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Enzyme digestion & Gel Electrophoresis_생물공학실험 보고서

9주차 예비보고서1)제한효소의 1unit의 개념을 설명하시오.: 제한효소란, 이중 가닥 DNA분자의 특정한 염기서열을 인식하여 그 부분이나 그 주변 부위를 절단하는 효소이다. 제한효소는 소단위체의 구성 형태, 절단 위치, 절단 서열의 모양 및 필요한 coenzyme의 유무에 따라 3종류로 구분할 수 있다. 제한효소 1 unit이란 1ug의 DNA를 최적온도, 최적완충액 조건에서 1시간 만에 절단할 수 있는 효소 량을 의미한다. Unit을 과량으로 사용하게 되면 반응 시간을 줄일 수 있고, 반응 시간을 늘려 제한효소의 양을 줄일 수도 있는데 이런 방법을 사용할 경우 제한효소 처리 반응으로 절단하려고 하는 DNA성분 및 각각 비 특이적 활성 (Star activity)의 우려가 있는지, 제한효소의 활성이 최대 시간까지 지속되는지를 고려해야한다. DNA를 효과적으로 자를 수 있게 회사에서 상품으로 제작하는데, 상품화된 효소마다 다르지만 대개 10 units/ul내외의 농도로 공급된다. 다시 말해서 제한효소 10units/ul에서 1ul를 사용한다면 10unit을 사용한 것으로 DNA10 ug을 처리한 것이다.2) EtBr 염색의 원리를 설명하시오.: DNA속에 특정 유전자가 존재하는지 판단하기 위해 DNA에 형광을 입혀 눈으로 확인하는 방법이 있다. DNA염기의 퓨린과 피리미딘은 (260nm파장을 갖음) UV빛을 흡수를 할 수 있지만 형광을 나타내지 않아 형광을 나타내는 염료를 이용해야 하는데, 대표적인 염료로 EtBr을 사용한다.EtBr (Ethidium bromide)은 Gel 전기 영동 실험에서 핵산을 염색하여 시각화 할 때 사용되는 물질로서, 직접 DNA와 반응시켜서 사용하는 것뿐만 아니라 gel을 만들 때 EtBr을 넣어 사용해도 발광 효과를 볼 수 있다. 이 염료는 DNA의 당-인산 골격을 풀어서 확장하고 다른 염기와의 π-π결합을 통해 안정적으로 intercalation반응을 일으킨다. EtBr은 200nm대 파장의 자외선에서 가장 강한 흡수 스펙트럼을 나타내고 EtBr을 혼합한 gel에 UV빛을 비춰주면 EtBr이 이를 흡수하고 590nm의 오렌지색 빛을 방출하면서 DNA의 위치를 관찰할 수 있게 된다. DNA는 negative charge를 띄고, EtBr은 positive charge를 나타내어 전기 영동을 실시할 때 전압을 (-) (+)로 주게 되면 DNA는 전압을 따라 아래로 내려가게 되고, EtBr은 전압과 반대로 올라가면서 DNA와 결합을 하게 된다.하지만 EtBr은 DNA염기로 삽입되어 서열의 변화를 일으키는 물질로 대표적인 발암물질이므로 사용할 때 항상 주의해야한다.결과보고서실험제목Enzyme digestion & Gel Electrophoresis2. 실험 목적Unenzyme, single enzyme, double enzyme을 이용해 잘린 DNA를 각각 비교하고 정확하게 잘렸는지 확인하기 위해서 전기영동을 실시한다.3. Question이번 실험에 쓰인 enzyme 2종류(각 조에서 사용한 enzyme만!) Sca I & Xho I & Bgl II의 특징을 설명하시오.제한효소에는 무작위로 DNA를 자르는 1형 enzyme과 특정부위를 인식해 자르는 2형 enzyme, 짧은 부위를 인식하는 3형 enzyme가 있는데 우리가 이번실험에서 사용한 Enzyme Sca I 제 1형과 Bgl II는 제 2 형으로 특정부위 약 4~6 bp를 절단하는 enzyme을 사용했습니다.Sca I은 Streptomyces caespitosus에서 분리된 것으로 5’- AGT / ACT -3’ 에서 DNA를 절단하여 blunt end를 생성하는 제한효소로 약 37° C에서 가장 잘 작동한다.Bgl II은 Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_globigii" o "바실러스 글 로비 기이" Bacillus globigii에서 분리된 것으로 DNA의 부위를 인식해 절단하여 Stick end를 생성한다.4. 