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[A+] 연세대학교 생화학실험(2) 3주차 Plasmid and Plasmid DNA preparation

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자연과학| 2023.08.01| 4페이지| 1,000원| 조회(112)

생화학, 실험, 연세대, 연세대학교, 생명과학, 생화학실험, 생화실, 생화실1, 생시대, 생화학실험2

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[10점/A+] 연세대학교 공학생물학 및 실험I 3주차 단백질의 정량

실험 3. 단백질의 정량공학 생물학 및 실험I. 이론적 배경1. 단백질단백질은 생체 내 거대 분자들 중 하나로, 거의 모든 생명체의 역동적인 기능은 단백질에 의존한다. 단백질은 대부분의 세포에서 건조 질량의 50% 이상을 차지하는 만큼 다양한 기능을 수행한다. 대표적인 기능을 가진 단백질들은 효소 단백질, 방어 단백질, 저장 단백질, 수송 단백질, 호르몬 단백질, 수용체 단백질, 수축 및 운동 단백질, 구조 단백질이 있다.1) 단위체모든 단백질은 20개의 아미노산으로부터 조합되어 만들어지는 중합체이다. 아미노산의 중합체를 폴리펩타이드(polypeptide)라 부르고, 단백질(protein)은 각기 접히거나 꼬여 특이한 3차원적 구조를 가지는 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드로 이루어져 생물학적 기능을 갖는 분자이다.모든 아미노산(amino acid)은 공통적인 구조를 가지게 되는데, 이는 카르복실기, 아미노기, 곁사슬, 수소, 알파 탄소로 이루어져 있다.2. Bradford 단백질 정량법 (Bradford Protein Assay)Bradford 단백질 정량법은 분광광도계를 이용하여 용액 속에 함유되어 있는 단백질의 양을 분석하는 방법이다.1) 원리이 정량법의 원리는 쿠마시블루 G-250 (Coomassie Blue G-250) 염색약을 이용하여 용액 별 흡광도 차이를 이용하는 것이다. 기존의 붉은 색이었던 Coomassie Blue 염색약은 산성 조건에서 푸른 색으로 바뀌며 단백질과 결합하게 된다. 이때 Coomassie Blue – Protein complex가 형성되는 과정에서 붉은 색을 띠는 Coomassie Blue가 단백질에게 전자를 제공하며 단백질의 소수성 부위가 외부로 노출된다. Coomassie Blue G-250 염색약과 단백질의 소수성 부위는 반데르발스 힘으로 비공유 결합을 이룬다. 또한, 단백질의 양전하를 띠는 아민기와 Coomassie Blue G-250의 음전하를 띠는 부위가 이온 결합을 하게 되며 Coomassie Blue – Pro 이를 구할 수 있다. 595nm에서의 흡광도는 Coomassie Blue – Protein complex가 많을 수록 높아지고, 이는 용액 속의 단백질 농도와 관련이 있다.2) 분석 방법BSA solution을 이용하여 . 단백질의 농도를 x축, 흡광도를 y축으로 가지는 표준곡선을 그린다. 엑셀을 이용하여 추세선을 그리고, 값이 1에 가까운지 확인한다. 측정한 흡광도를 y값에 대입하여 단백질의 농도, x값을 구한다.II. 실험 목적세포 내의 여러가지 기능을 담당하는 단백질의 중요성에 대해 알아보고, 비교적 간단한 방법으로 미지의 시료에 들어있는 단백질의 정량을 분석할 수 있다.III. 실험 준비물1) 미지 시료- 우유2) Protein Reagent (Bradford Reagent)a. 50ml의 methanol에 50ml의 Coomassie Blue G-250을 용해시킨다.b. 85%의 100ml를 a. 용액에 첨가한다.c. 용액의 총량이 200ml가 되도록 증류수를 넣어준다.d. 4 에서 보관한다.e. 실제 사용시 농축액 부피 4배의 증류수를 첨가하여 희석해서 사용한다.3) Protein Standard- 1mg/1ml 농도의BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma) solution4) 실험기구- Spectrophotometer, cuvettes, micro pipetteIV. 