Ⅰ. 항균성 실험? 흔히 사용되는 항생물질을 이용하여 항생제에 대한 미생물의 감수성 정도를 측정한다.Ⅱ. Theory(이론)1. 항생제의 작용기전항생제는 미생물이 만들어 내는 항미생물 제제이다. 항생제는 다양한 세균과 진균(곰팡이)에 의해 생산되며 자연계에서 다른 미생물의 생장을 억제하거나 죽인다. 세균의 생리작용 중 많은 부분은, 진핵생물과 다르거나, 결여되어 있거나 보통은 나타나지 않는 효소들 또는 세포 구조가 이용되고 있다. 세균의 세포벽, 단백질 및 핵산의 합성, 대사경로, 세포질막의 유지 등과 같은 것들이 대다수 항생제의 표적이 되고 있다.1) 세포벽 합성 억제세균의 세포벽은 펩티도글리칸을 함유하고 있다는 점에서 특징적이다. 이러한 이유에서, 이 세포벽 구성성분의 합성만을 저해하는 항미생물 약물은, 진핵생물에는 아무런 영향을 미치지 않으며, 결과적으로 매우 높은 치료지수를 갖는다.2) 세포막 기능 억제세포막은 투과 장벽으로 선택적 능동수송을 수행함으로써 세포 내/외의 고분자 물질과 이온의 균형을 이루게 한다. 일부 항생제는 능동수송에 관여하는 세균의 세포막 기능을 변화 시켜 세균을 사멸시키는데 대표적인 것으로 polymyxin과 항진균제(amphotericin B, ketoconazole, fluconazole, itraconazole 등)가 해당한다. 이러한 항생제는 대량 투여 시 인체 세포에도 독성을 일으키므로 사용 시 주의를 필요로 한다.3) 단백질 합성 억제일부 항생제는 리보솜과 결합하여 번역과정을 방해함으로써 단백질의 합성을 억제하는데, 주로 리보솜 RNA(rRNA)에 결합함으로써 이루어진다. 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 테트라사이클린을 포함한 많은 항생제가 세균의 리보솜을 표적으로 하지만, 진핵세포의 리보솜에는 영향을 주지 않는다. 그러나 진핵세포에 있는 미토콘드리아와 엽록체의 리보솜은 진화적으로 세균의 리보솜으로부터 유래되었기 때문에, 세균의 단백질 합성을 억제하는 항생제는 또한 이들 세포 소기관의 단백질 합성도 억제할 수 있다.4) 핵미생물의 증식을 저지하거나 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 미생물의 증식을 억제하는 항생제는 정균제(Bacteriostatic)라 부르며, 성장이 억제된 후 숙주의 정상적인 방어기작에 의해 병원균이 죽거나 제거된다. 미생물을 사멸시키는 능력을 갖고 있는 항생제를 살균제(Bactericidal)라 부르는데, 이것은 병원균이 정상적인 숙주 방어기작에 의해서는 제거되거나 파괴될 수 없을 때 특히 유용하다. 약물의 농도와 미생물의 성장단계에 따라서 특정 약물이 정균성 또는 살균성 약물이 될 수도 있다.1) 테트라사이클린계 : 테트라사이클린(Tetracycline) - 정균 작용테트라사이클린은 Streptomyces 종에 의해 생산되며, 거의 모든 그람양성 및 그람음성 세균을 억제하는 광범위 항생제이다. 테트라사이클린의 기본구조는 naphthacene 고리 시스템으로 구성되어 있다. 기본 naphthacene 고리에 붙은 다양한 치환체들이 자연적으로 발생하여 새로운 테트라사이클린 유사체가 형성되기도 하며, 또한 naphthacene 고리에 치환체들을 가진 반합성 테트라사이클린이 개발되었다.2) 페니실린계 : 암피실린(Ampicillin) - 살균 작용페니실린은 β-락탐 항생제이고, 포도상구균 및 폐렴구균 감염을 치료하는데 놀라운 효과를 보였으며 연쇄구균 감염의 치료에도 설파계 약제보다 더 좋은 효과를 나타냈다. 암피실린은 반합성 페니실린으로 일부 그람음성 세균에 효과가 있다. 이런 반합성 페니실린의 구조변화가 그람음성 세균의 세포막 투과를 가능하게 하여 궁극적으로 세포벽 합성을 억제한다.↑ [그림 2] 암피실린← [그림 3] 테트라사이클린3. 감수성 검사(Sensitivity Test)특정 항생제에 대한 병원균의 감수성은 예측하기 어렵다. 불필요한 약물을 투여하면 독성 또는 알레르기 반응의 불필요한 위험이 나타나고, 정상적인 미생물군이 변형되어 그 약물에 내성을 가진 병원균의 과도한 성장을 초래할 것이다. 여러 종류의 항생제에 대한 특정 병원균의 감수성을 측정하여, 공격산기법(disk diffusion technique)한천배지가 든 페트리접시에 검사용 균주 배양체를 접종한다. 