[ 전기영동을 이용한 단백질 분리 ]실험목적: 단백질을 추출하여, 겔에 시료를 전기를 이용해 내려주면 단백질이 분자량에 따라 줄을 세우며 분리된다. 이 때 나타나는 막대선 하나하나가 단백질이다. 따라서 위에서 아래로 내려오는 순으로 분자량의 무게를 알 수 있고. 내가 원하는 단백질의 분자량을 미리 알고서, 그 단백질이 있는지 확인을 하기 위하여 비슷한 분자량의 단백질을 여러 개 넣어둔 marker를 이용해 같은 위치에 생긴 막대선이 있는지 확인한다. 그리고서 염색시약을 이용해 염색을 하면 단백질이 많을수록 더 진하게 나타난다. 이러한 원리를 이용하여 단백질을 정량하고 내가 원하는 단백질이 있는지 확인한다.실험재료,기구 및 방법: 30% acrylamide, 1.5M Tris(pH8.8) (resolving buffer), 10% SDS, 10% APS, TEMED,0.5M Tris(pH6.8) (stacking buffer), sample buffer, 70% 에탄올, 1X running buffer,증류수, Rainbow marker, Coomasiblue Eppendorf tube, petri dish, 마이크로피펫, 팁Stand & Clamps, Short plate & Spacer plate, Comb, Hot block, 얼음, 스펀지마이크로 원심분리기8% resolving gel(separating gel)을 피펫을 이용하여 유리판 사이에 넣는다.Gel이 마르지 않게 70% 에탄올을 gel 위에 살살 부어준다.Gel이 굳으면 위의 에탄올은 뒤집어서 버리고 증류수로 세척한 후 뒤집어 건조한다Stacking gel을 필요한 용량 만큼 만들어 resolving gel 위에 피펫을 이용하여 넣어준다.Eppendorf tube에 아래 표와 같이 sample 및 marker 처리를 한다.SampleD.WSample bufferTotal volume3.86μl(50μg의 단백질로 정량한 양)40-8-x μl8μl40μlMarkerD.WSample bufferTo1K 보다 가벼운 분자량을 가지고 있음을 알 수 있었다. 그리고 sample과 증류수, sample buffer를 넣은 eppendorf tube의 total volume이 다른 조에 비해 많았다. 또 Marker의 위치와 같은 곳에 막대선이 나타났지만 다른 조의 결과에 비해 연하게 나타나 제대로 관찰하기 힘들었다.고찰 및 결론: Eppendorf tube에 들어가야 하는 Total volume이 초과되었기 때문에 sample이 덜 들어갔다기 보다는 증류수가 많이 들어갔다고 볼 수 있으며, 마이크로피펫의 조작이 미숙하여 이러한 결과가 나온 것 같다. Marker의 위치와 sample의 단백질이 동일한 위치에 막대선으로 나타났으므로 같은 분자량의 단백질임을 확인할 수 있었다. 하지만 단백질의 분리는 확인할 수 없었다. 겔 상에 하나의 막대선만 있으면 샘플 용액에 한가지 물질만이 존재한다는 것을 의미한다. 하지만 marker에서도 나타나지 않았으므로, 다시 실험을 한 결과를 참고하면, marker에서는 225kDa, 102kDa, 76kDa, 52kDa, 38 kDa, 31kDa, 또 그 아래 위치까지 단백질이 발현되었고 sample에서는 막대선이 위에서부터 내려와 단백질이 쭉 내려오는 것을 확인할 수 있었지만 가장 진하게 나타난 부분이 31kDa 아랫부분이라 분자량을 추측만 할 수 있었다. Rainbow marker의 31kDa 아랫부분은 24kDa, 17kDa, 12kDa 인데 31kDa와 가까우므로 약 24kDa 라고 추측할 수 있다. 여기까지 marker와 sample이 같은 위치에 단백질이 발현된 것을 확인한 후, transfer하는 과정을 통해 전기를 이용하여 겔의 단백질을 멤브레인으로 옮긴다. 그 다음 원하는 단백질과 결합하는 antibody를 넣어주어 정말 결합이 되는지 확인한다. 그리고서 다시 1차 antibody를 인식하는 2차 antibody를 결합시키고 coomasiblue라는 발색시약을 이용해 염색시켜 antibody의 색이 나타나도록 한 법은 크게 이동계면 전기영동법(moving boundary electrophoresis)과 띠 전기영동법(zone electrophoresis)의 2가지로 분류되는데, 이 실험에서 띠 전기영동법을 이용했다.전기영동에서 물질의 이동이나 분리는 대부분 겔이라는 고체 지지체에서 진행되는데, starch 겔이나 agarose 겔 등도 가끔 사용되지만 polyacrylamide 겔이 가장 많이 사용된다. 겔의 가장 큰 장점은 농도를 조절하는 것에 의하여 겔 분자 사이의 틈새 크기를 조절하는 것이 가능하다는 것이다. 같은 조건의 전기영동에서 겔의 이 틈새가 크면 물질은 빨리 이동하고, 틈새가 작으면 느리게 이동한다.(이근보,2013) 즉, acrylamide 농도에 따라 gel의 분리능이 결정된다. Acrylamide 농도가 높을수록, 망의 구멍이 작아져 작은 분자들이 더 잘 분리될 수 있으며, acrylamide 농도가 낮을수록 망의 구멍이 커져 큰 분자량을 갖는 단백질들이 잘 분리된다.