실험 방법1. 단백질 양을 모르는 미지의 시료, 우유를 증류수를 이용하여 0, 1/5000, 1/2500, 1/1000, 1/500, 1/100의 비율로 희석한다. 이 때, 최종 부피가 10mL가 되도록 한다.* 증류수와 우유가 잘 섞이도록 주의한다.2. BSA Solution을 각각 0, 10, 20, 40, 60, 100 씩 microcentrifuge test tube에 분주한다.3. 2번 과정의 각 용액에 증류수를 더해 최종 부피를 200 로 제작한다.4. 3mL의 5X Bradford Reagent에 증류수 12mL를 첨가하여 희석해준다.5. 새로운 miuge tube에 950의 1X Bradford reagent를 각각 분주해준다.7. 거품이 생기지 않도록 시험관을 천천히 뒤집어주며 섞어준다. 5분 정도 기다린 후, 발색을 확인한다.8. 증류수를 cuvette에 담아 UV-vis spectrophotometer에서 흡광도를 측정하여 blank를 잡아준다.9. standard solution의 흡광도를 측정하여 기록하고,10. 7번 과정에서 완성된 용액을 cuvette에 담아UV-vis spectrophotometer로 595nm 파장에서 흡광도를 측정한다.V. 실험 결과[미지 시료(우유)의 단백질 농도 찾기]비율01/50001/25001/10001/5001/250흡광도0.4490.4820.4890.5420.5991.002보정 값00.0330.0400.0930.1500.553농도(%)0-1.800-1.4740.9913.64222.39[표준 곡선 그리기]BSA ()01020406080100농도 (%)*************96nm 흡광도0.4330.6440.7920.9201.1211.4021.560보정 값00.2110.3590.4870.6880.9691.127-VI. Discussion미지의 시료 (우유)의 단백질 농도 구하기1) 추세선 분석- 추세선의 값은 0.9856으로, 0.99 미만의 값이 나왔다. 일반적으로 의 범위일 때 표준 곡선이 실제 값과 매우 유사하다고 볼 수 있다.- 의 추세선을 구할 수 있었다. 축은 BSA의 농도, 축은 흡광도로, 우유의 희석 배율에 따른 흡광도 값을 y에 대입하여 나오는 값으로 단백질의 농도 를 구할 수 있다. 즉, 임을 알 수 있다.2) 단백질 양 계산하기- 음수의 농도가 나온 결과 값을 제외하고 단백질의 양을 계산해보았다. 우선 1/1000 비율로 희석된 용액의 흡광도 0.093을 이용하여로 10ml의 우유에 있는 단백질을 계산할 수 있었다.1/500의 비율로 희석된 용액의 흡광도는 0.150 으로,마지막으로 1/250의 비율로 희석된 용액의 흡광도는 0.553으로,오 20%, 30%, 40%, 50%의 농도에서만 흡광도를 측정하여 추세선을 이용하여 계산했기 때문에 실제 값과 오차가 발생하였을 것이다.또한, 우유는 지방, 단백질, 칼슘 등의 구성성분들이 고르게 퍼져 있지 않은 불균일 혼합물이기에 희석하는 과정에서 사용된 우유에 단백질이 균일한 농도로 존재한다고 볼 수 없다.VII. Further Study1. BSA 이외의 Bradford assay에 사용될 수 있는 기준 단백질은 어떠한 것들이 있는가? 이러한 기준 단백질의 공통적인 특징은 무엇인가?Bradford assay에 사용될 수 있는 기준 단백질에는 BSA(Bovine Serum Albumin) 외에도 BGG(Bovine Gamma Globulin)이 있다. BGG는 소의 혈장 단백질에 존재하는 globulin 이다. globulin은 혈액을 구성하는 글로불린 단백질의 한 종류로써, 우리 몸의 면역체계의 주 구성성분이다. IgA, IgD, IgM, IgE, IgG 다섯 종류가 존재한다.BSA와 BGG의 공통적인 특징으로는 우선 모두 소의 혈장 단백질이라는 것을 알 수 있다. 또한, 염색약의 음전하를 띠는 부위와 아미노산의 양전하를 띠는 부위가 결합하여 Coomassie Blue – Protein complex가 생성된다는Bradford assay의 원리를 살펴보았을 때, 기준 단백질은 양전하를 띠는 아미노산 양이 많을 것이다. 