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[바이러스학 실험] transfection

바이러스학 실험 2분반5주차 결과 레포트 :Transfection분반학과학번이름제출일Ⅰ. 실험 날짜2025. 04. 01.Ⅱ. 실험 제목TransfectionⅢ. 실험 목적바이러스를 만들기 위해 세포에 Plasmid DNA를 집어넣는 과정에 대해 이해하고 실습한다.Ⅳ. 실험 방법Cell Culture - Subculture 방법1. 실험하기 전날, cell을 6-well에 Seeding 한다. cell은 8 x 105 cell을 seeding하며 24시간이 지나기 전에 실험하도록 한다.2. 1.5mL tube를 2개 준비하여 각각 A solution(DNA 3ug + PBS 100ul), B solution(PEI 9ul + PBS 100ul)을 제작한다.3. 만들어진 solution을 pipet을 이용하여 섞어주고 20-30분 동안 혼합물이 반응하도록 대기한다.4. 만들어진 mixture를 seeding된 well에 골고루 분주한다.5. Transfection 이후 8시간 뒤, Fresh media로 교체한다.6. 2-3일 뒤에 결과를 확인한다.Ⅴ. 추가 조사1. TransfectionTransfection은 Cell 내부에 외래 유전자를 인위적으로 넣어주어 원하는 DNA가 발현되게 하는 실험 방법이다. DNA가 발현되면 결과적으로 Protein이 만들어지므로 이를 이용하여 Virus를 생산하며 다양한 Reagent를 이용하여 실험을 진행할 수 있다. 핵산은 강한 음전하를 띠기 때문에, 똑같이 음전하를 띠고 있는 진핵세포의 세포막을 통과시키기 위한 화학적 방법으로 양이온, 양이온 중합체, 양이온 리포좀(liposome)등이 사용된다(2).2. Transfection reagent1) 인산칼슘(calcium phosphate, CaPO4)인산 이온을 함유한 염수 용액을 transfection할 대상 DNA를 함유하는 염화칼슘 용액과 섞는다. 두 용액이 혼합되면, 양전하를 띠는 칼슘과 음전하를 띠는 인산염의 침전물이 형성되면서 그 표면에 표적 DNA를 결합시킨다. 침전물의 현탁액을 트랜스펙션 될 세포에 첨가하면 세포는 침전물의 일부와 표적 DNA를 흡수하게 된다(2). transfection 효율은 pH와 사용되는 nucleotided의 양에 크게 영향을 받으며 calcium phosphate transfection은 독성이 있어 primary cell line에는 적합하지 않다(3).Figure 1. CaPO4를 사용한 transfection(3).2) 양이온 중합체(cationic polymer)DEAE-dextran 같은 양이온 중합체는 음이온 물질인 DNA와 효율적으로 결합한다. 세포는 이러한 복합체를 endocytosis를 통해 내부로 가져간다(1).Figure 2. Catonic polymers를 사용한 transfection(3).3) Lipofection리포솜을 이용해 DNA를 전달하는 방법이다. 리포솜은 lipid bilayer로 구성되어 있기 때문에 세포막과 쉽사리 융합할 수 있다. 따라서 양이온 지질과 음이온 물질인 DNA를 결합시킨 이후 세포에 전달시켜 세포 내부로 DNA를 전달시킨다(1). 일반적으로 RNA나 DNA를 eukaryotic cells로 transfer하는데 사용된다. 그러나 lipofection의 효율은 cell type에 큰 영향을 받으며 primary 그리고 non-dividing cells의 경우 transfection 과정 후 생존율이 감소할 수 있다(3).Figure 2. liposome을 사용한 transfection(3).4) 덴드리머(dendrimer)덴드리머는 다수의 가지를 가진 복잡한 구조의 유기물질을 지칭한다. DNA와 결합한 후 세포 내로 이동하게 된다.Ⅵ. 참고문헌1. “형질주입.” 네이버 지식백과. n.d. 수정, 2025년 04월 01일 접속, https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5751174&cid=61233&categoryId=61233

