.2. Method & MaterialCell prep1) Raw264.7 cell을 6-well에 seeding 후 O/N 배양한다.2) control, LPS 1μg/mL, dexamethasone 0.5μM, LPS 1ug/mL + dexamethasone 0.5μM를 각각 처리한다.3) 24시간 후 dish를 ice위에 3분간 올려두고 PBS로 wash한다.4) TRIzol 400μL을 넣고 4℃에서 10분 동안 incubation한다.5) Scraper로 dish를 긁어서 TRIzol을 모으고 labeling한 ep tube에 옮긴다.RNA isolation1) TRIzol sample에 Chloroform 100μL을 넣고 15초 vortexing 후 4℃/10min동안 incubation한다.2) 15000 rpm/10 min으로 centrifugation한다.3) 투명한 aqueous/230 ratio 측정한다.11) 1μg/μL가 되도록 희석한다.cDNA synthesis1) PCR tube에 DEPC/DW 9μL, RNA 1μL(=1μg), oligo dT 1μL(=100pmol)을 넣고 spin down 후 70℃/5 min reaction 후 ice에 꽂아 식힌다.2) 1)을 RT premix(9μL) tube에 옮긴 후 pipetting하고 37℃/60 min → 95℃/5 min reaction한다.3) PCR 전까지 cDNA를 4℃ 또는 ?20℃에 보관Primer design1) NCBI nucleotide에서 COX2 gene의 code(PTGS2)를 검색한다. Raw264.7은 mouse cell이므로 쥐의 학명인 Mus musculus PTGS2로 검색한다.2) RefSeq transcripts를 클릭한다.3) ORIGINS 부분의 전체 서열을 복사한다.4) Primer3Plus에 접속하고 큰 창에 PTGS2 mRNA 서열을 붙여넣는다.5) product size는 100~500bp, primer size는 20bp 내외, Tm은 55~60℃로 설정한 뒤 pick primer를 클릭한다.6) 추천 primer set 중 하나를 고른다.7) Nucleotide BLAST에 접속하고 left primer서열을 큰 창에 붙여넣고 쥐의 database로 설정한 뒤 BLAST를 클릭한다.8) PTGS2 mRNA가 가장 위에 뜨는지 확인하고, 다른 유전자와 E value를 비교한다. 특정 유전자에 대한 특이적인 primer일수록 E value가 낮다. 따라서 target mRNA를 제외한 다른 mRNA와 E value 차이가 커야 한다.9) right primer를 상보적인 서열로 바꿔서 입력한 후, 7)~8)을 반복한다.10) 2)의 RefSeq 페이지에서 ‘Find in this sequence’를 클릭하고 left primer 서열을 입력하여 left primer의 mRNA sequence 상 위치를 확인한다.11) righttocol setting 후 tube를 넣고 running한다.PCR premix 조성 : Taq pl, dNTP, reaction buffer(1.5mM MgCl2), tracking dye, stabilizerPCR protocolPTGS2/COX-2 : 95℃ 3min → 95℃ 30sec, 61℃ 30sec, 72℃ 45sec (35 cycles) →72℃ 3min → 15℃ 10minACTB/Beta actin : 95℃ 3min → 95℃ 30sec, 58℃ 30sec, 72℃ 45sec (35 cycles) →72℃ 3min → 15℃ 10minAgarose gel elctrophoresis1) 500mL 삼각플라스크에 Agarose 2g + 0.5X TAE buffer 100mL을 넣고 흔들어준다.2) 입구에 랩을 씌운 후 구멍을 3~4개 뚫고 전자레인지에서 3min 동안 녹인다.3) Agarose가 완전히 녹았는지 확인후 EtBr 5μL를 넣고 흔든다.4) Gel이 완전히 굳으면 틀에서 분리후 electrophoresis tank에 넣고 0.5X TAE buffer gel이 잠길 만큼 붓는다.5) Well에 DNA ladder 2μL와 sample 5μL를 차례대로 loading하고 뚜껑을 덮은 후 10min동안 gel running한다.6) gel을 tank에서 꺼내 UV lamp로 관찰하여 product size와 intensity를 확인한다.3. ResultPrimer designTm - Fwd primer : 64.9℃, Rev primer : 65.1℃GC% - Fwd