리신, 아르기닌, 히스티딘과 같이 아미노기를 가지는 아미노산을 다량 가지는 단백질을 기준 단백질로 사용한다면, 강한 이온 결합으로 Coomassie Blue – Protein complex이 잘 형성되어 Coomassie Blue의 파란 색으로의 색 변화가 안정적으로 유지될 것이다.2. Bradford assay 외에 시료내 단백질의 양을 재는 방법은 무엇이 있는가? 어떠한 생화학적 반응에 의해 이들 assay가 진행되는가?1) BCA assayBCA assay는 앞선 Lowry assay를 개량한 방법으로, folin agent와 의 반응질 용액의 peptide bond에 의해 가 로 환원되며, 이때의 의 양은 단백질의 양과 비례함을 알 수 있다. 두 번째 단계에서는 두 분자의 BCA가 와 배위결합하여 complex를 형성한다. 이 복합체는 562nm에서 강한 흡광도를 나타내며, spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 단백질의 양을 구할 수 있다.BCA에 의한 단백질 정량은 계면활성제에 의한 영향을 받지 않는다는 장점이 있으나, 킬레이트 계 물질의 영향을 받는다는 단점이 있다.2) Lowry assayFolin assay와 Biuret 반응을 조합하여 고안한 단백질 정량 방법이다. Folin assay는약 pH 10 의 염기성 용액에서 단백질 용액을 Folin-Ciocalteu reagent와 반응시키면 aromatic protein residue가 산화되며 용액이 청람색으로 변하는 것을 이용하여 단백질을 정량하는 방법이다. 이를 peptide 결합과 염기성 상태의 에 의해 가 로 산화되는 것으로 개량하여 단백질을 정량하는 방법을 Lowry assay 라고 한다.그러나 사용하는 단백질의 종류에 따라 0.01-1.0mg/ml의 측정범위가 변할 수 있고, Folin-Ciocalteu 반응을 방해하는 물질들이 존재한다면 제거하거나 보정해주어야 한다는 단점을 가지고 있다.VIII.참고 문헌대표역자 전상학. 2016. Campbell Biology 10th Edition. 바이오사이언스출판대표역자 정종우. 2018. 생명:생물의 과학. 라이프사이언스BCA assay; Hyperlink "https://www.takara.co.kr/web01/product/productList.asp?LCode=T9300A" https://www.takara.co.kr/web01/product/productList.asp?LCode=T9300AGammaglobulin; Hyperlink "http://amc.seoul.kr/asan/healthinfo/easymediterm/easyMediTermDetail

공학/기술| 2023.03.19| 8페이지| 1,000원| 조회(236)

연세대, 공학생물학및실험, 공생실, 공생실(1), 공학생물학및실험(1)

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[10점/A+] 연세대학교 공학생물학 및 실험I 4주차 효소 활성 측정

실험 4. 효소(Enzyme)의 활성 측정공학 생물학 및 실험I. 이론적 배경1. 효소(Enzyme)일반적으로 거대한 단백질인 효소(enzyme)는 생물학적 반응의 촉매(catalyst)로 작용하는 화합물이다. 다른 모든 촉매처럼 효소는 반응의 평형 상수에 영향을 주지 않는다. 효소는 단지 활성화 에너지를 낮추는 역할을 하고, 따라서 반응을 보다 빠르게 일어나도록 만든다.1) 기질 특이성일반적으로 과학자들이 실험실에서 사용하는 일반 촉매와는 다르게 효소는 그 작용에 특이성을 가진다. 효소는 효소의 기질(substrate)이라고 부르는 단일 화합물의 특정 반응만을 촉진시킨다. 예를 들어, 사람의 소화기관 내에서 발견되는 amylase는 단지 녹말의 가수분해를 촉진하여 glucose를 생성하고, cellulose 등 다른 다당류는 amylase에 의해 영향을 받지 않는다. 