실험결과- 자신이 속한 조의 DNA gel 사진을 첨부하고, enzyme 명을 표시하시오.- Gel 사진을 보고 자신의 조 circular vector의 size를 계산하고 mapping 하시오.- 문제 풀 때 중간과정을 자세히 서술하시오. (피피티 그림이나 직접 그린 그림사진 첨부 필수 )Sca I과 Bgl II은 단 1개의 band가 나타난 것으로 보아 원형 DNA를 한 부분에서 잘라 선형으로 만든 것으로 본래의 DNA의 크기는 약 6Kb로 예측할 수 있으며, Sca I과 Bgl II을 동시에 이용해 DNA를 잘랐을 때 두 개의 band를 확인할 수 있어 Sca I과 Bgl II은 각기 다른 위치에서 DNA를 자른다는 것을 알 수 있고 두 개의 DNA조각이 생긴 것을 볼 수 있다. 이 때 잘린 두 조각의 크기가 2Kb, 4Kb인것으로 보아 총 DNA의 크기가 6Kb이라는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.5. 고찰: Gel사진 순서로 un cut, Single enzyme(Sca I, Bgl II), Double enzyme(Sca I과 Bgl II)을 사용해 DNA를 분리했다.Un cut은 enzyme으로 아무런 처리를 해주지 않은 본래의 원형 DNA상태로 뭉쳐져 있기 때문에 크기가 매우 작아 enzyme으로 DNA를 잘라준 DNA sample과 같은 속도로 전기영동을 걸어주었을 때 gel에서 빠져나가 band로 나타나지 않은 것을 확인할 수 있고 Sca I 과 Bgl II을 각각 이용해 DNA를 잘라 주었을 때 원형 DNA가 잘려 선형 DNA로 변하여 전기영동 시 gel에 걸려 각각 6Kb에서 band가 나타난 것을 볼 수 있다. 마지막으로 Sca I 과 Bgl II을 동시에 이용하여 DNA를 잘라 주었을 때 DNA가 선형으로 조각이 나서 4Kb와 2Kb에서 band를 확인할 수 있었다. 이렇게 전기영동을 통해 enzyme으로 자른 DNA 크기와 잘린 부위를 예측할 수 있는 이유는 agarose gel을 이용해 분리한 것으로 DNA의 크기, 전하 등에 따라 각기 다른 band가 나타나 예측이 가능하다.

자연과학| 2022.02.06| 3페이지| 1,500원| 조회(1,340)

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Transformation & Colony PCR 생물공학실험 보고서

11주차 예비보고서 (Transformation)1. Transformation을 수행하는 목적이 무엇인지 설명하시오.: Transformation은 외래 DNA 단편분자가 세포에 도입이 되어 새로운 유전적 형질이 발현되도록 하는 방법으로, 주로 박테리아와 plasmid를 통해 유전자를 도입하는 기술로 사용되었지만 transfection과 같은 동물 및 식물에서도 이 기술이 사용되고 있다. 즉 알지 못했던 유전적 형질을 본래의 알고 있는 유전적 형질을 갖은 세포에 이 기술을 도입시키면 알지 못했던 유전적 형질을 알 수 있다. 이 목적을 수행하기 위해 미생물의 유전자를 조작을 해야하는데 실험실에서 인공적으로 외래의 DNA를 받아들일 수 있는 Competent cell으로 만들어야 한다.2. Competent cell의 개념과 특징에 대해 설명하시오.: Competent cell은 외부의 DNA를 받아들일 수 있게 실험실에서 인위적으로 만든 세포로, 주로 화학적 방법과 전기천공법을 사용한다. 화학적 방법은 E.coli와 같은 Gram negative cell에서 주로 사용되는 방법으로 CaCl2 (염화 칼슘)을 사용한다. 