일정량의 항생제를 원형의 여과지에 첨가하여 한천배지의 표면에 올려 둔다. 이 검사평판을 배양하는 동안 항생제가 여과지로부터 한천배지로 확산되어 농도구배가 만들어진다. 여과지로부터 멀리 확산되어 갈수록 농도가 더 낮아진다. 여과지로부터 일정 거리에 MIC 농도가 형성된다. 이 거리보다 먼 검사평판에서는 미생물의 생장이 이루어지지만 그 안쪽에서는 생장이 억제된다. 형성되는 생장저해 구역의 직경은 여과지에 가한 항미생물제의 농도 및 용해도, 확산상수 및 전반적인 효능에 비례한다.3) E-test디스크 확산 시험법을 번형 시킨 E-test는 항생제를 농도 구배를 이루도록 적셔진 기다란 스트립을 이용한다. 서로 다른 항생제를 주입시킨 여러 개의 스트립을 시험미생물을 균일하게 도말한 한천 평판 표면 위에 올려놓는다. 배양 중에 미생물이 자라면서 스트립 주변에 생육이 저지된 부위가 나타나는데, 약물이 농도 구배 때문에 저지원이 눈물방울처럼 형성되며 끝에서 스트립과 교차하게 된다. 세균의 생육이 스트립을 교차하는 지점에서, 인쇄되어 있는 눈금 숫자를 읽어서 MIC를 판독하면 된다.[그림 5] 시험관 희석법 [그림 6] 디스크 확산기법 [그림 7] E-test4. 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)최소억제농도는 특정의 항생제가 시험관 내에서 주어진 미생물의 성장을 억제하는 최저 농도를 측정하는 정량적인 시험법이다. MIC는 시험하는 세균이 서로 다른 농도의 항생제가 포함된 액체 배양에서 성장할 수 있는 능력을 측정하여 결정한다.5. Mueller-Hinton 한천평판배지(MH 배지)임균 및 수막염균의 배양과 설파제의 감수성시험에 사용한다. 소고기엑기스, 카자미노산, 전분, 한천이 함유되어 있다. 펩톤이 함유되어 있지 않으므로 펩톤 중의 어떤 종류의 아미노산이 임균 증식 저지작용이 없으며, 설파제에 대하 길항물질도 함유되어coccus faecalis는10 ^{-3}으로 희석시킨다.② 희석시킨 균을 Mueller-Hinton 배지에 400 ~ 500㎕ overlay한다.③ overlay 후, clean bench 안에서 물기가 거의 없을 정도로 말린다.④ 어느 정도 말린 후 멸균한 핀셋을 이용해 접종할 paper disk를 overlay한 배지에 올려놓고, 디스크 중앙을 가볍게 눌러 배지 표면에 완전히 부착시킨다.⑤ 항생제(Tetracycline, Ampicillin)를paper disk에 각각 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 40㎍/㎖, 80㎍/㎖에 접종하고, control로 사용할 디스크에 에탄올을 접종한다.(10㎕씩 분주)⑥ 디스크 간의 간격은 충분히 떨어져야 한다. 각 디스크 중심 간의 간격은 24mm 이상이어야 하며 평판 가장자리로부터 15mm이상 떨어져야 한다.⑦ incubator (37℃, 24~48시간)에서 배양을 실시한 후 결과를 관찰한다.[실험결과 예상 사진]→ 항생제에 의해 미생물의 생장이 저해되는 것을 확인할 수 있으며, 저해되는 정도는 형성되는 환의 크기를 통해 예측할 수 있습니다. 또한 control을 통하여 실험 결과가 항생제에 의해서만 나타난 것이라는 것을 증명할 수 있습니다.Ⅳ. Result(결과)[결과 그림 1, 2, 3, 4] B.sub, E.fae와 암피실린, 테트라사이클린 사용→ Bacillus subtilis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 1은 균이 자라지 않은 배지가 존재함으로 overlay 도중 실험 오차가 생겼음을 알 수 있다.→ Enterococcus faecalis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 3은 항균성이 미미하게 나타난 것을 보아 암피실린 항생제가 80㎍/㎖ 이상의 농도가 필요하기 때문이라고 예측할 수 있다. 