이러한 현상을 관찰할 수 있는 이유는 효소는 단백질이며, 고유한 3차원 구조를 가지는 거대분자라는 데에서 찾을 수 있다. 즉, 효소의 특이성은 아미노산 서열이 만들어 내는 최종적 결과인 분자 모양으로 인해 생긴다.효소는 기질에 결합하여 효소-기질 복합체(enzyme – substrate complex)를 형성한다. 기질이 활성 부위에 들어가면 단백질과 약한 결합을 형성하고, 단백질의 모양 변화를 유도하게 된다.2) 활성화 에너지 장벽어떤 반응을 시작하기 위해 초기에 투입되는 에너지, 즉 반응분자체를 뒤틀게 해서 결합을 절단 시키기 위해 요구되는 에너지를 활성화 에너지(activation energy)라 한다. 활성화 에너지는 대부분 반응 분자들이 주변으로부터 받아들이는 열에너지의 형태로 공급이 되며, 열에너지의 흡수는 반응 분자들을 가속화시켜 잦은 충돌이 일어나게 만든다. 또한, 결합이 절단될 가능성을 높여준다. 결합을 끊기 위한 충분한 에너지를 분자들이 흡수하게 되었을 때의 상태를 전이 상태(transition state)라 부른다.활성화 에너지는 반응의 속도를 결정하는 장벽을 제공한다. 따라활용한다. 즉, 효소는 온화한 온도에서도 전이 상태에 도달할 수 있도록 활성화 에너지 장벽을 낮추는 기작을 통해 반응을 촉매한다.3) 보조 인자(cofactor)많은 효소의 촉매 활성은 보조 인자(cofactor)라 부르는 작은 분자들의 존재에 영향을 받는다. 보조 인자를 가지지 않은 효소를 결손 효소(apoenzyme)라고 하고, 보조 인자를 갖춘 완전한 촉매의 활성을 가진 효소를 완전 효소(holoenzyme)라고 부른다. 보조 인자들은 크게 두 가지, 금속들과 보조 효소(coenzyme)라 하는 유기분자들로 분류할 수 있다.2. 미카엘리스-멘텐 식 (Michaelis-Menten Kinetics)미카엘리스-멘텐 식은 효소-촉매 반응의 속도에 관한 연구 분야인 효소 반응속도론(enzyme kinetics)에 관한 모델 중 하나이다.미카엘리스-멘텐 반응속도론은 효소에 대한 기질의 농도 [S]의 함수로서, 반응 속도 가 최대 속도 에 점근적으로 접근한다는 것을 보여준다.[S] : 기질(substrate)의 농도[E] : 효소(enzyme)의 농도[ES] : 효소-기질 복합체(enzyme-substrate complex)의 농도[P] : 생성물(product)의 농도: 최대 반응 속도 상수: 미카엘리스 상수(Michaelis constant)1) 유도효소 E는 속도상수 으로서 S와 결합하여 ES 복합체를 형성한다. ES 복합체는 속도상수 로서 E와 S로 해리하거나, 속도상수 로서 생성물 P를 형성하는 반응을 진행할 수 있다. ES 복합체 또한 를 갖는 역반응에 의해 E와 P로 다시 형성될 수 있지만, 생성물의 형성이 무시할 정도로 적고 따라서 역반응이 일어나지 않는 0에 가까운 시간에서의 반응속도를 고려하여 단순화하였다.는 P가 축적되기 전 초기 시간에 생성물 형성의 속도를 측정함으로써 각각의 기질 농도를 결정할 수 있다. 우선, 촉매 반응의 속도가 ES 복합체의 농도와 ㅇ의 곱과 같다고 둔다.[ES]를 알고있는 값으로 나타내기 위해정류상태 가정(steady r때, 즉 일 때 얻어진다.이를 위의 식에 대입하면 미카엘리스-멘텐 식을 유도할 수 있다.2) 해석기질의 농도가 낮은 조건에서 [S]가 보다 훨씬 작으면 가 된다. 이 반응은 기질의 농도에 정비례하는 속도를 갖는 일차 반응이다. [S]가 보다 훨씬 큰 기질 농도에서 , 즉 속도는 최댓값을 가진다. 이는 영차 반응이며 기질의 농도와는 무관하다.이 가지는 의미는 로 놓았을 때 가 되며, 은 반응속도가 최대값의 절반일 때의 기질 농도와 같다.3. 라인위버-버크 도면 (Lineweaver-Burk plot)미카엘리스-멘텐 식을 직선으로 작도되는 식으로 변환하고, 와 을 구할 수 있다 .의 도면은 를 y-절편으로, 기울기를 로 갖는 직선으로 그려진다.II. 실험 목적실험을 통해 효소의 Michaelis 상수 ()를 계산할 수 있으며, 효소의 활성에 영향을 미치는 요인 – pH와 온도 을 변화시켰을 때 효소의 반응 속도가 어떻게 변하는지를 비교하여 최적 pH와 온도를 알아본다.III. 