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분자생물생화학실험(western blotting)

Western BlottingⅠ. 서론Western blotting이란, SDS PAGE를 비롯한 Electrophoresis의 높은 분리능을 이용하여 단백질을 분리해내는 것부터, 분리해낸 단백질을 새로운 곳으로 옮겨주는 Transfer (blotting) 그리고 항원-항체 반응의 높은 특이성을 사용하여 원하는 단백질을 찾아내는 모든 과정을 통틀어 말하는 것이다(Kang, 2007).Western blotting을 하기 위해서는 우선 단백질 혼합물로부터 특정 단백질을 검출하기 위해서 전기영동을 이용하여 순수하게 크기별로 분리해야한다.하지만 전기영동이란, 하전 된 입자가 전기장에서 반대 전하의 전극 쪽으로 이동한다는 것에 기초하며, 전하, 모양, 크기 등에 따라 이동성이 다르다. 따라서 단백질을 전기영동하면 여러 요인이 복합적으로 작용하여 분리가 된다(Kang, 2006).단백질은 20개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이 아미노산들은 전하가 없거나 음전하를 띠거나 양전하를 띠는 모두 다른 특징을 갖는다. 따라서 아미노산이 Peptide 결합을 하여 Polypeptide를 구성하게 되면 매우 다양한 구조와 전하가 나타난다. 이에 따라 단백질이 2차, 3차 구조가 결정되어 매우 다양한 구조가 나타나고 서로 다른 Polypeptide가 붙어 4차 구조를 이루기도 한다(Reece et al., 2012).이러한 단백질을 특성을 제한하여 오로지 단백질의 크기를 통해서만 분리를 해내고 싶을 때 사용하는 방법이 SDS PAGE이다.SDS는 Sodium Dodecyl Sulfate의 약자로 강력한 detergent이다. SDS의 구조식은CH _{3} (CH _{2} ) _{10} CH _{2} OSO _{3} ^{-} Na ^{+}으로 단백질에 SDS의 음이온이 비 특이적으로 흡착되며 강하게 결합하게 된다(Watson et al., 2013).SDS가 단백질에 결합을 하게 되면서 단백질의 3차, 4차 구조를 결정하는 모든 비 공유성 상호작용을 파괴하여 단백질을 완전히 변성시.이 과정을 통해 목적단백질을 정확히 찾아내기 위해서는 Blocking이라는 선행단계가 요구된다. detection을 위해 사용하는 항체도 단백질이기 때문에 Membrane에 매우 잘 붙게 되는데 이를 막기 위해서 Membrane에 단백질이 붙은 면을 제외한 모든 비 특이적 결합자리에 표적대상 단백질과는 관련 없는 단백질 용액을 반응시켜 항체가 붙을 수 없게 차단하는 과정이다(Kang, 2007).이 때 사용되는 단백질 용액으로는 대부분 3~5%의 BSA(소혈청알부민) 또는 non-fat dry milk 등이 사용된다. 둘 다 생체 내에 아주 풍부하며 가격이 싸고 다루기 쉬워 많이 사용되며, 이 과정을 통해 노이즈를 줄이고 false positive를 제거한다.목적단백질을 정확히 찾아내는 detection에 대해 자세히 알아보면 찾고자하는 단백질에 특이적으로 결합하는 antibody 용액에 넣어 항원-항체 복합체를 형성시킨 후 이 antibody에 특이적으로 결합하며, 그 위치를 나타낼 수 있는 기능을 가진 2차 antibody를 처리하여 detection한다(Watson et al., 2013).antibody는 단일 클론 림프구에서 생성되어 목표로 하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 성질을 지닌다. 따라서 목적단백질에 따라 다른 종류의 antibody가 필요하다.antibody의 특징에 대해 알아보면 antibody도 단백질이기 때문에 N-Terminal과 C-Terminal을 갖고 있으며 이 중 N-Terminal은 항원과 결합하는 부위로 매우 다양성이 높은 부분이다. 반대로 C-Terminal은 항원과 결합하는 것에 큰 영향이 없는 부분으로 매우 보존성이 높은 부분이다. 이 부분은 같은 종의 다른 종류의 항체라도 매우 유사하다. 이러한 antibody는 생체 내에서 만들어지기 때문에 보통 쥐에 항원을 injection한 후 7~10일 간격으로 2차, 3차 injection하여 항체를 가장 효과적으로 만들어내게 한 후 피를 뽑아 정제하여 얻는다(ReeceM Tris(pH8.8), 1M Tris(pH6.8), 10% SDS, 10% Ammonium Peroxidisulfate Solution, TEMED2. Preparation of E.Coli lysate1) 실험기구 : 1.5㎖ tube, centrifuge, micro pipet, tip, Sonication2) 실험재료 : E.Coli 배양 용액, wash buffer, lysis buffer, ice3. Bradford protein assay1) 실험기구 : Cuvet, Spectrophotometer, micro pipet, tip2) 실험재료 : E.Coli lysate, bio rad pretein assay solution,H _{2} O, BSA(bovine serum albumin)4. Electrophoresis1) 실험기구 : Loading tank, micro pipet, tip, power supply2) 실험재료 : Tank buffer, ladder, plant protein lysate, E.Coli lysate5. Western Blotting : Electrotransfer1) 실험기구 : Tray, Holder, pad, Tansfer 장치, power supply2) 실험재료 : Transfer buffer, 필터페이퍼, 3M paper, gel(stacking gel), Methanol, ice, Membrane(PVDF)9주차1. Primary, Secondary Antibody incubation & Western Blotting : Detection of Antibodies1) 실험기구 : luminescent analyzer system, Rocker, micro pipet, tip,2) 실험재료 : Blocking solution, PBS, Primary antibody, PBST, Secondary anibody, Detection reagent 1 & 2, Stainning solution, Destain10% APS와 TEMED를 Protocol보다 더 많은 양을 넣어주었다.⑤ Running gel Mixture를 casting한 Plate 사이에 분주한 후H _{2} O를 그 위에 분주해주었다.⑥ Running gel Mixture의 여분이 굳은 것을 확인하면 필터페이퍼로 상층의 물을 제거해준 후 Stacking gel(pH6.8)의 3배의 Mixture를 만들어 굳은 Running gel의 위에 분주한 후 Comb을 꽂아주었다.⑦ Staking gel Mixture의 여분이 굳은 것을 확인하면 gel이 손상이 가지 않도록 Comb이 수평이 되도록 잘 조절하여 뽑아 gel을 완성해주었다.2. Preparation of E.Coli lysate① 2종류의 E.Coli를 배양한 용액 1ml을 1.5㎖ tube에 옮겨 담고 13000rpm 4℃에서 5min 간 centrifuge하여 cell down해주었다.② 상층액 제거한 후 wash buffer 1ml 넣고 pietting과 tapping하여 풀어준 후 13000rpm 4℃에서 5min 간 centrifuge해주었다.③ 상층액 버리고 lysis buffer 500㎕를 넣어주었다.④ E.Coli lysate가 담긴 tube를 얼음 위에 꽂은 후 Sonication을 사용하여 10초 깨고 5초 쉬도록 설정한 후 1분 10초간 sonicate해주었다.⑤ 13000rpm 4℃에서 5min 간 centrifuge해주었다.⑥ 상층액을 새 tube에 옮긴다.3. Bradford protein assay① Cuvet에 E.Coli lysate 20㎕, bio rad pretein assay solution 200㎕,H _{2} O 780㎕를 넣고 5min간 반응시켜주었다.② BSA(bovine serum albumin)의 0~20㎍/L의 흡광도 측정해주었다. - 실험 전 미리 수행③ 측정한 값을 바탕으로 분산형 그래프를 그린 후 추세선을 추가해주어 함수를 구해주었다. - 실험 전 미리 수행④ 반응이 끝나면 Spectrop0.768200.989BAK 1 in E.coli lysate0.300Spectrophotometer를 통해 소혈청알부민의 농도별 흡광도와 BAK 1이 삽입된 E.Coli의 lysate의 흡광도를 측정한 값을 표시한 표이다.표 1의 자료를 바탕으로 분산형 그래프와 추세선을 그린 그림이다. 추세선의 함수를 구한 결과y=0.0472x+0.0431식이 나왔으며, 여기에 BAK 1이 삽입된 E.Coli의 lysate의 흡광도를 대입해본 결과 Spectrometer로 측정한 cuvet 안에 5.44㎍의 Protein이 있을 것이라는 결과를 얻을 수 있다.9주차Acrylamide gel을 사용하여 E.Coli의 단백질을 Electrophoresis하여 크기에 따라 분리하고 luminescent analyzer system를 통해 Flag에 붙은 Antibody에서 발현하는 루미놀의 형광을 관찰한 것으로 Positive control과 Negative control은 loading하지 않았고, 맨 왼쪽의 Size marker는 밴드가 나타나지 않았고, BAK 1의 유전자가 삽입된 E.Coli의 lysate가 loading된 2~8의 레인에 나타나는 밴드와 BAK 1의 C-Terminal이 swapping된 유전자가 삽입된 E.Coli의 lysate가 loading된 9~15의 레인에서 나타나는 밴드가 다른 패턴을 나타내는 것을 확인할 수 있다.9주차Acrylamide gel을 사용하여 E.Coli와 Plant의 단백질을 Electrophoresis하여 크기에 따라 분리하고 Coomassie brilliant blue라는 stainning 용액을 통해 염색한 것으로, Positive control과 Negative control은 loading하지 않았고, 맨 왼쪽은 Size marker이고 2~8의 레인은 BAK 1의 유전자가 삽입된 E.Coli의 lysate, 9~15의 레인은 BAK 1의 C-Terminal이 swapping된 유전자가 삽입된 E.Coli의 lysate하다.