primer : 55%, Rev primer : 55%product size : 228bpElectrophoresis4. Discussiondexa가 항염증 효과를 나타내어 COX-2 mRNA의 양이 줄어들었다면, LPS를 단독으로 처리한 군에서 PTGS2 cDNA의 band가 진하게 나타나고, control, dexa, LPS + dexa를 처리한 군에서는 상대적으로 + dexa 처리군에서도 같은 위치에서 흐릿한 band를 확인할 수 있는 것으로 보아 dexa에 의해서 발현이 증가된 mRNA라고 생각해 볼 수 있다.LPS 단독 처리군과 LPS + dexa 처리군을 비교하면 LPS + dexa 처리군이 band의 세기가 강한데, 이는 예상과 반대되는 결과이다. 원인으로 생각해볼 수 있는 것은 다음과 같다. 우선 ACTB 유전자의 전기영동 결과 역시 LPS 단독 처리군의 band가 조금 더 흐린 것으로 보이므로, 두 실험군에 존재하는 cDNA의 양이 다를 가능성이 있다. 이를 고려하여 band의 세기를 확인하기 위해서는 형광의 세기를 측정하여 PTGS2의 형광의 세기/ACTB의 형광의 세기를 계산한 값을 비교하면 된다.그러나 육안으로 보기에도 LPS + dexa 처리군의 band가 훨씬 진하게 보이는 것은 유전자의 양 차이만으로 설명하기 어려울 수 있다. 다른 원인으로 생각해본 것은 dexa에 의해 생긴 것으로 보이는 300~400bp의 band가 끌리면서 아래 band에도 영향을 주었을 경우이다. DNA의 농도가 높을 경우 전기영동 시 끌림현상이 발생할 수 있다고 한다. LPS + dexa 처리군은 다른 실험군보다 DNA의 양이 많을 것이므로(PTGS2 cDNA와 미지의 cDNA) band가 명확하지 않을 가능성이 있다.1) Raw264.7 cell이 죽지 않고 계속 배양이 가능한 원리를 설명하시오Raw264.7 cell은 Abelson murine leukemia virus에 의해 종양세포화된 세포이다. 종양세포는 무한한 증식할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에, Raw264.7 cell은 계속해서 배양이 가능하다.2) TRIzol/chloroform의 RNA isolation 원리Trizol은 guanidine isothiocyanate와 phenol이 주성분이다. phenol은 산성조건을 만들어 산성에서 DNA보다 안정한 RNA만을 선택적으로 분리할 수 있도록 하고, guanidine isothioncyanate는 Rre RNA로 볼 수 있다. 260/280 ratio는 단백질이나 phenol 등에 의해 시료가 오염되었을 경우 낮아질 수 있다. 260/230 ratio 역시 260nm 흡광도/230nm 흡광도로, 260/230 ratio가 2.0~2.2일 때 pure RNA로 볼 수 있다. 탄수화물이나 guanidine 등에 의해 시료가 오염되었을 경우 260/230 ratio가 낮아질 수 있다.4) RT-PCR에서 agent의 역할과 각 step에서 일어나는 일AgentsM-MLV Reverse Transcriptase : mRNA를 주형으로 cDNA를 만든다.RNase inhibitor : RNA가 분해되지 않도록 한다.dNTPs : cDNA 합성에 필요한 염기성분이다.oligo dT : mRNA 3` 말단의 poly A와 결합하여 역전사효소의 primer역할을 한다.reaction buffer : 활성에 필요한 조효소(Mg2+ 등)를 제공하고, pH를 조절한다.Steps70℃/5min : incubation42℃/60min : cDNA synthesis95℃/5min : 역전사효소 inactivation5) PCR premix에 들어가는 agent의 역할Taq pol : DNA가 denature되는 온도에서도 작동하는 DNA polymerase이다.dNTP : DNA 복제에 필요한 염기성분이다.reaction buffer : 활성에 필요한 조효소(Mg2+ 등)를 제공하고, pH를 조절한다.tracking dye : 전기영동 시 loading 되는 것을 확인할 수 있도록 한다.6) TAE buffer에 들어가는 3가지 재료의 역할Tris는 양이온을 공급하여 음전하를 띠는 DNA를 끌어준다. Acetate는 높은 pH를 갖는 Tris를 중화하여 적정 pH로 만든다. EDTA는 Mg 등의 2가 양이온과 chelate하여 DNase의 활성을 억제하고, DNA의 인산기의 음전하를 유지시키는 역할을 한다.7) Agarose gel electrophoresis에서 EtBr의 역할다.