실험 준비물Catalase extract; Sliced potato기질(substrate) 용액; 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 용액, 0.25% SDS, 1% glycerol완충(buffer) 용액; 50mM pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 Na-phosphate 용액Temperature factors; Ice, room temperature environment, boiling water15ml 시험관, 초시계IV. 실험 방법[pH 변화 - 효소의 반응속도]catalase extract의 제작; 감자를 강판에 갈아 거즈로 걸러 catalase extract 제작1번 과정에서 제작한 catalase extract 1ml를 pH5, 6, 7, 8, 9의 각 완충 용액 1ml와 섞는다.room temperature에서 1ml의 20% 용액과 0.25% SDS와 1% glycerol를 섞어 기질용액을 만든다.2번 용액의 시험관에 3번 용액을 넣고 timer로 거품이 시험관을 넘치기과정의 두 용액을 각각의 온도에서 반응시킨다.두 용액을 섞은 직후부터 생성된 거품이 시험관을 가득 채울때 까지의 시간을 기록한다.[효소 반응 속도의 측정]Catalase extract 10ml를 1번 실험 결과의 최적의 pH 완충 용액 10ml와 섞은 후 2번 실험에서 구한 최적의 온도를 나타내는 Incubator에 넣고 5분간 반응시킨다. 즉, pH 9 완충 용액과 혼합한 catalase extract를 시험관에 담고 37 에서 5분간 둔다.1ml의 기질 용액(20% 용액과 0.25% SDS와 1% glycerol) 을 15ml test tube에 넣은 후 catalase extract을 넣은 incubator에 5분간 넣고 온도를 맞추어 준다.두 용액을 섞은 직후부터 생성된 거품이 시험관을 넘치기 직전까지의 시간을 측정한다.V. 실험 결과[pH 변화에 따른 효소의 반응속도]pH시간 (s)반응속도(ml/s)5603.336605.837421.078331.369291.55*pH 5 buffer를 첨가한 효소는 60초에 최대 높이 4.0을, pH 6 buffer를 첨가한 효소는 60초에 최대 높이 5.5를 도달했다. 그 외의 pH buffer는 최대 높이 6.5에 도달하는데 걸린 시간을 측정한 것이다.[온도 변화에 따른 효소의 반응속도]실험 환경실험 결과반응 속도(ml/s)끓는 물60초까지최대 높이3.01.673736초경 최대 높이 6.0RT42초경 최대 높이 6.0얼음60초까지 최대 높이 5.5*끓는 물에서의 실험은 거품이 거의 생기지 않았다.[효소 반응 속도의 측정]기질 용액의 농도 (%)시간 (s)반응 속도(ml/s)538109.3154.8203.1252.2301.42.14[값 유도하기]1) 기질 농도 구하기%[S]1/[S]1/50.9 M1.1112.67101.5M0.673.10152.2M0.451.60202.9M0.341.03253.7M0.270.742) 라인위버-버크 도면 그리기3) 계산하기Y절편기울기4) 최적의 조건에서 카탈레이스가 분해할 수 있는 의 서 반응이 잘 일어나지 않은 결과를 볼 수 있었는데, 이 이유로는 갈아서 만든 감자 용액을 실온에 두고 실험을 진행했기 때문이라고 추측할 수 있었다. Catalase는 체온에서 큰 활성을 보이기 때문에 실험하지 않을 때에는 catalase의 활성이 일어나지 않도록 낮은 온도에서 보관을 해야한다. 그렇지 않다면 catalase의 활성으로 인해 용액과의 반응이 충분히 일어나지 않을 수 있다.위의 세 가지 실험 결과를 바탕으로 catalase의 활성은 pH 9, 37의 환경에서 기질의 양이 증가할수록 반응 속도가 빨라진다는 결론을 내릴 수 있었다.실험값을 통해 구한 과 의 값이 음수가 나와, 큰 오차가 생겼다는 것을 볼 수 있었다. 오차가 생기는 원인으로는 모든 기질의 농도 값에서 실험을 하지 않고, 농도가 다른 5가지의 기질 용액의 실험 데이터를 가지고 계산을 했기 때문이라고 생각한다. 