자연과학| 2021.02.25| 9페이지| 2,500원| 조회(305)

단백질, Western blotting, 분자생물생화학실험

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생물학실험 보고서(무척추동물 관찰)

동물계에서 절지동물문 다음으로 많은 종을 포함하고 있는 연체동물문은 약 11만 2000여종이 있으며 여기에는 생김새는 많이 다르지만 모두 같은 문에 속하는 조개, 달팽이, 소라, 문어, 오징어 등이 포함된다.(Son and Bae, 2009) 연체동물은 체제와 크기의 다양성이 매우 크며, 부드러운 몸을 가지고 있지만 대부분은 단단한 껍질로 쌓여있는 무척추동물로 molluscs라고 하며 이는 라틴어인 molluscus, 즉 ‘연하다’라는 뜻에서 따온 말이다.(Cambell et al., 2009) 연체동물은 외형이 매우 다른 차이점을 갖는 종들도 있지만 이들은 모두 같은 조상에서 기원한 몇 가지 공통된 형태를 가지고 있다. 공통적 특징 중 첫 번째는 운동기능을 하는 근육성 발이 있는 것이고, 두 번째는 내부기관을 포함하고 있는 내장부가 있으며, 세 번째로 내장부를 덮고 있는 한 층의 조직 층인 외투막이 있다는 것이다.(Cambell et al., 2009) 이러한 연체동물의 특징들은 물속에 주로 살고, 해양생물의 23%를 차지하며, 몸은 좌우 대칭으로 마디를 가진 부속지가 없다. 그리고 대부분의 연체동물은 외투막에서 석회질 성분이 분비되어 패각을 만들며, 섭식기관인 치설 또는 악판을 가지고 있다.(Son and Bae, 2009) 연체동물은 중배엽으로부터 만들어진 진체강을 가지며, 몸은 연하고 탄력이 있고 뚜렷한 체절은 없다. 외투막과 내장낭 사이의 외투강에는 신관, 항문, 아가미 등이 있다. 연체동물의 순환계는 대부분 개방혈관계이나 두족류는 폐쇄혈관계로 되어있는 특징을 갖는다.(Son and Bae, 2009) 연체동물 중 부족류는 경첩이 달려있는 두 쪽의 껍질이 있으며 대부분 부유물 섭취자이다. 외투막강에는 아가미가 있으며 아가미를 통해 물속에 있는 먹이입자를 걸러 입으로 보내 섭취한다.