자연과학| 2025.07.08| 4페이지| 1,000원| 조회(49)

바이러스학, Dendrimer, transfection reagent

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[미생물생태학실험] 배지 제조

미생물생태학 실험 실습 레포트학과: 학번: 이름: 분반: 배지 제조 (2주차)- Microbiome에 대한 개념을 학습한다.- Bacteria biofilm에 대한 개념을 학습한다.- Quorum sensing system과 관련한 이론적 개념을 학습한다.- 배지 및 멸균에 대한 개념을 학습한다.- LB broth 50mL 제조① 손의 크기에 맞게 장갑을 착용한다.② 실린더에 50mL DW를 넣고, 가루 날림을 방지하기 위해 약간의 DW를 flask에 첨가한다.③ 저울의 수평을 확인하고 전원을 켠 뒤, 계량 접시를 저울 가운데에 올려두고 영점을 맞춘다.④ Tryptone 1g, Yeast Extract 0.5g씩 시료 무게를 측정하고 flask 벽면에 묻지 않도록 첨가한다.⑤ 최종 volume에 맞게 DW를 flask에 첨가한다. 이때 flask 벽면에 묻은 시약을 씻겨 내려주며 첨가하도록 한다.⑥ Foil로 flask 입구를 덮은 뒤 labeling 한다.⑦ Flask 안의 solution을 골고루 혼합한다. 이때 과하게 흔들면 벽면에 시료가 묻을 수 있으니 주의한다.⑧ 멸균 테이프를 붙이고 Autoclave를 통해 배지를 멸균처리하고 사용하기 전까지 냉장 보관한다.※ 실험 유의사항- 시약 스푼을 이용하여 계량 접시 위에 시료를 덜어 무게를 측정한다. 이때 한 스푼당 한 시료에만 사용해야 하며, 무게를 초과한 시료는 다시 시약 통에 넣지 않도록 해야 한다.- 이번 실험에서 제작한 배지는 agar와 sodium chloride를 첨가하지 않은 LB broth이며 autoclave를 통한 멸균 과정을 거쳤다.미생물 배양 배지는 크게 화학적 요건과 물리적 요건으로 나누어 구분할 수 있다. 먼저 화학적 요건에 따라 배지의 화학적 조성 및 성분을 모두 정확히 표기할 수 있는 synthetic과 그렇지 않은 Nonsynthetic으로 구분할 수 있으며 물리적 요건에 따라 agar를 첨가하지 않은 Liquid(broth)와 agar를 첨가해 만든 solid 상태의 배지로 구분된다. 따라서 실험 목적에 따라 화학적 요건과 물리적 요건을 고려하여 알맞은 배지를 선택해야 한다. 이번 실험은 bacteria biofilm에 대해 이해하는 것이 목적이므로 bioflim을 관찰하기 위해 agar를 넣지 않은 LB broth를 제작했다.LB 배지는 일반적인 미생물 배양 배지로, 많은 범위의 미생물을 배양할 수 있다. LB 배지 제작 시에는 일반적으로 tryptone, yeast extract, sodium chloride(NaCl), distilled water(DW)를 첨가한다. 이때 tryptone은 단백질 영양분의 공급, yeast extract는 아미노산, 질소 및 무기염류 등의 영양분을 공급, NaCl은 적절한 염분 및 삼투압을 조절하는 역할을 한다. 이번 실험에서 제작한 LB 배지에는 NaCl을 넣지 않았는데, 이는 NaCl이 세포 내외의 삼투압에 영향을 주어 planktonic cell의 성장을 촉진하므로 biofilm이 감소할 수 있기 때문이다. 또한 이번에 제작한 LB 배지는 tryptone과 yeast가 포함되어 있어 미네랄과 유기물질과 이미 존재하므로 NaCl를 첨가하지 않아도 세균 성장에 큰 영향을 주지 않는다.

