미생물학 및 실험 REPORT과목명교수님조교님실험 날짜제출일전공학번이름실 험 보 고 서The experimental report학번분반 / 조실험일자이름실험제목 : 미생물의 순수 분리(1) Spreading1. Objects본 실험은 미생물의 다양한 생물학적 특징을 밝히기 위해 목표하는 미생물을 순수 분리하고 배양하는 실험이다.2. Introduction1) 미생물 분리배양의 목적미생물은 다양한 생리적 기능, 무한한 서식지, 그리고 빠른 적응력 등의 특성을 가진다. 이러한 미생물을 탐구하기 위해서는 원하는 기능을 가진 미생물을 환경으로부터 분리하여 배양하는 기술이 필수적이다. 대부분의 경우, 목적균은 다른 미생물과 혼재하고 있어 이들을 잡균으로부터 분리하여야 하며, 이러한 분리 배양을 통해 순수배양 되어야 한다.2) 순수배양-각 미생물의 여러 가지 특성을 연구하기 위해서 혼합집단 미생물 군에서 단일 세포군으로 분리배양 하는 것이다.-특정 미생물의 영양 요구성을 알 경우, 선택배지를 이용해 순수배양을 하는데 배지의 조성 및 온도, 배양 시간 등으로 분리할 수 있는 균이 다르다.3) 순수배양기술의 종류(1) Spread plate(표면도말법)-미생물이 함유된 한 방울의 시료액을 배지에 떨어뜨려 Spreader라고 하는 멸균된 도말봉 으로 배지 전체에 시료액이 흡수될 수 있도록 펼쳐 도말하는 것이다.-배지의 표면에 형태학적으로 서로 다른 미생물 군의 세균 집락을 형성하여 구별하기 쉽 다. 또한 각각의 미생물을 분리할 때에, 집락 하나는 한 종류의 미생물만을 대표하기 때문 에 집락을 각각 다른 plate에 배양하면 단일 종의 미생물만을 분리할 수 있다. Spread plate 방법은 통기성이 원활하고 세균 덩어리가 모이지 않고 표면 전체에 퍼져 자라기 때문 에 같은 양의 균을 접종했을 경우, 일반적으로 pour plate 방법보다 세균의 수가 많이 나온 다.(2) Streak plate(획선평판법=도말평판법)-멸균된 루프(Loop, 백금이)를 한 번도 떼지 않고 그으면서 독립된 하나의 콜로니를 형성 하게끔 하는 방법이다.-단순히 미생물의 pure culture를 얻기 위한 목적으로 streak plate를 사용한다. Streaking 이란 긁는 행위를 말하는 것으로, 멸균된 백금이(loop)의 끝으로 미생물 집락을 취하여 고체 배지 위에 streak, 즉 그어 접종하는 것이다. Streaking으로 미생물의 단일 집 락을 얻어, 단일 종의 미생물을 분리할 수 있다.(3) Pour plate(혼합평판법=주입평판법)-시료를 희석하여 일부를 고체배지에 섞은 후 평판 접시에 배양시키는 것으로 배지 표면만 이 아니라 내부에도 집락을 형성한다.-이때 사용할 균체(또는 세균 현탁액)속 세균의 숫자를 정확히 알지 못하므로 몇 차례 희 석한 후 페트리 접시에 주입하여 하나의 평판 배지에 구분 가능한 수만큼의 콜로니가 형성 되도록 한다.-Spread plate와 Pour plate은 많은 양의 균주를 희석하여 도말하는 방법이다. 이 경우 원 시료에 존재하는 미생물의 수를 알 수 있다.4) 10진 희석법(액체시료)(1) 10진 희석법의 목적-10진 희석법은 액체 시료를 희석하는 방법으로 희석하지 않고 배양한다면 셀 수 없이 많 은 콜로니가 배양되기 때문에 관찰하기 쉬울 정도로 균을 배양하기 위해 사용하는 희석방법 이다.-보통 도말할 때10 ^{-3},10 ^{-4}희석액을 사용하는데10 ^{-3}희석액에 균의 수가 더 많지만10 ^{-4}에서 더 다양한 균이 배양될 수 있다.(균의 수가 많을수록 균끼리의 경쟁이 심해지기 때문이다.)(2) 10진 희석법의 방법①D.W 900μl와 액체시료 100μl를 E.tube에 넣는다. (10 ^{-1}희석)②D.W 900μl와 ①의 용액 100μl를 E.tube에 넣는다. (10 ^{-2}희석)③D.W 900μl와 ②의 용액 100μl를 E.tube에 넣는다. (10 ^{-3}희석)④D.W 900μl와 ③의 용액 100μl를 E.tube에 넣는다. (10 ^{-4}희석)※매 과정 마다 피펫팅을 하여 용액이 잘 섞이게 해야한다.5) 도말봉 화염멸균 방법-비커에 70% 알코올을 담은 후 도말봉을 넣는다.-도말봉에 묻은 알코올을 살짝 털어준 후 알코올램프에 직접적으로 닿게 해 알코올이 날아 갈 때까지 멸균해 준다. (알코올이 날아가면 저절로 불이 꺼진다.)-충분히 식힌 후 실험에 사용한다.3. Materialsclean bench, 도말봉, 알코올램프, 70%알코올, 비커, 피펫, NA배지, MRS배지, E.tube, 볼텍서, D.W, 시료(흙, 손)4. Experimental methods4-1 흙 속의 균 배양①E.tube에 흙과 D.W 1ml을 넣고 볼텍서와 원심분리기에 돌린다.※볼텍서: 진동을 통해 E.tube 속 고체시료와 D.W 섞어준다.※원심분리기: 흙 속 작은 돌멩이들이 배지를 찢을 가능성이 있어 미생물을 위로, 무거운 것 을 밑으로 가라앉힌다.②10진 희석법에 의해 흙을10 ^{-1}부터10 ^{-4}까지 희석한다.③NA배지에 희석액 100μl를 분주해 화염멸균 한 도말봉으로 배지가 뻑뻑해질 때까지 spreading 해준다.※이때 배지 뚜껑은 알코올램프 주변에 기대어 놓는다.④spreading 마친 고체배지를 뚜껑을 덮고 뒤집어서 37℃에서 배양한다.4-2 손 속의 균 배양①MRS배지에 손을 갖다대어 찢지 않게 부드럽게 골고루 문질러준다.※사람피부에 공생하는 균은 유산균으로 이루어져 있기 때문에 MRS배지에서 배양한다.②뚜껑을 덮고 뒤집어서 30℃에서 배양한다.5. Result-유산균, 강물, 빵으로 진행한 실험 -흙, 손으로 진행한 실험6. Discussion1) spreading 후 배지를 뚜껑 덮고 뒤집어서 배양하는 이유-spreading 과정에서 배지 뚜껑에 습기를 막기 위해 알코올램프 옆에 기대어 뒀으나 습기 를 완벽히 제거하지 못해 물방울이 평판위에 떨어지게 되면 물방울 속의 균들이 퍼져서 오염 이 될 수 있기 때문이다.2) 실험을 다시 진행한 이유-첫 실험 때 빵, 유산균, 강물 속 균들을 배양했지만 균이 잘 자라지 않아 손과 흙으로 시 료를 변경했다. 유산균에서 균이 자랐긴 하지만 유산균에서 나올 수 없는 균의 종류가 자란 것으로 보아 실험과정에서 오염되었음을 알 수 있었다.