또한, 균이 자라지 않은 배지가 존재함으로 overlay 도중 실험 오차가 생겼음을 알 수 있고, 각 디스크는 평판 가장자리로부터 15mm 이상 떨어져야 하는데, 15mm보다 더 가까이 붙어있음을 알 수 있희석해주면 되므로 1:1 비율인, 80μg/㎖의 시료 500μg에 EtOH 500μg을 희석하면 된다. 20μg/㎖도 위와 같은 과정으로 40μg/㎖의 시료 500μg에 EtOH 500μg을 희석하면 되고, 10μg/㎖ 같은 과정으로 20μg/㎖의 시료 500μg에 EtOH 500μg을 희석하면 된다.2) Disk 놓는 법평판에 균을 접종한 후 적어도 15분 이내에 paper disk를 놓아야 한다. 항생물질의 확산과 균의 성장이 동시에 진행되도록 하여야 하기 때문이다. 핀셋을 화염 멸균하고 식힌 후 paper disk를 집어 평판 위에 놓고 살짝 누른다. 이때, paper disk를 붙일 때마다 멸균을 해줘야 한다. 각 paper disk 중심 간의 간격은 24mm 이상이어야 하며 평판 가장자리로부터 15mm 이상 떨어져야 한다. 일단 놓은 paper disk는 자리를 움직이지 말아야 한다. 항생제 10㎕를 분주할 때는 paper disk가 생각보다 작기 때문에 벗어나서 분주하지 않도록 주의해야 한다.2. 실험 오차1) Overlay 오차Bacillus subtilis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 1과 Enterococcus faecalis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 3은 균이 자라지 않은 배지가 존재함으로 overlay 도중 실험 오차가 생겼음을 알 수 있다.2) 디스크 간의 간격 오차Enterococcus faecalis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 3의 각 디스크는 평판 가장자리로부터 15mm 이상 떨어져야 하는데, 15mm보다 더 가까이 붙어있음을 알 수 있다. 항균성으로 인한 원형이 만들어질 때 오차가 발생할 수 있음으로 주의해야 한다.3) 항생제 농도 오차각 항생제를 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 40㎍/㎖, 80㎍/㎖로 희석하여 사용하였는데, Enterococcus faecalis를 배양하고 암피실린 항생제를 사용한 배지 3에 항균성이 미미하게 나타난 것을 보아 암피실린 항생제가 80㎍/㎖ 이상의 농도가 필요하기232.
Ⅰ. 4주차_박테리아 생장곡선 실험? 세균을 대량 배양할 때나 조사해야 할 시료의 수가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정해 볼 수 있다.? 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 구해보고, 정확한 균체수의 측정을 위하여 콜로니 계수법을 병행해 보도록 한다.Ⅱ. Theory(이론)1. 미생물 생장(microorganism growth)미생물이 영양과 필요한 환경인자를 제공받게 되면 물질대사가 활성화되고 증식하게 된다. 이때 세포가 새로운 세포 구성성분들을 합성하여 세포의 크기를 증가시키기도 하고, 집단 내에 있는 세포의 수가 증가하기도 한다. 미생물 세포들은 한정된 수명을 갖고 있어서 종이 유지되는 것은 집단의 계속되는 생장에 의해서만 가능하다.1) 개체생장미생물 구성성분의 양적 증가와 구조 및 크기의 증가를 뜻한다. 즉 세포의 무게와 크기의 증가를 일컫는다.2) 집단생장개체의 질량과 크기의 증가뿐만 아니라 미생물 총수의 증가도 생장이라 한다. 이를 집단생장이라고 한다. 미생물은 크기가 미세하므로 미생물의 생장을 연구하기 위해서 개체생장보다는 집단생장을 살펴보는 것이 낫다. 미생물 세포의 집단생장은 한 세포가 분열할 때마다 두 개의 세로가 되므로 2n, 즉 2의 지수적 비율로 증가한다.2. 미생물 생장에 미치는 영향 요인미생물은 생장하는 환경의 화학적 및 물리적 상태에 의해 크게 영향을 받으며 6가지의 요인을 예시로 들 수 있다.1) 용질?수분 활성도물은 생명의 용매이며, 수분 활성도(물의 가용성)는 미생물의 생장에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 수분 활성도는 얼마나 환경이 습하거나 건조한지 뿐만 아니라, 물에 용해된 용질(염, 당 및 다른 물질)의 농도 함수에 의해서 결정된다. 용질은 물과 결합하여 물을 생물들에 덜 이용 가능한 상태로 만든다. 따라서 생물들이2) 온도너무 차거나 너무 뜨거우면 미생물이 생장할 수 없고 죽을 수도 있다. 