대표적인 다섯 가지의 값으로는 정확한 일차식 직선의 그래프가 나오지 않았기에 추세선을 사용하여 과 의 값을 구했으므로, 진정한 값이 아니라고 볼 수 있다. 실험 데이터를 다른 농도의 용액에서도 여러 번 반복하여 계산한다면 더 정밀한 값을 얻을 수 있을 것이다.VII. Further Study1.효소는 촉매 반응을 기준으로 크게 6가지 – 전이 효소, 분해-부가 효소, 가수분해 효소, 산화환원 효소, 이성질화 효소, 합성효소 로 분류하는데, 이중 Catalase는 가 물과 산소로 분해되는 반응을 촉매하므로 산화환원 효소에 속한다.Catalase의 4차 구조는 4개의 polypeptide chain으로 구성되어 있으며, Fe-porphyrin을 포함한 heme을 가지고 있어 산화환원 반응을 일으킨다.2.과산화수소 용액에 SDS와 glycerol이 첨가되어 있는 이유는 catalase의 변성을 막고, 안정화를 위해서이다. 단백질 성분의 효소는 온도 변화에 따라 변성이 되어 그 능력을 잃기도 하는데, glycerol을 첨가해줄 경우 0 미만의 낮은 온도에서 보관을 하여도 기질의 어는점을

공학/기술| 2023.03.19| 11페이지| 1,000원| 조회(285)

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[10점/A+] 연세대학교 공학생물학 및 실험I 2주차 용액의 산도 측정법 및 완충계

실험 2. 산도(Acidity)의 측정과 생물체의 완충액(Buffer Solution)공학 생물학 및 실험I. 이론적 배경1. 산과 염기1) 산(acid)산(acid)의 생물학적 정의는 용액의 농도를 증가시키는 물질이다. 예를 들어 염산(HCl)이 물에 가해지면, 와 로 분리되는데, 이러한 의 증가로 인해 물속의 농도가 의 농도보다 높아지게 되고 산성 용액이 된다.2) 염기(base)염기(base)의 생물학적 정의는 용액의 농도를 낮추는 물질이다. 염기에는 두 가지 종류가 있는데, 한 염기는 직접 를 받아들여 용액 속의 농도를 낮춘다. 예를 들어, 얌모니아()는 질소의 원자가껍질 내 비공유 전자쌍이 용액으로부터 를 끌어당겨 암모늄이온()을 만들며 염기로 작용한다. 다른 염기는 를 방출함으로써 와 와 결합하게 하여 농도를 낮춘다. 예를 들어, NaOH는 물에 녹으며 와 로 해리되고, 염기로 작용한다.2. 물의 양쪽성 (amphoteric)산이나 염기로써 작용할 수 있는 물질을 양쪽성(amphoteric)이라고 한다. 물은 가장 흔한 양쪽성 물질로, 이는 하나의 분자로부터 양성자가 다른 물 분자로 이전되어 수산화 이온과 하이드로늄 이온을 내는 물의 자체 이온화(autoionization) 반응에서 관찰할 수 있다.물의 자체이온화 반응에 대한 화학 평형식은 다음과 같다.는 이온-곱 상수 (ion-product constant) 또는 해리 상수 (dissociation constant)이다.실험 결과 에서 순수한 물은 이므로 의 값은 다음과 같다.중성 용액에서는 , 산성 용액에서는 , 염기성 용액에서는 이며, 에서 물의 이온화 상수는 항상 이다.3. pH와 pOHpH와 pOH는 각각 수소이온 농도, 수산화이온 농도를 뜻하며, 다음과 같이 정의한다.순수한 물의 수소이온 농도는 이므로 이다. 음의 로그값이 작아질수록 더 큰 수를 의미하며, 실제로 pH가 낮을수록 수소이온의 농도는 더 높으며, 산성이라는 뜻이다.즉, 앞서 수소 이온과 수산화 이온의 농도 비교를 통해 산염기완충용액은 약산과 그에 상응하는 짝염기, 혹은 약염기와 그에 상응하는 짝산의 혼합물이다. 완충용액은 용액 내에서 와 의 농도 변화를 최소로 유지시켜주는 역할을 한다.2) 생물체 내의 완충용액의 역할모든 살아있는 생명체의 특징인 항상성은 pH에도 해당된다. 생체 분자가 수소 이온을 잃거나 얻으면 그 성질이 변할 수 있으므로 항성성에도 문제가 생길 수 있다.살아있는 세포 내부의 pH는 대체로 7 근방에 있다. 예를 들어, 사람의 혈액 pH는 약한 염기성인 약 7.4 정도로 유지되고 있다. 만일 혈액의 pH가 7 정도로 떨어지거나, 7.8 정도로 올라간다면 사람은 수 분을 견딜 수 없다. 