(유욱준,2009). 실험에서는 8% resolving gel을 사용하였으므로 보다 작은 분자들이 잘 분리 되었을 것이다.고분자 물질의 이동도는 공전 전해질의 이온의 종류와 농도, 측정 온도, 완충 용액의 pH 등의 영향을 받는다.(김주필,2003) 하지만 전기영동을 할 때 여러 변수들을 일정하게 조절하면 분자들의 이동도는 단지 분자들의 질량에 따라 달라지게 된다. 즉 같은 조건에서 분자량이 큰 분자는 늦게 이동하고, 분자량이 작은 분자는 빨리 이동하게 된다. 그러므로 변수들을 일정하게 조절한 후 같은 조건에서 전기영동을 하였을 때, 만약 그 이동도가 같다면 이들은 서로 같은 물질이라고 한다. 전기영동은 특히 아미노산, 탄수화물, 단백질, 펩티드(peptides), 핵산, 뉴클레오티드(nucleotides) 등의 분석에 유용하게 사용된다.(이근보,2013)띠 전기영동(Zone electrophoresis)은 위에서 설명한대로 sample 용액을 겔 등의 지지체에 가하고 전류를 통하면 시이가 길어 그물 구조를 빠져 나오는데 시간이 오래 걸리기 때문에 이동속도가 느려지게 되고 이를 통해 단백질이 분리되는 것이다. 따라서 이 겔은 sample이 지나가는 거름망, 체 역할을 해준다. 즉 시료들의 알짜 전하가 똑같게 되어 SDS가 결합한 단백질의 전기영동 이동도는 주로 단백질의 분자량에 따라 달라진다. 분자량이 큰 분자는 겔을 느리게 이동하고 작은 분자는 빠르게 이동하게 된다.(이근보.2013)SDS Polyacrylamide 전기영동은 분자량이 10,000~200,000인 단백질의 분자량을 결정하는 데 매우 유용한 방법이다. 분자량을 모르는 단백질 시료를 분자량을 알고 있는 표준 단백질과 같은 조건에서 전기영동을 한 후 둘의 이동도를 비교하면 분자량을 모르는 단백질의 분자량을 측정하는 것이 가능하다.(이근보,2013) 여기서 분자량을 알고있는 표준 단백질은 marker를 말하며 여러 분자량의 단백질을 섞어놓은 것이다.전기영동을 하기 위해서는 Stand & Clamps와 Short plate& Spacer plate, Comb 등의 기기가 필요하다. Stand & Clamps는 겔을 굳힐 유리판을 고정하고, 겔이 새는 것을 방지하기 위한 기기이다. 이때 스펀지로 잘 막아주지 않으면 겔이 새어 나오므로 주의가 필요하다. Short plate& Spacer plate는 길이가 다른 두 유리판으로, 이 두 유리판의 사이 공간에 겔을 넣어 굳힐 때 사용된다. Comb는 겔에 Sample을 loading할 공간을 만들어주는 도구로 파여있는 부분에 Sample을 넣어준다.(유인물) 그리고 필요한 재료에 대한 설명을 하자면 먼저, stacking gel이 필요한데, stacking gel은 윗부분을 구성하는 겔로서 Large pore의 polyacrylamide gel(4%) 이다. Tris buffer는 pH 6.8을 사용하며, 전기영동 buffer 보다 pH가 낮다. Stacking gel에서 단백질은 SDS에 의해 음전하를 띄고, Cl- 역시 음전하를 띄며완전히 이온화된다. 이동속도가 Cl->glycine>단백질로 바뀌기 때문에 Cl-와 glycine 사이에 형성되었던 high voltage gradient가 거의 사라지게 되어 단백질의 이동이 분자량에 영향을 받게 되고, acrylamide 농도도 높아져 gel 내부의 그물구조가 더 촘촘해 지므로 단백질이 분자량에 따라 이동속도에 차이가 나게 된다. acrylamide gel은 stacking gel과 resolvin gel로 서로 다른 두가지의 겔이 붙어 있는 상태로 전기영동을 하게 된다. 두 겔은 acrylamide 함유량도 차이를 보이지만 pH의 차이가 두 겔이 다른 역할을 하도록 하는 요인이다. Sample을 loading 한 후 전기장을 걸어주면 전기영동 buffer에 함유된 Cl-와 glycine 이온들이 단백질의 이동에 큰 역할을 하게 된다.(유욱준,2009)또 sample과 marker를 제조해야한다. 제조 후 sample을 원심분리기에 돌려 침전물을 없애주는데 이때 SDS가 가용화제로 작용하도록 처리한다. 그 후 hot block(95~100℃)에 5분간 방치하는데 이 때 단백질이 풀어져 고유의 전하를 잃어버리고 SDS에 의해 (-)전하를 띄게된다. 그리고 이 때 sample에 처리하는 buffer는 모두 알칼리성이다. protease나 phosphatase inhibitor를 넣어주어 단백질이 자체 내의 효소들에 의해 파괴되는 것을 막아준다. Marker는 Full-Range RPN800E rainbow marker를 사용했고 같은 이유로 buffer를 넣어 제조했다. Full-Range RPN800E Rainbow marker는 분자량 마다 다른 색을 띄며 225K~12K까지 확인이 가능하다. 이 marker와 Sample을 같은 겔에 처리하여 전기영동을 한 후 coomasiblue 염색시약으로 겔을 염색하여 막대선이 잘 보이도록한다. 이렇게 염색된 막대선을 보며 sample이 marker와 맞게 발현되었는지 비교하여 분자량을 파악한다.(유