자연과학| 2021.02.25| 5페이지| 2,500원| 조회(158)

생물학실험, 무척추동물, 생물학실험 보고서

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세포생리학실험(동물 세포의 배양과 DNA,RNA분리 및 분석)

실험 제목 : 동물 세포의 배양과DNA·RNA분리 및 분석Ⅰ. 서론세포는 생명체를 구성하는 최소의 기본적인 구조 및 기능의 단위로써 두 개 이상이 모여서 조직을 형성하고 조직은 기관을, 기관은 개체를 이루며 생명체를 구성하게 된다(Reece et al., 2012).이러한 세포를 관찰하고 실험을 하려면 가장 기본적으로 세포배양이란 기술이 필요하다. 세포배양이란 넓은 의미로 지구상에 존재하는 생물들 중 동물, 식물을 구성하고 있는 세포와 미생물들을 생체조직이 아닌 영양물, 전해질, pH, 온도, 산소, 이산화탄소, 습도 등 요건이 충족된 인공배지에서 증식하게 하여 세포의 형태학적 관찰, 기능에 관한 연구, 각종 질환의 진단 및 관련 유전인자의 확인, 치료목적의 유용한 물질의 개발과 다양한 학문분야에서 기본적으로 활용될 수 있는 기술을 말한다(Kim et al., 2004).세포의 배양은 크게 동물세포와 식물세포 그리고 미생물세포의 배양으로 나뉜다. 그중 동물세포의 배양은 다시 크게 3가지로 나뉘는데 첫 번째로는 피부, 혈액, 장기 등 조직에서 직접 세포를 분리하여 일정기간만 배양하여 실험에 활용하는 초대배양이고, 두 번째로는 초대배양을 통해 얻은 세포를 지속적으로 유지하기 위해 배양하는 계대배양이며, 마지막으론 조직이나 장기 일부를 그대로 존속하거나 특정 세포를 대량 증식시켜 인공적으로 조직체를 만드는 기관배양이다(Kim et al., 2004).세포 배양에 가장 중요한 부분 중 하나는 체외에서 세포를 성장시키고 분화시키기 위해서는 체내와 동일한 조건을 주어야 하는 것인데 이와 같은 조건을 가장 유사하게 제공하는 것을 배지라 한다. 배지에는 세포에 필요한 에너지를 공급해주기 위해 포도당을 넣어주지만 포도당만 넣어준다고 세포를 배양할 순 없다. 세포를 배양하기 위해서는 포도당 말고도 필요한 성분들이 있다. 이를 제공하기 위해 여러 성분을 넣어주는데, 그 성분 중 하나인 혈청은 세포부착을 증진시키는 요소와 세포 증식을 증진시키는 성장 요소를 포함한다. 또한 많은 미들은 제각기 기능을 가지고 단백질을 합성하지만 생화학적으로는 매우 유사한 분자들이다(Campbell et al., 2009; Geoffrey, 2002).리보솜 RNA는 인간과 같은 진핵세포에서 4종류가 나타난다. 이중 28s, 18s 5.8s는 전구 rRNA라 부르며 2kb 크기의 45s라는 하나의 긴 전구 전사체가 절단되어 생겨난다.(cf. 원핵세포는3종류이며 하나의 전구 전사체가 절단되어 23s, 16s, 5s가 생겨난다.) 남은 한 종류의 5s rRNA는 앞의 3종류의 rRNA와는 다르게 가공을 심하게 거치지 않는데, 그 이유는 앞의 3종류의 rRNA를 만드는 유전자들과 분리되어 있는 미토콘드리아나 엽록체의 독립유전자에서 전사되기 때문이다(Geoffrey, 2002).이러한 DNA와 total RNA를 추출하는 방법은 여러 가지가 있는데 DNA를 추출하는 가장 일반적인 실험방법으로는 셀을 모아 세포막을 깨고 DNA를 제외한 물질을 제거하는 화학적 성질과 물리적 성질을 이용한 방법을 사용하게 된다. RNA 또한 DNA와 유사한 방법을 사용하는데 여러 종류의 RNA를 모두 추출하기 때문에 total RNA분리라고 하며 Trizol이나 Intron등을 이용하여 RNA만 분리해 내는 과정이 추가로 필요하다(http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_extraction; http://en.wikipedia.org/wiki/D-NA_extraction#Detecting_DNA).이러한 방법으로 DNA나 RNA를 추출하게 되면 추출이 잘되었는지 다른 물질이 섞이진 않았는지 확인할 수 있는 방법들이 있는데 그중 가장 쉽고 많이 쓰이는 방법은 전기영동을 통한 확인으로, 전기영동법은 DNA나 RNA의 단편의 분리나 동정, 정제를 위한 일반적인 방법이다(Kang, 2006).이 실험에서는 많이 사용되는 세포주인 HEK 293cell을 이용하여 세포를 계대배양하는 방법을 익히며, 계대배양을 한 세포로부터 DNA와 Total RNA를 추출하는 실험을 통해 분리ter bath에 DMEM과 Trypsin/EDTA Solution을 넣어주었다.② CO2 Incubator(35.2℃, CO2 분압 5%)에서 HEK 293 cell을 배양한 Plate를 꺼내서 Optical microscope를 사용하여 관찰하였다.③ 70% Ethanol을 사용하여 손을 소독한 후 Clean bench 안에서 Aspirator 앞에 블루팁을 낀 후 배지를 제거해 주었다.(※Plate를 열 때는 엄지와 중지 그리고 검지만을 사용하여 Plate를 몸의 바깥쪽을 향해 열고, Pipette을 사용할 때는 항상 팁이 다른 부분에 닿아 오염되지 않게 조심하며 사용한다.)④ Clean bench 안에서 Pipette aid에 Pipette aid tip을 낀 후 PBS solution을 Plate 벽을 타고 넣어주어 세척해주었다.⑤ 방법 ③과 같은 방법으로 Aspirator를 사용하여 PBS를 모두 제거해주었다.