자연과학| 2025.07.08| 2페이지| 1,000원| 조회(90)

EDTA, Trypsin, yeast extract

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[미생물생태학실험] 정족수 감지(quorum sensing), biofilm 실험

미생물생태학 실험 실습 레포트학과: 학번: 이름: 분반: 생물막(3주차)- Quorum sensing system과 관련한 이론적 개념을 학습한다.- Bacteria biofilm 형성과정에 대한 개념을 학습한다.- 흡광도에 대한 개념을 학습한다.- A. baumannii 의 시간대별 biofilm 양상을 관찰하고, biofilm 형성 능력을 비교한다.시간대별 Biofilm 형성 및 관찰① 2개의 tube에 LB Broth를 4mL씩 넣고, 1개의 tube에는 wild type(WT)의 A. baumannii, 다른 튜브에는 ΔabaR A. baumannii의 colony를 접종한 후 30℃ shaking incubator에서 overnight culture를 진행한다.② 새로운 2개의 tube에 LB broth를 20mL씩 넣고, 1개의 tube에는 ①번에서 배양한 WT A. baumannii 400μl, 다른 tube에는 ΔabaR A. baumannii 400μl를 첨가하여 배양한 균 (WT, ΔabaR)을 50배 희석한 후 96 well plate에 희석한 각 균 200μl를 넣고 OD600 값을 0.05~0.06으로 맞춘다.③ 새로운 12개의 tube에 (WT, 시간)으로 labeling을 하고, OD값을 맞춘 WT A. baumannii를 1mL씩 첨가한다. 또 다른 새로운 12개의 tube에 (ΔabaR, 시간)으로 labeling을 하고, OD값을 맞춘 ΔabaR A. baumannii를 1mL씩 첨가한다. 각 tube는 biofilm을 관찰하고자 하는 시간대를 의미한다.④ ②번 및 ③번 tube를 37℃에서 정치배양 후, 관찰하고자 하는 시간이 되었을 때 ③번 tube 속 상등액을 제거하고 DW로 2-3회 washing한다. 이때 biofilm은 tube 벽면에 형성되므로 벽면을 건드리거나 흔들어선 안 된다.⑤ 0.1% gentian violet 1.4mL를 첨가한 다음 15min 동안 염색한다. gentian violet에는 에탄올이 첨가되어 있으므로 불과 접촉하지 않도록 주의하도록 한다.⑥ 염색될 동안 균의 성장 정도로 알아보기 위해 ②번 tube 균의 OD600을 측정한다.⑦ 상등액(염색약)을 제거한 후, DW 3mL를 이용하여 남아있는 염색약을 washing한다.⑧ 염색된 biofilm 눈으로 관찰한다.⑨ 생성된 biofilm을 extraction하여 흡광도를 통해 biofilm 형성 능력을 정량화한다.Figure 2. △abaR A. baumannii를 168hr 배양 후 관찰한 사진Figure 3. 168hr 배양한 WT A. baumannii와 △abaR A. baumannii를 gentian violet을 통해 염색한 후 관찰한 사진이번 실험에서는 A. baumannii의 wild type(WT) 균주와 ΔabaR 균주를 각각 배양하여 gentian violet 염색약으로 염색한 뒤 두 균주 간의 biofilm 형성 능력을 비교하였다. bacterial biofilm이란 미생물이 당, metabolite 등과 같은 여러 가지 materials와 함께 세포외 중합체를 밖으로 분비하여 형성되는 얇은 막이다. biofilm이 형성되면 미생물은 막 안에 존재하게 되며 UV나 toxin과 같은 stress 요인으로부터 내성을 가지게 되어 집단적 defense 기능으로 생존에 유리해진다. biofilm은 습도가 높고 당, 단백질 등의 양분이 풍부한 조건에서 잘 형성되며 종마다 형성 환경과 필요 양분 등의 조건이 모두 다르다. 