생장을 위한 최저온도와 최고온도는 미생물의 종에 따라 상당히 다르며 살균 효과를 가지고 있어서 그들의 활둉은 매우 다양하다.6) 화학물질화학물질은 미생물 생장을 조절하는 데 흔히 사용되며 항미생물 제재는 미생물을 죽이거나 그들의 생장을 저해하는 자연 혹은 합성 화학물질이다. 살균, 살진균 그리고 살바이러스 약제는 각각 세균, 곰팡이, 바이러스를 죽인다. 정균, 정진균 그리고 정바이러스 약제는 죽이지 않고 생장을 억제하는 약제이다.3. 생장곡선(growth curve)세균류는 2분법 증식에 의해 그 수를 늘려 간다. 따라서 세균 집단의 증식률은 지수적으로 또는 산술적으로 표현할 수 있지만, 흔히는 대수적으로 표현한다. 경시적인 균의 증식 단계를 그림으로 나타낸 것이 생장곡선인데, 생장곡선은 균종, 배양조건, 접종 전 균의 양 등에 따라 다르게 나타날 수 있다. 회분배양에서 생장한 세포 개체군의 전형적인 생장곡선은 유도기, 지수기, 정지기, 사멸기를 포함하는 전체적인 생장주기를 보여준다.지수기(exponential phase)균이 이분법 증식을 활발히 하는 시기로, 세포수가2 ^{n}씩 증가한다.이 시기에 생산되는 균의 수는 사멸하는 균의 수에 비해 엄청나게 많다. 즉, 균이 대수적으로 증가하며, 세대시간이 가장 짧고, 세포의 크기가 일정하며, 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기이며, 물리적, 화학적 처리에 대한 감수성이 높은 시기이다.정상기(stationary phase)균 수가 최대로 도달한 후, 영양분이 고갈되기 시작하고, 노폐물 또는 대사 생성물이 점점 축적되는 시기로, 생성되는 균과 사멸되는 균의 비율은 거의 같으며, 이 시기는 포자를 형성하는 시기이다.사멸기(death phase)배양의 최종기로서 영양분의 결핍, 산, 알코올 등 유해한 대사산물의 축적, 그리고 세포밀도의 과다 등으로 생균수가 감소하는 시기이다. 영양분이 고갈되어 생겨나는 균보다는 죽어 가는 균의 수가 월등히 많게 되는 시기이고, 효소 작용에 의한 자기 소화가 일어나는 시기이다.[그림 1] 세균 개체군의 전형적인 생장곡선 [그림 2] 생균수와 총균수의점t _{} = 지수기 동안의 배양시간g= {t} over {n} = {log2 TIMES t} over {logb-loga} = {0.301 TIMES t} over {logb-loga}5. 생장 측정살아있는 균과 죽은 균 및 노약의 구별 없이 모든 균의 수를 계수하는 총균수 측정(total cell count)이라고 한다. 총균수 측정은 간편하고 편리하므로 이 방법을 많이 사용하는 경우가 많다. 총균수 측정에는 토마혈구계산시험법이 있다.총균수 측정은 죽은 균의 수까지 포함하므로 어떤 목적을 위한 실험(특정균의 검색, 항생물질의 연구 및 식품의 멸균도 시험 등)에는 적당치 못할 때가 있다. 이때 살아있는 균을 계수하는 방법인 생균수 측정(viable count)을 하게 된다. 생균수 측정에는 희석법, 막 여과법, 평판계수법 등이 있다.실험에서 사용할 평판계수법 중 주입평판법에 대해 자세히 알아본다.주입평판법(Pour plate)① 배양액을 피펫을 이용하여 살균된 페트리 접시에 주입힌다.② 멸균된 배지를 넣어준 뒤 부드럽게 흔들어서 잘 혼합한다.[그림 3] 주입평판법(Pour plate) 과정6. 집락 수 상정1) 균은 눈에 보이지 않아 셀 수 없음으로 colony(단위:CFU)를 센다.2) 15~300CFU/Plate인 경우를 측정한다.3) 전 평판에서 15CFU/Plate 이하인 경우, 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다.4) 전 평판에서 300CFU/Plate 이상일 경우, 300에 가까운 평판에 대하여 안지름 9cm의 패트리 접시인 경우인 경우에는1cm ^{2} 내의 평균 집락 수에 65를 곱하여 그 평판의 집락 수로 계산한다.5) 소수점 셋째 자리에서 반올림하고, 유효숫자 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.c = Colony의 수d = 희석배수x _{0} = 균원액의 양x _{s} = plate에 분주한 양n _{p} = plate의 수N= {SMALLSUM (c TIMES {1} over {d} TIMES {1} over {x _{0} mL} TIM 흡광도라고 한다.