이러한 일이 일어나지 않도록 하기 위해 체내에는 pH를 일정하게 유지하는 화학적 체계가 갖추어져 있다. 비교해보자면, 순수한 물 1L에 0.01M의 강산을 더하면 pH는 7에서 2로 떨어지게 되는데 이때 동일한 양의 산을 혈액에 더해 주게 되면 pH는 7.4에서 7.3 정도로만 변한다. 이렇게 적은 변화가 일어나는 이유는 완충용액 덕분이다.3) 완충 작용의 기작완충용액에 비교적 많은 양의 약한 산 와 그 짝염기 가 들어있다고 가정했을 때, 수산화 이온을 용액에 첨가하면 약한 산이 양성자 주개로 반응한다.따라서 이 반응의 알짜 결과는 수산화 이온이 축적되지 않고, 로 대체된다. 이러한 조건에서 pH의 안정성은 의 해리에 대한 평형식을 에 대한 식으로 정리했을 때 의 평형 농도, 즉 pH는 의 비에 의해 결정된다는 것을 알 수 있다. 을 첨가하면 가 로 바뀌고, 비는 감소한다. 그러나 원래의 와 의 양이 첨가된 양에 비해 충분히 많다면 비율의 변화는 작을 것이다.4) 완충용액의 선택완충 용액에서 사용하는 약한 산의 가 만들고자 하는 pH와 가까워야 한다.예를 들면 pH 4.00인 완충 용액이 필요할 때, 가장 효과적인 완충 작용은 일 때 일어날 것이다. 따라서 Henderson-Hasselbalch 식으로부터즉, 가장 적합한 약한 산은 , 을 가진 산임을 알 수 있다.5. 다양성자산 산은 한 번에 한 개의 양성자를 단계적으로 해리한다.예를 들어, 사람의 혈액에서 pH를 일정하게 유지하는 데 중요한 역할을 하는 이양성자산인 탄산(은 다음과 같은 단계로 해리한다.해리 평형에 대한 순차적인 값은 과 로 표시한다. 첫 해리 평형의 짝염기인 는 두 번째 해리 단계에서 산으로 작용한다. 각 해리 단계에 포함된 산은 순차적인 해리 상수를 계산해보았을 때 점점 약해지는 것을 알 수 있다. 이는 첫 번째 양성자를 잃을 때보다 두 번째, 세 번째 양성자를 잃는 것이 덜 자발적으로 일어난다는 것을 보여준다.II. 실험 목적산 염기가 생명체와 직간접적으로 연관되어 있다는 사실을 바탕으로, 생명체 내에 일어나는 완충 작용에 대해 공부해보고 인산 완충계를 통하여 그 원리를 직접 실험해본다. 또한, 실생활 속 여러 용액들의 pH를 pH meter와 pH paper를 통해 측정해보고, 비교해본다.III. 실험 준비물pH-meter, 자석 젓개(magnetic stirrer), pH paper, 비커, 표준 용액(standard solution; pH = 4.00, 7.00, 10.00), 0.1M 여러가지 용액(수돗물, 증류수, 생수, 사이다, 콜라, 오렌지 주스, 우유), 0.1M , 5N NaOH, 200l pipetIV. 실험 방법[인산완충계 적정]1. pH meter의 측정봉에 증류수를 흘려 보내어 표면을 헹구어 준다.2. pH meter를 사용하여 표준 용액(pH=4.00)의 pH를 측정한다.3. 1번과정을 반복한 후 표준 용액(pH=7.00)으로 pH를 측정한다.4. 1번과정을 반복한 후 표준 용액(pH=10.00)으로 pH를 측정한다.5. 1번과정을 반복한 후, 0.1M 인산(을 비커에 담고 magnetic stirrer로 용액을 stirring 해주며 pH meter를 이용해 pH를 측정한다.6. 200의 5N 를 5번 과정의 비커에 첨가하고 magnetic stirrer로 용액을 stirring 해주며 pH meter를 이용해 pH를 측정한다.7. p정확히 1씩 변할 때 마다 측정하는 것은 어렵다. 따라서 5N 를 200씩 첨가하고 pH가 1 이상 변할 때 마다 pH paper에 용액을 찍어 실험을 진행했다.8. 7번과정을 pH13 정도 측정될 때까지 반복한다.[다양한 시료들의 pH 측정]1. pH meter의 측정봉에 증류수를 흘려 보내어 표면을 헹구어 준다.2. 증류수의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.3. 생수의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.4. 사이다의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.5. 