따라서 biofilm은 세균의 종류와 사용하는 배지에 따라 형성된다. biofilm 실험에는 주로 LB media가 사용되며 간혹 LB media에서 biofilm을 형성하지 않을 시 minimal media를 사용한다. bacteria biofilm의 형성은 quorum sensing(QS)을 통해 이루어진다.세포 집단 밀도의 변화에 따라 분비하는 신호 물질을 autoinducer라고 한다. 세포의 membrane에는 autoinducer를 인식하는 고유 receptor protein이 존재하며 autoinducer가 분비되면 세포는 autoinducer를 인지하고, cell 밀도에 따라 내부에서 전사 조절 단백질인 regulator protein에 의해 유전자 발현 조절이 조절된다. 이러한 과정을 quorum sensing이라고 한다. bacteria는 quorum sensing mechanism을 통해 cell간 정족수 즉, 세포 밀도를 인식하여 biofilm을 형성하며 cell-cell conjugation 조절을 통한 plasmid DNA 수용능 조절, 병독성(virulence) 촉발 기능 등을 수행한다.이번 실험에서 사용한 △abaR A. baumannii 균주는 quruom sensing에 관여하는 유전자인 abaR 유전자가 결실된 돌연변이 균주이다. 따라서 △abaR A. baumannii 균주의 경우 QS이 원활하게 이루어지지 않아 WT에 비해 biofilm의 생성 및 탈착이 더딜 것으로 예측해 볼 수 있다. 3조에서 WT와 △abaR 균주를 168hr 배양한 후 관찰하였을 때(Figure 1, 2.) 두 균주에서 모두 biofilm이 형성된 것을 확인할 수 있었으나 실험 결과 사진상에서 그 차이가 뚜렷하게 확인되지 않았다. 이러한 결과의 원인으로 예측 결과와 동일하게 실험이 진행되었을 경우 실험 결과 사진 속에서 차이가 확인되지 않는 것은 두 사진을 촬영한 각도와 빛의 방향의 차이 때문일 수 있으며 예측과 다른 결과가 나왔다면 QS이 원활하게 이루어지지 않는 △abaR 균주의 특성에 의해 biofilm의 탈착이 제대로 이루어지지 않았기 때문이라는 추측을 해볼 수 있다. 따라서 실험 결과 확인 시 더욱 면밀한 관찰과 추후 비교를 위해 동일한 환경에서의 사진 촬영이 중요함을 느낄 수 있었다. gentian violet 염색 후 관찰한 사진(Figure 3.)에서는 WT 균주보다 △abaR 균주에서의 biofilm이 더 진하고 두꺼운 것을 확인할 수 있다. 이 또한 위와 같은 이유로 △abaR 균주에서 biofilm의 탈착이 제대로 이루어지지 않았기 때문이거나 혹은 gentian violet 염색 이후 DW를 이용한 washing이 제대로 되지 않아 이러한 결과가 나온 것이라 추측해 볼 수 있다. 따라서 제대로 된 실험 결과와 비교를 위해 보다 정확한 실험 과정의 수행이 중요하는 것을 이번 결과를 통해 확인할 수 있었다.