미생물의 세포막은 음전하를 띄고 있어 음전하를 띄는 DNA가 반발력으로 인해 세포막 주위에 위치하기 어려워 Ca2+가 세포막의 유동성을 높여주고 세포 표면의 인지질, lipopolysaccharide의 음전하를 중화시켜 음전하를 띄는 DNA의 세포 표면 결합 및 통과를 촉진시킨다. 이때 세포에 열 충격(30~42℃)을 가하면 세포의 구멍이나, 손상된 세포벽을 통해 DNA의 이동이 빨라진다. 전기천공법은 세포에 10~20 Kv/cm의 순간적인 전기충격을 가해 세포막을 불안정하게 만들고 Pore를 형성하여 DNA를 넣어주는 방법으로 일반적으로 화학적 방법보다 효율적으로 Transformation이 가능하다. 이 두가지 방법 이후 배지를 이용해 배양한 뒤 Selection을 통해 competent cell만 선별한다.3. Transformation 실B Agar Plate에 streaking하여 replica를 제작한다. 이 Replica가 어떻게 활용될 수 있는지 설명하시오.- Replica는 원하는 유전자를 넣은 Vector을 가지고 있는 colony로서 이 colony를 가지고PCR을 수행하여 원하는 Vector 속 유전자를 대량으로 얻을 수 있다. 예를 들어 치료효과가 뛰어나지만 적은 생산량으로 치료제가 널리 사용되지 못 했던 약물을 치료 효과가 존재하는 유전자가 들어있는 부분을 Replica를 이용해 다량으로 복제하여 약물의 생산량을 증가시키거나, 숙주가 가지고 있지 않는 특성을 이용해 replica가 가지고 있는 특성을 알아낼 수 있다. (ex) 병원체로서 질병을 유발하는지, 독성을 가지고있는지 등2. Colony PCR은 Insert가 Vector에 제대로 cloning이 이루어졌는지 확인하는 데 그 목적이 있다. 이를 달성하기 위해 primer를 vector의 위치에 따라 다양하게 design할 수 있는데, 어떤 전략이 있을 수 있는지 제시하고 각 전략의 장단점을 비교하시오. (단, 아래의 이미지는 실험에서 사용한 Vector중 MCS의 일부분이다)1. MSC의 양끝에 있는 제한효소사용하기 Acc65Ⅰ와 ApaⅠ 제한효소 사용하기Acc65Ⅰ와 ApaⅠ 제한효소를 이용해 유전자를 자르고 잘려진 Insert를 vector에 삽입을 실시한다면 대량의 유전자를 삽입시켜 한번의 Cloning에 많은 유전자를 얻을 수 있지만 원하는 유전자의 insert 위치가 정해져 있다면 불필요한 부분이 포함되어 배양될 수 있어 효율성이 떨어지고, 크기가 커진 vector는 불안정하여 숙주세포에 안정하게 삽입이 된다고 해도 숙주세포 내에서 분해되어 정상적인 cloning이 이루어지지 않을 것이다.insert내 제한효소 사용하기 EcoRV or NotⅠ그림에서 보면 Insert위치 부근에 있는 효소 EcoRV 및 NotⅠ중 하나를 사용해 잘라준다면 불필요한 부분 없이 insert위치가 잘려 원하는 유전자만을 얻을 수 사용하면 불필요한 부분의 유전자 cloning을 최소화시킬 수 있고 insert가 삽입된 vector의 크기 또한 적당하여 숙주세포 내에 삽입이 되면 안정적으로 cloning이 될 것이다. 하지만 대략적인 insert의 크기를 측정할 수 없어 실험을 통해 insert의 서열과 대략적인 크기를 찾아야하는 불편함이 있다.11, 12주차 통합 결과보고서실험 목적 [10]: 원하는 유전자를 대량으로 얻기 위해 vector(EGFP, mCherry)을 사용하여 Transformation을 실시한 후 PCR을 통해 확인한다.다음에 대해 간단히 설명하시오Transformation, Transfection, Transduction [5]Transformation은 숙주세포(원핵세포)에 식물 세포, 박테리아 및 비 동물성 진핵 세포에서의 DNA를 도입하는 것을 의미한다.Transfection은 진핵세포에 외래 DNA를 도입하는 것으로 이때 외래 DNA는 동물세포를 이용한다.Transduction은 바이러스에 의해 외래 DNA가 세포에 도입되는 과정으로 대표적으로 박테리오파지에 의한 형질도입이 있다.Competent Cell로 사용하는 E.coli Strain의 종류 및 특징 [5]BL21: 널리 사용되는 이 Cell은 T7 RNA 중합 효소를 발현하지 않아 T7 발현을 하지 않는 E. coli 균주로 형질 전환 및 단백질 발현에 적합 하다.BL21 (DE3): 이 Cell은 널리 사용되는 T7 발현 E. coli 균주를 사용하며 형질 전환 및 단백질 발현에 적합한 세포입니다.