⑥ Clean bench 안에서 Pipette을 이용하여 Trypsin/EDTA Solution(1X) 800㎕를 넣고 흔들어준 뒤 CO2 Incubator(35.2℃, CO2 분압 5%)에 넣고 3분 동안 반응을 시켜주었다.⑦ 반응을 시켜준 후 HEK 293 cell이 떨어질 수 있게 Plate에 물리적인 힘을 가해준 후 Optical microscope를 사용하여 관찰해주었다.⑧ 70% Ethanol을 사용하여 손을 소독한 후 Clean bench 안에서 Pipette aid에 Pipette aid tip을 낀 후 Pipette aid를 사용하여 DMEM을 5㎖ 넣어주었다.⑨ 다시 Pipette aid를 사용하여 2.5㎖을 50㎖ tube로 옮겨준 후 1000rpm에서 Centrifuge를 1분간 돌려주었다.(※이 때 Centrifuge의 rpm이 너무 높으면 셀이 손상될 가능성이 있으므로 조심한다.)⑩ DMEM pipette으로 제거해준 뒤 tapping하여 셀을 흩트려주었다.⑪ 70% Ethanol을 사용하여 손을 소독한 후 Clean 주었다.②RNase를 넣어준 1.5ml tube를 Rack에 꽂아 Incubator에서 1시간 동안 반응시켜주었다.③Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol(25 : 24 : 1, pH8)을 현재 부피와 동량(305㎕)을 넣어준 후 세게 흔들어 주었다.④최대 13000rpm으로 4℃조건에서 3분간 spin down 해준 후 상층액만 따서 새 1.5ml tube에 옮겨주었다.⑤클로로포름 용액을 동량(305㎕) 넣어준 후 세게 흔들어 주었다.⑥최대 13000rpm으로 4℃조건에서 3분간 spin down 해준 후 상층액만 따서 새 1.5ml tube에 옮겨주었다.⑦3M Sodium acetate를 현재부피에{1} over {5}부피(61㎕)를 넣어준 후 살살 upside down을 해주었다.⑧Isopropanol을 동량(366㎕)을 넣어주고 upside down을 하여 섞어주었다.⑨최대 13000rpm으로 4℃조건에서 10분간 spin down 해준 후 상층액을 버리고 70% Ethanol을 500㎕ 넣어준 후 천천히 upside down하여 섞어주었다.⑩다시 최대 13000rpm으로 4℃조건에서 3분간 spin down 해준 후 다시 같은 조건으로 한 번 더 spin down을 해주었다.⑪Pipette을 사용하여 상층액을 제거해 준 후 pellet을 30㎕의 D.W를 넣고 pipetting하여 섞어주었다.⑫추출한 DNA를 전기영동하여 확인하기 위해 DNA : 10X Loading buffer : D.W를 3㎕ : 3㎕ : 24㎕를 섞어 분주할 것을 만들어주었다.⑬만들어온 Agarose gel과 0.5X TAE Buffer를 전기영동기에 넣고 Agarose gel의 well에 만들어 놓은 혼합물을 10㎕ 분주하여 주었다.⑭3개의 well에 걸기 위해 혼합물을 30㎕를 만들어주었지만 분주과정에서 실수가 생겨 모자라게 되어서 다시 DNA : 10X Loading buffer : D.W를 2㎕ : 2㎕ : 16㎕를 섞어 분주할 것을 만들어주었 3/10 12:15계대배양을 마친 45분 후 Optical micro- scope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 계대배양을 마친 후 바로 관찰 했을 때와 달리 세포들이 가라앉아 있었고, 형태 역시 구 형태를 띠고 있었다.X100 HEK 293 cells 관찰 3/10 18:00계대배양을 마친 6시간 30분 후 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 큰 변화 없이 구 형태의 셀들을 관찰할 수 있었다.X100 HEK 293 cells 관찰 3/11 12:00계대배양을 마친 24시간 후 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 초점이 잘 맞지 않았지만, 완벽한 구형태가 아니라 약간 씩 세포들이 퍼져나간 것을 확인할 수 있었다.X200 HEK 293 cells 관찰 3/12 12:00계대배양을 마친 48시간 후 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 세포들이 거의 다 바닥에 부착되었으며 좀 더 넓게 퍼져나간 것을 관찰 할 수 있었다.X100 HEK 293 cells 관찰 3/13 12:00계대배양을 마친 72시간 후 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 세포들이 바닥에 부착하여 넓게 퍼졌을 뿐만 아니라 분열을 하여 세포의 수가 눈에 띠게 증가한 것을 관찰할 수 있었다.X100 HEK 293 cells 관찰 3/14 12:00계대배양을 마친 96시간 후 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 24시간 전과 비교해보면 세포들이 분열을 하여 빈공간이 많이 감소된 것을 관찰 할 수 있었다.X100 HEK 293 cells 관찰 3/17 12:0계대배양을 마친 일주일 후 실험 과정 중 배지를 한 번 갈아주었으며 Optical microscope를 통해 HEK 293 cells을 관찰한 결과 세포 외의 이물질들이 관찰 되었고 세포들이 분열하여 빽빽하게 빈 공 있다.