콜라의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.6. 오렌지 주스의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.7. 우유의 pH를 측정하고 pH paper에 용액을 찍어준다.V. 실험 결과[인산완충계 적정][다양한 시료들의 pH 측정]VI. Discussion의 구하기1) 반응식 분석즉, 해리되어 나오는 수소 이온의 농도는 에서 해리되어 나오는 수산화 이온의 농도와 같다고 둘 수 있다.2) mol 수 구하기3) 구하기4) 이론치와 측정치 비교이론치2.30측정치2.12VII. Further Study1. 흔히 사용되는 완충용액(buffer solution)의 종류는 무엇이며, 각각의 장단점은?흔히 사용되는 완충 용액에는 Tris Buffer, Phosphate Buffer, Acetate Buffer, Glycine Buffer 등이 있다.1) Tris Buffer가 약 8.30 정도로, 세포의 pH 사이에서 이용할 수 있다는 장점이 있다. 반면, 온도변화에 따라 pH 변화가 있다는 단점이 있어 상온에서 만들어 냉장보관을 필요로 한다.2) Phosphate Buffer가 약 7.22 정도로, 와 를 혼합하여 만들어 가격이 저렴하다는 장점이 있다. 반면, 농도와 이온 조성의 변화에 따른 pH 변동 폭이 크다는 단점이 있다.2. 생체 내에서 작용하는 Buffer System과 그 작동 기작은 무엇인가?사람의 혈액의 여러 완충제들 중 하나는 탄산이 즉 pH가 감소하게 되면 평형이 왼쪽으로 이동하게 되고, 수소이온이 감소, 즉 pH가 증가하게 되면 평형이 오른쪽으로 이동하게 된다. pH가 증가하면 오른쪽 방향의 반응이 우세하게 진행되므로 더 많은 탄산이 유리되어 수소이온을 제공하고, 반대로 pH가 감소하면 왼쪽 방향의 반응이 우세하게 진행되어 중탄산염이 수소이온을 제거하여 수소이온 농도가 조절이 된다. 이러한 탄산-중탄산염 완충용액 시스템과 같이 대부분의 완충용액은 산과 염기의 쌍으로 이루어져 있다.3. pH를 측정하는 다른 방법이 있는가?1) pH meterpH meter는 전극을 사용하여 전기적인 방법으로 pH를 측정하는 장치로, 용액 속에 담근 지시 전극(indicator electrode)과 기준 전극(reference electrode) 사이의 전위차를 측정하여 용액의 pH를 결정한다. 지시 전극은 용액의 수소이온 농도에 따라 전극 전위가 변하는 전극이고, 기준 전극은 용액의 pH에 관계없이 항상 일정한 값을 나타낸다.2) 산-염기 지시약(acid-base indicator)지시약(indicator)은 아주 좁은 pH 영역에서 그 색이 현저하게 변하는 염료이다. 여러 다른 지시약들은 의 값이 다르며, 따라서 다양한 pH 값에서 색상의 변화를 보인다. 메틸오렌지(Methyl orange), 메틸레드(Methyl red), 브로모티몰블루 (Bromothymol blue), 페놀프탈레인(Phenolphthalein) 등 특정 pH에서 색이 변화하는 특징을 통해 시험 용액의 pH를 알아볼 수 있다.2) pH paperpH paper는 여러 종류의 지시약을 종이에 흡수시킨 것으로, 이때의 지시약 혼합물은 시험 용액의 pH에 따라 나타나는 색이 명확하게 구별될 수 있도록 제작되었다. 시험 용액을 pH paper에 흡수시키면 색 변화가 일어나고, 이를 pH paper 색 변화에 대한 기준표에 대조시켜 시험 용액의 pH가 얼마에 해당하는지 알아낼 수 있다.VIII.참고 문헌대표역자 전상학. 2016. 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[만점 레포트] 연세대학교 생화학실험(1) 9주차 흡광광도법

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자연과학| 2023.03.19| 4페이지| 1,000원| 조회(152)

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