의/약학| 2020.12.11| 7페이지| 2,000원| 조회(206)

전기영동, RT-PCR, RNA isolation, TAE buffer, Loa..

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Gram staining 실험보고서 (그람 염색 실험보고서)

Streaking / Gram staining / Catalase test날짜 : 2020.09.29.작성자 :Ⅰ. 실험 목적계대배양을 수행할 수 있다.Gram staining을 수행하여 그람 양성균과 음성균을 구분할 수 있다.박테리아의 catalase 유무를 알 수 있다.Ⅱ. 실험 준비물Streakingplatinum loop, agar plateGram stainingE.coli, S.aureus, 슬라이드 글라스, 멸균 증류수, platinum loop, crystal violet, iodine 용액, 95% 알코올, Safranin, 현미경Catalase testE.coli, S.aureus, 슬라이드 글라스, 멸균 증류수, 3% H2O2 용액Ⅲ. 실험 과정Streaking1. 균 배양부유액을 백금이에 묻히고, agar plate 위에 지그재그 모양으로 접종한다.Gram staining1. 슬라이드 글라스에 멸균 증류수 10μl를 pipet으로 따서 놓는다.2. 백금이를 소독한 후 균을 묻혀서, 슬라이드 위의 물방울과 잘 섞어 도말한다.3. 도말한 슬라이드를 공기 중에서 말린다.4. 도말 부위가 위로 향하도록 하여, 불꽃으로 서너 차례 통과시켜 고정한다.5. Crystal violet을 한 방울 떨어뜨린 후, 1분간 염색한다.6. 슬라이드 글라스 뒷면을 이용해 수돗물로 서서히 염색액을 씻어낸다.7. 매염제인 iodine 용액을 가하여 1분간 처리하고 iodine을 수돗물로 씻어낸다.8. 95% 알코올로 30초간 탈색시킨다.9. Safranin으로 45초 동안 대조 염색하고 수돗물로 safranin을 씻어낸다.10. 수분을 말린후 검경하여 gram 양성균과 음성균을 구별한다.Catalase test1. 슬라이드 글라스에 멸균 증류수를 10μl 떨어뜨린 후, 균을 묻혀서 슬라이드 위에 도말한다.2. 도말된 bacteria 위에 3% H2O2를 50μl 떨어뜨려 거품이 발생하는지 관찰한다.Ⅳ. 실험 고찰1. gram staining 염색원리gram staining에 사용되는 시약은 crystal violet과 safranin으로 각각 보라색과 붉은색을 띠는 염색 시약이다. 염료가 잘 결합할 수 있도록 하는 매염제인 iodine과 crystal violet을 처리하면 박테리아의 세포벽을 구성하는 성분인 펩티도글리칸 층에 염색이 된다. 그람 양성균은 두꺼운 펩티도글리칸 층을 갖고, 그람 음성균은 얇은 펩티도글리칸 층을 가진다. ethanol을 처리하면 그람 양성균의 치밀한 펩티도글리칸 층의 구멍이 수축하여 crystal violet이 유출되기 어려워진다. 그람 음성균은 얇은 펩티도글리칸 층을 갖고, ethanol에 의해 외막의 지질이 추출되면서 crystal violet이 쉽게 빠져나갈 수 있다. 이후 safranin으로 대조염색을 수행하면 그람 양성균은 crystal violet의 보라색, 그람 음성균은 safranin의 붉은색으로 염색된다.2. gram 양성균과 gram 음성균의 구조적 차이점그람 양성균은 그람 음성균에 비해 두꺼운 펩티도글리칸 단일층으로 이루어진 세포벽에 teichoic acid가 결합해 있다. teichoic acid는 그람 음성균에서는 관찰되지 않는다. 반면 그람 음성균은 얇은 펩티도글리칸 층 바깥을 외막이 둘러싸고 있고 외막에는 LPS (lipopolysacchraide)가 존재한다. 외막과 원형질막사이의 공간인 periplasm 역시 주로 그람 음성균에서 나타나는 특징이다.3. S.aureus, E.coliS.aureus는 Staphylococcus(포도상구균)에 속하는 균주로, 조건부 산소비요구성으로 운동성이 없는 그람양성 구균이다. 지름은 0.5~1.5μm이고 catalase 양성, 산화효소 음성이다. S.aureus는 사람에게 부스럼, 종기, 상처감염, 폐렴, 독성쇼크증후군 등 다양한 질병을 일으킬 수 있다. S.aureus는 다른 세균으로부터 유전자 획득을 쉽게 할 수 있어 다양한 항생제 내성능력을 가지고 있다. 또한 식중독의 주요 원인균이며, 독성인자로 coagulase를 분비하여 혈장을 응고시킬 수 있다.E.coli는 조건부 산소비요구성 간균으로, 가장 많이 연구되고 사용되는 실험미생물이다. formate dehydrogenase를 가져 formic acid를 H2와 CO2로 분해하여 가스를 생성하며 젖당발효가 일어난다. 대부분은 병원성이 없지만, 일부 대장균은 설사를 유발하는 기전을 갖는다.ETEC(enterotoxic E.coli)는 열에 강한 장독소와 열에 약한 장독소를 생산하여 전해질과 물이 소장의 내강으로 분비되도록 하여 설사를 유발한다.

자연과학| 2020.12.11| 3페이지| 1,000원| 조회(246)

그람염색, streaking, Gram staining

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