자연과학| 2021.02.25| 17페이지| 2,500원| 조회(583)

분리, RNA, DNA, 분석, 배양, 동물 세포, 세포생리학실험

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생물학실험 보고서(조류와 선태류의 관찰)

Ⅰ.서론조류는 원생생물계에 속하는 진핵생물군으로서 물속에서 생장하며, 대부분 광합성 색소를 가지고 독립영양생활을 하는 생물로 지구총광합성량의 많은 부분을 차지하는 생태학적으로 매우 중요한 생물이다. 그러나 광합성 색소가 결여된 것일지라도 체제와 생식방법이 비슷하면 조류에 포함시키고 있으며, 외형적·기능적으로는 뿌리·줄기·잎 등이 구별되지 않고 포자에 의해 번식한다.(Son and Bae, 2009)조류에는 총 11가지의 문으로 나누어지며, 이번 실험에서 살펴볼 홍조류와 녹조류는 각각의 특징을 가지고 있는데 먼저 홍조류는 깊은 바다 속에 살며, 광합성 색소로 엽록소 a와d 그리고 피코빌린이라는 붉은 계열의 색소를 가지고 있어 전체적으로 붉은 빛을 띤다. 광합성 산물로서는 홍조 녹말로 저장하고, 엽록체는 2겹의 형태로 되어 있다.(Cambell et al., 2009)녹조류는 다양한 형태와 증식 방법을 가진 원생생물로 광합성 색소로 엽록소 a, b와 카로티노이드를 가지며 광합성 산물은 녹말이다. 녹조류도 홍조류와 같이 엽록체는 2겹이지만 3겹, 4겹 그 이상의 것들도 있으며 육상식물과 가장 가까운 조류이다.(Cambell et al., 2009)선태류는 보통 습지나 물가에 사는 이끼를 말하며 몸의 체제나 생활방식이 수중 생활에서 육상생활로 옮겨 가는 중간 단계의 특징을 나타내는 식물이다. 관다발이 없어 물과 무기 양분 및 유기 양분을 멀리 운반할 수 없으므로 길이 생장이 제한을 받아 지표에 거의 붙어서 자란다.(Son and Bae, 2009)생식 방법은 조류와 비슷하며 생식과정에서 정자가 이동하는데 물이 필요하므로 습한 곳에 주로 서식한다. 선태류는 다른 식물과 마찬가지로 엽록소 a, b를 가지고 있어 광합성을 하며, 암수 딴 그루 이고 몸은 뿌리, 줄기, 잎이 분화되지 않은 엽상체구조를 갖는다. 또한 선태식물은 꽃이 피지 않으며 포자에 의한 무성생식과 배우체에 의한 유성생식이 뚜렷이 구별되는 세대교번을 한다.(Cambell et al., 2009)이러한 선태류는 선류와 태류로 구분되며 선류는 외관상 줄기와 잎이 구별가능하며 솔이끼 등이 여기에 속하고, 태류는 엽상체구조로 땅에 붙어서 살며 우산이끼 같은 식물이 여기에 속한다.(Son and Bae, 2009)이러한 녹조류, 홍조류 그리고 선태류의 외형과 단면을 관찰하여 그 구조들을 살펴보고 그 구조들이 가지는 특징이나 기능을 살펴보고 이러한 구조들이 필요한 이유 등에 대하여 생각해보며, 식물이 수중에서 육상 환경으로 올라와 생활하는데 필요한 구조적 특징은 무엇이 있으며 어떠한 방면으로 수중식물에서 육상식물로 진화하였는지 생각해본다.Ⅱ.재료 및 방법1.실험재료광학현미경, 면도칼, 핀셋, 페트리 디쉬, 슬라이드글라스, 커버글라스, 증류수, 우뭇가사리, 구멍갈파래, 우산이끼, 솔이끼2.실험방법실험A. 녹조류의 관찰①녹조류를 대표하는 구멍갈파래의 외부 형태적 특징을 관찰했다.②녹조류인 구멍갈파래 끝을 조금을 잘라서 횡단으로 잘게 자랐다.③슬라이드 글라스 위에 구멍갈파래 절편을 올려놓고 증류수를 한 방울 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 광학 현미경으로 구멍갈파래의 특징을 관찰했다.④관찰한 결과를 기록하고 다른 종들과 비교했다.실험B. 홍조류의 관찰①홍조류를 대표하는 우뭇가사리의 외부 형태적 특징을 관찰했다.②홍조류인 우뭇가사리 끝을 조금을 잘라서 횡단으로 잘게 자랐다.③슬라이드 글라스 위에 우뭇가사리 절편을 올려놓고 증류수를 한 방울 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 광학 현미경으로 우뭇가사리의 특징을 관찰했다.④관찰한 결과를 기록하고 다른 종들과 비교했다.실험C. 우산이끼의 관찰①선태류를 대표하는 우산이끼의 외부 형태적 특징을 관찰했다.