만일 T7의 발현이 조절되지 않는 경우 봉입체의 축적 및 세포분열의 억제로 이어진다.Lemo21 (DE3): BL21(DE3)에 숙주 기능을 제공하는 동시에, T7 RNA중합효소의 천연 억제제인 리소자임(lysY)의 수준을 조정 가능한 발현을 유발한다. Lemo System이 포함된 competent cell로서 T7 발현에 적합한 화학적으로 유능한 E. coli 세포이다. T7발현의 미세조정은 독성 단백염이 되는데 이 Cell이 E.coli단백질 오염을 최소화하도록 설계되었다.SHuffle ® : T7발현을 하지 않고, 세포질에서 이황화 결합을 포함하는 단백질을 형성하도록 설계된 E.coli균주로서 이황화 결합 isomerase DsbC는 잘못 산화된 단백질을 올바른 형태로 접히도록 촉진한다.SHuffle ® T7: T7을 발현하는 기능만 추가되었다.Primer Sequence를 구상할 때에 고려하여야 할 조건들 [5]: 증폭시키고 싶은 특정 유전자의 서열을 먼저 얻고 이것을 template으로 사용하여 5’과 3’의 상보적인 서열로 primer를 제작해야 한다.Reporter Gene의 개념 및 쓰임새 [5]: Reporter Gene은 nucleic acid서열로서 유전자 발현의 효능을 확인하는데 매우 효율적인 유전자이다. 이 유전자는 DNA 단편의 물리적 위치를 추적하거나, 유전자 발현을 확인하는데 사용할 수 있으며 종종 표적 조직에 도입함으로써, 유전자의 발현 수준을 추적하는데 사용된다.실험 결과 (Transformation) [10]11월 10일 약 18시~11일 약 8시 (총 14시간 배양)붉은색 상자로 표시한 부분이 Colony이며, 전체 plate에서 균일한 모양으로 Colony를 관찰할 수 있다. 이후 Colony를 하나를 얻어 template으로 이용하여 PCR을 수행하면 Plate에서 자란 균주가 재조합 된 균주인지 알 수 있다.실험 결과 (Colony PCR) [10]우리가 사용한 7번 sample에 주입한 vector은 각각 EGFP vector의 크기는 3400bp, mCherry vector의 크기는 711bp이다.Gel의 band가 0.4kb~0.3kb사이에 위치하는 것으로 EGFP만 발현된 것을 확인할 수 있고 mCherry의 band는 0.7kb 부근에서 확인되지 않은 것으로 보아 균주 재조합 시 mCherry는 transformation이 되지 않고 EGFP vector만 transformation된 것으로 확인할 수 있다..kr/products/cloning-and-dna-markers/bacterial-strains-and-competent-cells/" l ":~:text=and%20replicating%20plasmids.-,E.,chemically%20competent%20cells%20and%20electroporation" https://www.promega.kr/products/cloning-and-dna-markers/bacterial-strains-and-competent-cells/#:~:text=and%20replicating%20plasmids.