자연과학| 2025.07.08| 4페이지| 1,000원| 조회(85)

quorum sensing, 쿼럼센싱, 바이오필름, biofilm, AHL, 정족..

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[바이러스학 실험] virus titer, FACS

바이러스학 실험 2분반12주차 결과 레포트 :Virus Titer, FACS분반학과학번이름제출일Ⅰ. 실험 날짜2025. 05. 20.Ⅱ. 실험 제목Virus Titer, FACSⅢ. 실험 목적1. Infection을 진행한 이후에 virus가 얼마나 존재하는지를 수치화 할 수 있다.2. FACS를 통해 형광을 띄는 세포를 count 할 수 있다.Ⅳ. 추가조사1. Luminometerluminometer는 photomultiplier tube(PMT)를 통해 sample에서 나오는 가시광선의 약한 방출을 측정하는 기기이다. fluorometer와 달리 luminometer로 측정하는 sample는 화학반응으로 스스로 빛을 방출하기 때문에 일반적으로 lamp나 excitation optics가 필요하지 않다(1).1) Luminometer의 원리Luminometer는 적은 양의 빛을 측정하기 위해 photomultiplier tube(PMT)를 사용하며 PMT는 들어오는 신호를 증폭시켜 약한 신호를 감지할 수 있게 한다. 최대한 많은 양의 광자를 얻기 위해서 PMT는 sample에 매우 가깝게 배치되어야 하고 광자의 손실을 줄이는 최적화된 위치에 배치되어야 한다. PMT 외에도 dark chamber와 injector가 필요하다. sample를 측정하는 공간은 외부 빛으로부터 완벽하게 보호되어야 하며 injector는 항상 필요한 것은 아니지만, 화학반응에 의해 발광이 발생하기 때문에 sample에 시약을 첨가해야 하므로 필요할 수 있다. 대부분의 luminometer는 모든 파장의 빛이 모여 측정되므로 filter나 monochromator가 필요하지 않다(1).2) Luminometer의 종류Tube Luminometer은 sample를 하나씩 측정하는 간단한 기기로, 작업자가 수동으로 삽입해야 한다. 처리량에 제한이 있지만 높은 감도와 신뢰성을 제공한다(1). Benchtop Tube Luminometers, Portable Luminometers, Hand-held luminometers 등이 있다(1).2. Luciferaseluciferase는 기질인 luciferin을 산화시켜 bioluminescence을 일으키는 산화효소들의 총칭이다(2). 생물발광은 해양 동물, 반딧불, 버섯 그리고 발광세균에서 발견된다. 특히, 발광세균에는 Photobacterium 속, Aliivibrio 속, Vibrio 속 등이 포함된다(3). luciferase의 활성은 기질인 luciferin을 공급하고 발생하는 빛을 luminometer로 측정하여 분석한다. luciferase의 생물발광은, fluorescence와 달리 빛 공급이 필요 없기 때문에 발광 측정 시 생물체에서 autofluorescence를 피할 수 있는 장점이 있다(2).1) 세균 luciferase의 발생기작대부분의 발광세균은 통성 호기성 세균이지만, 발광 메커니즘은 산화반응을 통해 화학적 반응을 일으키기 때문에 산소가 있을 경우에만 생물발광을 한다. luciferase는 촉매로 작용하며, FMNH2, 산소 및 RCHO를 기질로 사용한다. 전자공여체는 NADH이다(3).Fig. 1. 세균의 생물발광 반응(2)2) 세균 luciferase의 조절기작세균의 개체 수에 따라서 유전자 발현의 변화가 일어나는 현상을 quorum sensing이라고 한다. 이 과정은 lux 오페론에 의해서 진행되는데, LuxR은 활성자 단백질의 역할을 하고 Luxl는 신호 물질을 생성해 내는 효소 유전자이며, luxCDABEG는 빛을 내게 하는 구성 유전자이다. LuxR에서 만들어진 활성자는 반드시 신호 물질에 의해서 활성화가 된다. 이 신호물질은 N-acyl homoserine lactone 계열의 화합물인 homoserine lactone이다. 이 화합물을 AHL이라고 하는데, AHL 물질이 LuxR과 결합을 하게 되면, 프로모터로부터의 전사를 활성화시켜 결과적으로 빛을 내는 단백질인 luciferase를 만들어낸다. 이렇게 생성된 luciferase는 FMNH2, 산소 및 RCHO와 반응하여 빛을 발생하게 된다. 따라서 quorum sensing에 의해 luciferase의 생성이 조절되어 빛의 발생을 조절하게 된다(3).Ⅴ. 참고문헌1. Berthold Technologies GmbH & Co.KG, “Luminometer.” Berthold Technologies. accessed May 20, 2025, https://www.berthold.com/en/bioanalytic/knowledge/glossary/luminometer?utm_source=chatgpt.com