②선태류인 우산이끼의 암그루와 수그루를 구별하여 관찰했다.③슬라이드 글라스 위에 우산 모양의 배우체를 뒤집어 놓고 증류수를 한 방울 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮고 광학 현미경으로 우산모양의 특징을 관찰했다.④관찰한 결과를 기록하고 다른 종들과 비교했다.실험D. 솔이끼의 관찰①선태류를 대표하는 솔이끼의 외부 형태적 특징을 관찰했다.②선태류인 솔이끼 끝을 조금을 잘라서 수직으로 잘게 자랐다.③슬라이드 글라스 위에 솔이끼 절편을 올려놓고 증류수를 한 방울 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 광학 현미경으로 솔이끼의 특징을 관찰했다.④관찰한 결과를 기록하고 다른 종들과 비교했다.Ⅲ.결과그림1. 녹조류, 홍조류, 선태류의 외부구조 관찰수그루암그루구멍갈파래우뭇가사리우산이끼우산이끼-암그루우산이끼-수그루솔이끼그림2. 녹조류, 홍조류, 선태류의 내부구조 관찰종명 : 구멍갈파래 - Ulva pertusa관찰배율 : ×400관찰한 결과 : 녹조류의 내부에는 초록빛을 띠는 엽록체가 2겹으로 존재 하며, 이 엽록체는 2중막 구조를 하고 있다. 이 외에는 다른 세포나 구조를 관찰 할 수 없다.종명 : 솔이끼 - Polytrichastrum formosum관찰배율 : ×400관찰한 결과 : 조류에는 보이지 않았던 새로운 구조인 관다발 조직들을 관찰 가능하다. 하지만 이는 관다발로 완벽히 분화된 것이 아니라 관다발식물로는 볼 수 없다.종명 : 우뭇가사리 - Gelidium elegans관찰배율 : ×100관찰한 결과 : 붉은 빛을 띠며 표피 부분에는 작은 구슬 모양의 세포가 여러 층으로 겹쳐서 이루어져 있고, 수층보다 더 밀도가 높게 모여 있어 색이 진하다. 수층에는 표피층 보다 두껍고 커진 세포들이 모여 있다.종명 : 우산이끼 - Marchantia polymorpha관찰배율 : ×100관찰한 결과 : 우산이끼는 내부구조가 아닌 수그루의 뒷면을 관찰했다. 이를 보면 표피에는 공변세포가 있으며, 증류수를 뿌려주고 관찰하면 서서히 닫히는 것을 확인할 수 있다.홍조류, 녹조류, 선태류의 식물인 구멍갈파래, 우뭇가사리, 우산이끼, 솔이끼는 이러한 외부구조와 내부구조의 특징들을 갖고 있으며 서로 비슷한 구조와 다른 종이 가지고 있지 않은 구조적 특징을 찾아볼 수 있었다.Ⅳ.논의이번 실험에서 녹조류, 홍조류, 선태류의 외부 형태와 내부 형태를 관찰하고 각각의 식물이 가지고 있는 특징을 이해하고, 비교하여 식물이 수중에서 육상으로 진화해 가는 과정을 생각해보고 그에 따른 필요한 특징에 대해 생각해 보았다.우선 녹조류의 대표식물로 관찰한 구멍갈파래의 외부 형태는 녹색 빛을 띠고 그 모양은 물결모양을 하고 있으며 위로 올라 갈수록 넓게 펼쳐진다. 그리고 식물체를 단단히 지지해줄만한 구조는 보이지 않았고, 영양분을 운송하는 기관이나 뿌리 같은 부분들도 보이지 않았으며, 그 표면은 매끈한 특징을 가지고 있다.다음은 홍조류의 대표식물인 우뭇가사리의 외부 형태는 붉은 빛을 띠고 중간의 두꺼운 줄기에서 수많은 가지를 양쪽으로 내어 다발을 이루고 있는 구조이며, 주걱 모양의 포자낭 가지가 작은 가지에 달려 있다. 우뭇가사리 말단부에는 바위 같은 부분에 매달릴 수 있는 뿌리 같은 구조가 달려 있으며 구멍갈파래와 달리 흐물흐물하지 않고 딱딱한 형태를 가지고 있다.이번엔 선태식물의 태류인 우산이끼와 선류인 솔이끼의 외부형태를 살펴보면 우선 우산이끼는 stem like, leaf like, structures인 엽상체 구조를 가지고 있으며, 중력을 이겨내고 영양분과 물을 위로 올려보낼 수 있는 기능이 매우 미약해서 바닥에 붙어 자라며, 암배우체와 수배우체의 모양이 다르다. 암배우체는 찢어진 우산모양이고 수배우체는 뒤집어진 우산 모양을 하고 있으며, 우산모양의 배우체 뒷면에는 기공이 있는 것을 관찰할 수 있다. 또한 헛뿌리가 있으며 엽상체와 배우체를 이어주는 줄기는 조류와는 다르게 위로 뻗어나가도 중력을 이겨낼 정도로 지지할 수 있는 기능이 있다.