-,E.,chemically%20competent%20cells%20and%20electroporation. Hyperlink "https://international.neb.com/products/competent-cells" https://international.neb.com/products/competent-cells Hyperlink "https://www.ibric.org/search/?category=LABINFO&subcategory=EXPQNA&kwd=PCR+primer+design&pageNum=3&pageSize=20&sort=DATE&reSrchFlag=false&detailSearch=false&preKwd%5B0%5D=PCR+primer+design" https://www.ibric.org/search/?category=LABINFO&subcategory=EXPQNA&kwd=PCR+primer+design&pageNum=3&pageSize=20&sort=DATE&reSrchFlag=false&detailSearch=false&preKwd%5B0%5D=PCR+primer+design Hyperlink "https://www.addgene.org/vector-database/2485/" https://www.addgene.org/vector-database/2485/ Hyperlink "httB

자연과학| 2022.02.06| 7페이지| 2,000원| 조회(806)

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Plasmid prep 생물공학실험 보고서

예비보고서1. Plasmid DNA 형태에 대해 서술하시오.Plasmid DNA는 이중 가닥의 DNA로 이루어져 있으며 원형이지만 선형 Plasmid도 많이 알려져 있다. 크기는 약 1kbp에서 1Mbp까지 다양하며 전형적인 Plasmid DNA는 원형의 이중 가닥 DNA분자이며 염색체 크기의 약 5% 미만이다. 또한 세포로부터 분리한 대부분의 Plasmid DNA는 초 나선 형태(Super coiled)인데, 이는 DNA가 세포 내에 존재할 수 있는 가장 압축된 형태이다. 만약 초 나선 형태에서 지나치게 화학적, 물리적인 힘에 노출이 되면 linear 또는 nick form형태로 변형될 수 있다.2. Plasmid 정제하는 방법 1가지를 서술하시오.Plasmid 정제는 세균의 세포벽을 파괴하여 세균이 가진 plasmid DNA를 얻거나, 재조합 된 세균 내에서 증폭된 plasmid를 추출하는 것으로 소량의 세균배양액으로부터 pH를 이용해 DNA를 분리하기 때문에 alkaline lysis method를 이용한다.먼저 세포벽을 구성하는 고분자화합물결합을 끊기 위해 lysozyme과 세포벽을 유지하는데 필수적인 Ca이온을 제거하는 EDTA를 이용해 세포벽을 깨어준다. Glucose를 이용해 세포가 모양을 유지하게 하고 세포가 완전히 깨지지 않고 변성이 크게 일어난 염색체 DNA는 칼륨과 SDS등을 사용하는데, 즉 Alkaline 상태의 anionic detergent용액에서 detergent에 의해 세포를 lysis 시켜주고 이때 DNA와 Plasmid DNA 모두 alkaline용액에 노출되면 두 형태의 DNA가 모두 변성이 되고 이때 산성용액을 혼합하여 pH가 중성 상태가 되면 염색체 DNA는 크기가 너무 커서 변성 전의 정상적인 topology로 복원되지 못 하면서 더욱 엉키게 되고 plasma DNA는 크기가 작아 정상적으로 복원이 된다. 이후 원심분리를 이용하면 엉킨 DNA와 변성된 단백질 등과 함께 SDS로 가라 앉고 Plasmid DNA는 용액에 녹아 상층액에, 염색체 DNA는 Pellet의 형태로 구분되어 분리된다. Plasma DNA가 들어있는 이 용액을 에탄올 및 Silica를 이용해 흡착시키면 순수하게 plasma DNA만 얻을 수 있다.결과보고서실험제목:Plasmid DNA purification2. 