자연과학| 2025.07.08| 3페이지| 1,000원| 조회(49)

바이러스학, luciferase, LUMINOMETER

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[바이러스학 실험] SDS-PAGE, western blot

바이러스학 실험 2분반11주차 결과 레포트 :SDS-PAGE, Western blot분반학과학번이름제출일Ⅰ. 실험 날짜2025. 05. 13.Ⅱ. 실험 제목SDS-PAGE, Western blotⅢ. 실험 목적전기영동 후 염색과 항체를 통하여 원하는 단백질의 발현 유무를 확인한다.Ⅳ. 실험 방법1. Protein & gel을 준비한다.2. SDS-PAGE - 120V 90 min3. Transfer ? 140A 60min4. Washing (by TBS) 10min5. Blocking - (TBS-T + 5% skim milk) 2h6. Washing (by TBS-T) 10min X3 ? 각 단계마다 진행한다.7. Primary antibody로 Antigen-antibody reaction (skim milk + 항체 1:5000) overnight8. Secondary antibody로 Antigen-antibody reaction (skim milk + 항체 1:5000) 120 min9. DAB solution reaction 5 minⅤ. 추가조사1. Western Blotgel 상에서 크기별로 단백질을 분리한 다음 항원-항체 반응을 통해 특정 단백질을 Detection 하는 실험이다. 항체를 Gel 상의 protein과 결합시키는 것은 어려우므로 항체가 잘 붙는 Membrane으로 옮기는 Transfer 과정 후 진행한다.2. Transfer에 사용되는 membrane1) Nitrocellulose(NC)한 번에 많은 항체를 흡착시키며 항체 검출감도가 좋고 형광물질에 안정하다(2). 단백질이 공유결합되지 않으며 건조할 때 쉽게 부서질 수 있다는 단점이 있다(1). 단백질 결합 용량은 80?100μg/cm2이다(3).2) Polyvinylidene fluoride(PVDF)단백질 결합력, 물리적 강도 및 화학적 안정성이 높다(1). 단백질 및 핵산에 대해 높은 결합 친화력을 가지기 때문에 western blot, southern blot, northern blot 등에 사용할 수 있다. nitrocellulose보다 부서지거나 깨질 가능성이 적으며 새로운 항체 조합을 사용하여 다양한 표적에 대해 여러 차례의 재처리(stripping 및 reprobing 절차)가 필요한 western blot 실험에 유용하다. 소수성이 매우 강하며 transfer buffer에 담그기 전에 메탄올 또는 에탄올에 미리 적셔야 한다. 단백질 결합 용량은 170?200μg/cm2이다(3).Figure 1. Difference Between Nitrocellulose and PVDF Membrane(4).Ⅵ. 참고문헌1. Kurien, Biji T., and R. Hal Scofield. "Western Blotting." Methods 38, no. 4 (2006): 283?293.2. Labiskoma. "Transfer Membrane." Labiskoma. Accessed May 13, 2025. https://www.labiskoma.co.kr/electrophoresis/transfer-membrane/.3. Thermo Fisher Scientific. "웨스턴 블로팅 트랜스퍼 방법." Thermo Fisher Scientific. Accessed May 13, 2025. https://commerce.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html.4. Pediaa.com. "What Is the Difference Between Nitrocellulose and PVDF Membrane." Pediaa, accessed May 13, 2025. https://pediaa.com/what-is-the-difference-between-nitrocellulose-and-pvdf-membrane/

자연과학| 2025.07.08| 4페이지| 1,000원| 조회(78)

SDS, Western blot, PVDF

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