자연과학| 2021.02.25| 6페이지| 2,500원| 조회(170)

조류, 생물학실험, 선태류

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세포생리학실험(남세균과 애기장대의 형태적 특징과 색소)

남세균과 애기장대의 형태적 특징과 색소I. 서론남세균은 광합성의 방법과 서식처가 다른 조류와 비슷해서 오랫동안 조류로 알려져 왔으나 연구를 계속 진행한 결과 현재는 그람음성진정세균에 속하고, 애기장대는 광합성의 방법과 서식처가 모두 다른 식물들과 유사하며, 분류군 또한 식물계에 속한다(강신성, 2000).이렇게 분류군이 완전히 다른 남세균과 애기장대의 연관성을 알아보기 위해 두 생물의 공통점들을 살펴보면 우선 태양에서 오는 빛에너지를 화학에너지로 전환하는 광합성이 가능하다는 공통점이 있으며, 색소체 중 하나인 클로로필 a를 공통적으로 갖고 있다는 특징이 있다. 반대로 두 생물 간의 차이점에 대해 알아보면 첫 번째로 세포내 구획이 가능한 진핵생물인 애기장대와는 달리 남세균은 세포내 구획이 불가능한 원핵생물이며, 두 번째로는 애기장대는 보조색소로 클로로필 B를 갖지만 남세균은 피코빌린이라는 색소를 갖는 차이점이 있다. 세 번째로는 수중에서 사는 남세균과 달리 애기장대는 육상에서 서식하며, 마지막으로 애기장대는 서식지가 육지이기 때문에 수분스트레스로부터 자유롭지 못해서 이에 적응하기 위해 진화와 분화가 많이 일어난 다세포 생물이지만 남세균은 단세포 생물이라는 차이점이 있다(홍영남 et al., 2008; 이인규 et al., 2003).남세균과 애기장대의 공통점이지만 차이점이기도 한 색소에 대해 알아보면, 색소란 식물의 두드러진 시각적 특징을 나타내면서 거의 모든 식물의 중요한 생리적 구성원이며 그 종류는 매우 다양하다. 여러 종류의 색소는 공통적으로 빛을 흡수하기 위해 존재하는데, 여러 색소가 존재하는 이유는 한 가지 색소가 모든 파장의 빛을 흡수할 수 있는 것이 아니라 특정 흡수 범위가 존재하기 때문에 빛의 흡수 효율을 높이기 위해서 여러 종류, 여러 색상의 색소들이 존재하는 것이다(홍영남 et al., 2008).색소들은 빛을 흡수하는 역할을 할 뿐만 아니라 받은 빛을 방출하는 역할도 하게 된다. 빛을 많이 흡수하면 좋은 일이지만, 과도한 빛이 내리쬐는 상황에로 만들게 되며, 에너지 소산의 방법 중의 하나로 빛의 형태로 방출하는 방법이 있는데 이 때 나오는 빛을 형광이라고 한다(홍영남 et al., 2008).색소는 보통 혼자 존재하기보다는 단백질과 결합하여 색소단백질의 형태로 존재하며 이는 빛의 에너지와 정보를 이용할 수 있는 광수용체 역할을 색소의 종류에는 클로로필, 피코빌린, 카로티노이드, 크립토크롬, 플라보노이드, 베타시아닌 등이 존재한다(홍영남 et al., 2008).남세균과 애기장대가 갖는 색소에 대해 알아보면 일단 두 생물은 모두 클로로필 A를 갖는 공통점을 갖고 있으며, 클로로필 a는 초록빛을 띠는 색소로 광합성에 주요역할을 하는 색소이다. 차이점에 대해 알아보면 남세균은 광합성의 보조색소로 피코빌린을 갖는 반면 애기장대는 클로로필 b를 갖는다. 우선 피코빌린에 대해 알아보면 피코빌린은 광합성의 집광성 색소로서 기능하여, 빛의 흡수가 적은 파장역인 500~600nm의 파장의 빛을 흡수하여 광계 II로 전달해주는 포집색소이며, 클로로필 b는 엽록소 a가 흡수하지 못하는 엽록소 a와 아주 가까운 영역의 파장역인 450nm, 640nm 근처의 파장을 흡수하여 광계 II로 전달해주는 포집색소이다(강원희 et al., 2008; 홍영남 et al., 2008).또 다른 차이점에 대해 알아보면 남세균은 과도한 빛을 받을 때 광산화를 막기위해 카로티노이드 계 색소를 만들어내어 보호하며, 애기장대는 과도한 빛을 받을 때 광산화를 막기 위해 플라보노이드계 색소인 안토시아닌을 만들어내 보호하는 기작을 갖고 있다(홍영남 et al., 2008).이 실험을 통해 남세균과 애기장대의 형태적인 공통점과 차이점을 알아보며 이를 통해 두 생물 간의 연관성에 대해 알아보고, 남세균과 애기장대가 갖는 공통적인 색소와 다르게 갖는 색소들에 대해 알아보고 이를 통해 이 색소가 하는 역할들에 대해 알아본다.II. 재료 및 방법1. 남세균과 애기장대의 관찰애기장대 (Col-o type) 씨를 배지에서 발아시켜 화분에 옮겨 심은 뒤 약 51.0g/L; NaCl 30g/L; MgSO4 0.1g/L; CaCl2 0.04g/L; FeSO4 0.01g/L; EDTA 0.08g/L; Trace metal 1ml; pH9.5)에 풀어 광학 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 뒤 사진을 찍는다.2. 애기장대의 강광반응애기장대 (Col-0 type)의 종자가 담긴 튜브에 70% 알코올 1ml을 넣고 섞어 준 뒤 3차 증류수로 두 번 헹궈준다. 20% ROX 1ml 넣어 10~15분 vortexing하고 클린벤치 안에서 상등액을 제거한 뒤 멸균수 1ml로 헹궈주기를 5회 반복한다. 1/2 MS 배지에 소독된 씨를 약 30 개체를 파종한다. 호일로 싸서 4°C 냉장고에 3일간 둔 뒤 플레이트를 꺼내어 강한빛 (150umol/m2/s)과 보통빛(70umol/m2/s) 조건에 두고 2주간 배양한다. 유식물 30개체를 뽑아 무게를 재고, 300ul 7% HCl-MeOH를 넣어 저온조건에서 하룻밤 반응시킨다. 