실험 목적:E.coli 세포 속에 들어있는 Chromosomal DNA를 제외한 plasmid DNA를 얻기3. Question1) Plasmid purification kit의 Solution(I,II,III), buffer PW, buffer BL(EQ)의 역할을 서술하시오.: Solution I(Resuspension buffer)은 세포벽을 부드럽게 만들어주는 역할을 수행하는데 이 용액에 포함되어있는 glucose는 삼투압을 일정하게 맞춰주고, tris는 pH를 일정하게 유지시키고, EDTA가 일차적으로 세포벽에 있는 이온들을 제거하여 효과적으로 세포벽을 파괴하는데 도움을 주고 마지막으로 RNase가 포함되어있다. Solution II(Lysis buffer) 용액에 포함된 SDS는 양친매성이며, 일종의 계면활성제로서 단백질을 변성시키고 막을 완전히 파괴시키는 역할을 수행하는데 이는 세포막에 포함된 인지질과 단백질을 제거하여 세포막을 터뜨림으로써 세포 성분의 방출을 유도하고, 이 용액에 포함되어있는 NaOH에 의해 pH가 10~12.5정도 높아져 세포가 터지게 되는데 Chromosomal DNA를 변성시킨다. Solution III(Neutralization buffer)는 NaOH에 의해 높아진 pH를 중성으로 낮추고 변성되었던 DNA들은 renaturation되는데 이때 Chromosomal DNA의 경우 상보적인 가닥을 찾을 수 없어 단백질이나, 세포 부스러기 등 과 엉겨 붙어 단백질과 더불어 불용성의 복잡한 DNA구조를 형성한다. Buffer PW는 washing buffer로 EtOH가 70~80%함유하고 있어 DNA는 녹아 나오지 않고 시약과 colum의 silica resin에 결합되어 있는 DNA주위의 Salt를 씻어내는 역할을 한다.Buffer BL(EQ)도 마찬가지로 Washing buffer로서 column의 bead는 미세한 공극을 가지고 있기 때문에 이 용액을 사용해 씻어주는 역할을 수행합니다.2) alkaline denaturation의 원리에 대해 설명하고 실험방법 중 이 원리가 적용되는 단계를 서술하시오.: Plasmid DNA를 박테리아의 세포에서 분리시켜 주기위해서는 세포를 용해 후 얻어야 하는데, 이 Solution II용액을 넣어주면 NaOH에 의해 세포막이 파괴되고 세포가 높은 pH에 의해 터지면서 alkaline상태가 된다. 이 alkaline된 상태는 박테리아의 Chromosomal DNA를 변성 시키고 이를 통해 수소결합이 약해져 DNA는 single 가닥으로 분리되고, Plasmid DNA는 super coil형태로써 size가 작아서 변성이 되지않는다.3) DNA size를 확인하는 ladder중에는 lambda HindIII(사진 첨부)가 있다. 이 ladder에 대해 간단히 서술하시오.: ladder는 plasmid에 원하는 유전자의 유무를 판단하도록 실험실에서 제작된 물질로써 이번 실험에서는 lambda HindIII을 사용했다. lambda는 박테리오파지의 종류 중 하나를 의미하는데 제한효소 HindIII를 사용해 lambda 박테리오파지의 DNA를 가수분해하면 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125 bp의 8개 절편으로 잘리게 된다. 잘려진 DNA를 가지고 Agarose gel에 loading을 해주면 size별로 band가 뜨는데 이것을 이용해 원하는 유전자가 클로닝된 plasmid속에 들어있는지 판단할 수 있게 도와준다.4. 실험 결과 및 고찰- 자신이 뽑은 DNA의 gel사진에 본인의 lane위에 이름을 표기하여 첨부하고 DNA size에 대해 서술하시오. (size를 계산하는 과정, 예측 등등 서술할 것):loading한 DNA size는 사용한 Marker size의 4361 bp와 같은 선상에 위치해 있어 약 4361bp라고 생각합니다. 사진을 보시면 band모양이 약간 뒤 틀려져 있는 것을 볼 수 있다. 전압을 이용해 전기 영동을 걸어줄 때 band가 다 내려오지 않는 상태에서 stop을 눌렀기 때문에 band모양이 휘어진 것으로 생각합니다. gel사진을 비교해 볼 때 2번의 band가 가장 진하게 나온 것으로 보아 Plasmid DNA의 농도가 가장 높고 3번의 band가 가장 연하게 나온 것으로 보아 Plasmid DNA의 농도가 적거나, 잘못loading하여 buffer에 sample이 빠져나갔을 것이라고 생각합니다. 최종적으로 2번 실험자의 purification이 가장 잘 되었다고 생각합니다.