< A = ε × c × l / A : 흡광도, ε : 물질 고유의 흡광계수, c : 흡광물질의 농도, l : 큐벳의 폭>2) 분광 광도계(spectrophotometer)분광 광도계는 눈으로 관찰될 수 없는 적은 양의 세균의 존재를 확인할 수 있다. 광선이 큐벳에 들어 있는 세균 용액을 통과하면서 세균에 의해 분산되지 않은 빛의 양을 광선 측정기를 이용하여 측정된다.[그림 4, 5] 분광 광도계① 전원을 넣은 후 5분 후에 사용한다.② 파장을 맞춘다.③ 기기의 영점을 맞춘다.④ 배양액만이 들어 있는 튜브를 기기의 시료 주입부에 넣은 후 빛 조절기를 이용하여 100%의 투과율을 갖도록 조절한다.⑤ 시료(배양된 균)를 기기의 시료 주입부에 넣은 후 흡광도를 측정한다.8. 측정법 법칙람베르트(J. H. Lambert)는 시료의 흡광도는 시료의 두께에 비례함을 밝혔고, 비어(A. Beer)는 시료의 흡광도는 시료에서 빛을 흡수하는 화학종의 농도에 비례함을 보였다. 따라서 Lambert-Beer 법칙은 위의 두 가지 내용을 합쳐서 기술한 것이며, 이는 분광 광도법의 기본 법칙 중의 하나이다.[그림 6] Lambert’s law [그림 7] Beer’s lawⅢ. Apparatus & Reagents (시약 및 기구), procedure(실험방법)1. Apparatus & Reagents (시약 및 기구)Enterococcus faecalis, Escherichia coli, TSB액상배지, TSB고상배지, 삼각플라스크, micro pipette, micro tube, 증류수, Clean Bench, shaking incubator, 분광광도계, 큐벳 등2. procedure(실험방법)1) UV 측정① 삼각플라스크에 TSB액상배지 100㎖을 넣고 autoclave(121℃, 15min)하여 멸균한다.② 사용되는 균을 으로 희석하고, 1㎖을 TSB액상배지에 접종한다.③ 배양액 1㎖을 micro tube에 채취한 후 라고 표기한다. 그리고 삼각 플라스크는r(37℃, 16hr)에서 배양 후, 셀 수를 측정한다. 24시간의 배양액도 동일한 과정을 진행한다.Ⅳ. Result(결과)1. UV 측정1) 분광 광도계의 파장을 600nm로 맞추어 측정하였다.2)t _{0}부터 15분 간격으로t _{4}까지 측정하였고,t _{24}값을 추가로 측정하였다.Escherichia coli시간흡광도(ABS)t _{0}0.219t _{1}0.238t _{2}0.286t _{3}0.390t _{4}0.569t _{24}1.755Enterococcus faecalis시간흡광도(ABS)t _{0}0.143t _{1}0.138t _{2}0.140t _{3}0.141t _{4}0.142t _{24}1.729→ E.coli는 지속적으로 증가하는 흡광도와 그래프를 보여주었다.→ E.fae는 중간에 한번 감소하고 증가하는 흡광도와 그래프를 보여주었다.→ 예상 결과는 지속적으로 증가하여야 하는데, E.fae는 중간에 감소하는 그래프를 보여주어 실험 오차가 있음을 알 수 있다.2. 생균수 측정1) E.coli와 E.fae를 각각 TSB 고상배지에10 ^{-2},10 ^{-3}희석액을 3개씩 분주하여 Overlay하였다.2) Incubator(37℃, 16hr)에 배양한 결과, 다음과 같이 나타났다.[결과 그림 1] E.coli Overlay 결과 [결과 그림 2] E.fae Overlay 결과12310 ^{-2}300+300+300+10 ^{-3}300+300+300+12310 ^{-2}300+300+300+10 ^{-3}300+300+300+→ E.coli의 집락 수 산정을 하려 했으나 희석배수가 낮아 집락의 수가 많아 계산하기 어렵다.→ E.coli의10 ^{-2} 첫 번째 평판에 균이 덜 자라 있는 것을 보아 실험 오차가 있음을 알 수 있다.- 집락 수 산정 계산식을 이용해 E.fae를 계산한다.- E.fae의10 ^{-2}는 희석배수가 낮아 집락의 수가 많아 계산하기 어렵다.- 전 평판에서 300CFU/Plate 이상일 경우, 300에 가까운.
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