200ul의 3차 증류수를 넣고 잘 혼합한 뒤 400ul의 클로로포름을 넣고 5분간 vortexing 후 5분간 안정화한다. 상온에서 원심분리 하여 (12000rpm, 3분) 상등액 400ul를 새 튜브에 옮기고 600ul 1% HCl-MeOH를 넣는다. 가볍게 혼합한 뒤 상온에서 원심분리하여 (12000rpm, 3분) 상등액을 가지고 분광광도계에서 657nm와 530nm의 흡광도를 측정한다. 안토시아닌의 함량은 A657-A530/단위무게로 계산해낸다.3. 남세균의 강광반응15ml 튜브에 S배지 5ml을 넣고 배양된 남세균 Microcoleus를 50ul 접종하여 강한빛 (60umol/m2/s)와 보통빛 (30umol/m2/s)의 조건에서 약 3일간 배양한다. 각 조건의 남세균을 잘 풀어서 500ul를 덜어 1.5ml 튜브에 옮긴 뒤 상온에서 원심분리 (12000rpm, 3분)하여 상등액을 완전히 덜어낸다. 배지를 제거한 튜브에 1ml DMF를 넣고 약 30분간 어두운 조건에 둔다. 분광광도계를 이용하여 461nm,ophyllcarotenoid/ total chlorophyllcarotenoidchlorophyllcarotenoid/ total chlorophyll1조1.777.240.241.233.740.332조1.747.060.253.317.250.463조1.385.510.251.946.580.294조1.174.740.251.183.680.32빛의 세기를 조작변인으로 설정하고, 다른 조건들은 모두 통제변인으로 설정하여 배양한 남세균의 색소를 추출하여 흡광도를 통해 카로티노이드와 클로로필의 양을 구해본 결과 동일한 실험조건에서 배양한 4가지 샘플들의 카로티노이드와 클로로필의 양은 약간의 차이가 존재하였으나 전체 클로로필 당 카로티노이드의 양은 모두 비슷한 값을 나타냈으며, 빛의 세기를 조작변인으로 설정한 실험조건에서 배양한 각각 4가지 샘플들의 전체 클로로필 당 카로티노이드의 양을 비교해보면 강한 빛에서 배양한 실험군들이 더 높은 값을 나타냈으며, 강한 빛에서 카로티노이드가 더 많이 생성된다고 볼 수 있다.실험2. 애기장대의 강광반응빛의 세기를 조작변인으로 설정하고, 다른 조건들은 모두 통제변인으로 설정하여 7일간 배양한 애기장대의 색소를 추출하여 흡광도를 통해 단위무게 당 포함하고 있는 안토시아닌의 함량을 구해본 결과 동일한 실험조건에서 배양한 4가지 샘플들의 단위무게 당 안토시아닌의 함량은 큰 차이를 보였지만, 빛의 세기를 조작변인으로 설정한 실험조건에서 배양한 각각 4가지 샘플들의 단위무게 당 안토시아닌의 함량을 빛의 세기별로 평균을 내어본 결과 강한 빛에서 평균적으로 1.36배 많은 안토시아닌이 생성되는 현상을 볼 수 있다.실험3. 남세균과 애기장대 비교이질세포이질세포약 2주간 S배지에서 배양한 남세균 Microcoleus sp. B353으로 러시아의 바이칼호수에서 왔고 광학현미경을 통해 관찰한 결과 실형태로 자라나며, 분열하기 좋은 환경에서는 실형태의 세포들이 잘게 조각나서 길이생장을 시작한다.(그림 A) 약 2주간 S배지에서 배양한 남세균 Euhalothec를 포함한 소기관이 분해되어 투명하게 관찰된다.(그림 C) 약 2주간 S배지에서 배양한 남세균 Nodularia sp. S13Y로 490-570nm 사이의 초록빛을 쏘아주고 형광현미경을 통해 관찰한 결과 각각의 세포에서 파장이 더 높은 붉은 형광을 방출하는 것을 관찰할 수 있으며 이질세포에서는 형광을 방출하지 못하는 것을 관찰할 수 있다.(그림 D)X40X40잎맥세포애기장대의 성체를 관찰한 결과 가장 아래에는 로제트 잎이 땅과 수평으로 나있었으며, 줄기(꽃대) 옆으로 실리크와 잎들이 붙어 있었고, 줄기의 말단에는 꽃이 피어있었다.(그림 A) 애기장대의 꽃을 관찰한 결과 꽃의 크기가 줄기에 비해 매우 작았으며, 꽃잎은 총 4개로 갈래꽃이고 암술과 수술이 모두 있는 양성화이다.(그림 B) 애기장대의 실리크를 관찰한 결과주머니 모양의 구조로 안에는 작은 씨앗들이 들어있었고, 꽃에 비해 크기가 큰 구조이다.(그림 C) 애기장대의 잎을 광학현미경을 통해 확대하여 관찰한 결과 잎을 구성하는 세포들을 구조들을 관찰할 수 있었으며, 신장된 구조의 세포들이 모인 잎맥을 관찰할 수 있었다.(그림 D) 애기장대의 잎에 490-570nm 사이의 초록빛을 애기장대의 잎을 쪼여주고 형광현미경을 통해 관찰한 결과 초록빛을 받은 애기장대의 세포가 파장이 더 높은 붉은 형광으로 바뀌어 방출하는 현상을 관찰할 수 있었다.(그림 E)IV. 논의총 3가지의 실험을 진행하였으며, 이 실험을 통해 남세균과 애기장대의 형태적인 공통점과 차이점과 빛을 받았을 때 색소변화에 대해 알아보았다. 이러한 실험을 수행하면서 드는 의문점은 각각의 색소는 무슨 작용에 관여하고 왜 그러한 일이 일어나는지에 대한 의문이었다. 우선 실험3을 통해 관찰한 초록빛 영역의 파장을 쪼여주었을 때 형광현미경을 통해 관찰하면 붉은 형광이 나타나는 것은 어느 색소의 작용인지 의문점이 들었고, 이는 의 C와 D를 비교해 보면 엽록소가 없는 이질세포에서는 형광이 나오지 않는 것으로 보아 형광은 엽록소 색소에서 일어나는 현상일 것이라는

자연과학| 2021.02.25| 11페이지| 2,500원| 조회(182)

색소, 애기장대, 남세균, 형태적 특징, 세포생리학실험

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