자연과학| 2022.02.06| 4페이지| 1,500원| 조회(1,291)

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Protein labelling 생물공학실험 보고서

예비보고서단백질에 형광을 표지(labelling)하는 일이 왜 필요한지 설명하시오 (20점): 생물학적 연구에서 특이적으로 원하는 단백질에 공유결합으로 labelling을 실시한다. labelling된 단백질과 결합된 물질의 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해 단백질에 형광을 표지한다. 이 Labelling 기법은 biotin, repoter 효소, 방사성 동위원소 등을 비롯한 다른 분자들이 특정 단백질 또는 nucleotide 염기 서열과 공유결합을 한다. 여러 종류의 표지를 사용할 수 있어 특정 상황에 맞게 다양하게 사용할 수 있으며 표지의 종류 및 기법을 고려하여 사용해야한다.형광의 원리를 설명하고 형광물질인 FITC의 형광량을 측정하기 위해선 어떤 파장을 이용해야 하는지 설명하시오. (30점): 형광은 분자가 높은 에너지의 짧은 파장의 빛을 흡수하여 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을 방출하면서 발광을 나타내는데, 분자가 빛을 흡수하면 분자는 보다 높은 에너지를 갖고 들뜬 상태가 된다. 분자가 들뜬 상태가 되면 불안정하여 에너지를 열의 형태로 방출하거나, 다른 파장의 빛을 방출하면서 원래의 상태로 되돌아와 다시 안정화가 된다. 그래서 각 분자의 종류에 따라 흡수하고 방출되는 빛의 에너지와 파장이 다르기 때문에 각기 분자들은 다양한 형광을 나타내는데, FITC는 약 495nm~519nm의 방출 스펙트럼파장을 가지고 있어 녹색을 나타내며 모든 박테리아에서 형광을 나타낸다.3) silk가 어떻게 형광물질인 FITC와 결합하는지 설명하시오. silk보다 FITC labeling이 더 잘될 것이라 예상되는 단백질은 어떤 것이 있는가? 이유를 들어 설명하시오. (30점): FITC의 경우 형광을 나타내는 물질에 Isothiocyanate가 연결 되어있는 형태로 Isothiocyanate의 구조는 탄소를 중심으로 탄소가 질소와 황에 의해 전자가 끌어당겨져 있다. 이 경우 전자가 고르게 분포하지 않아 불안정한 상태를 유지하는데, 이 탄소는 외부로부터 전자가 풍부한 물질을 끌어들여 안정화를 시켜야 한다. Silk를 구성하고 있는 성분 중 amine기에 질소원자가 들어있어 전자가 풍부한 질소가 전자가 부족한 탄소원자에 전자를 공유시켜 Conjugation system을 통해 전자를 고르게 분포하고 안정화시킨다.FITC을 가장 효율적으로 강한 형광을 만들기 위해서는 가장 효율적인 input이 필요한데, FITC에 가해지는 빛의 파장에 따라 FITC가 만들어내는 빛의 세기는 달라진다. FITC는 495nm 근처 파장의 빛을 받을 때 가장 밝은 빛을 내지만, 다른 파장의 빛을 받을 때는 형광의 세기가 감소한다. 그러므로 silk를 사용하는 것보다 450nm에서 검출되는 HRP(Horseradish peroxidase)를 사용하면 형광의 세기가 증가할 것이라고 생각합니다.4) Dialysis의 원리에 대하여 설명하시오. (20점): Dialysis는 반투막(다공성 셀룰로오스 막)으로 고분자 물질들과 혼합된 저분자 물질들을 농도 기울기를 통해 막 밖으로 확산시키는 것으로 단백질에 적용하면 단백질 외의 분자 및 염 등 크기가 작은 분자들은 막을 통해 빠져나와 확산되지만 단백질은 크기가 커서 막을 통과하지 못하여 단백질만 반투과성 막 내에서 쌓여 단백질의 비율이 증가한다. Dialysis로 단백질 외 분자 및 염을 효과정으로 제거할 수 있지만 단백질을 효과적으로 구별하지 못해 추출한 단백질들을 분리하기 쉽지 않고 농도 기울기가 같아져 0이 되면 크기가 작은 물질의 확산 또한 사라진다.결과보고서FITC가 labelling된 silk의 단백질의 농도(mg/ml)를 계산하시오. (30점) 이를 이용하여 실험에서 사용하였던 silk와 FITC의 molar ratio를 구하시오 (20점)A280 = 0.631, Amax = 0.326, CF = 0.30000, = 437480, dilution factor = 1Silk 단백질 농도 (M) = 0.631nm – (0.326nm x 0.30000) x 1/437480 M-1cm-1Silk 단백질 농도= 1.126 x 10-6 M(M은 mol/L 이므로 mg/ml로 단위 환산이 필요하기 때문에 한 단계 작업을 해줘야 한다.)이때 큐벳의 1cm값을 무시해 줬기 때문에 cm는 생략해 줍니다.PPT의 결과로 Silk의 분자량은 약 75kDa을 이용하면1.126 x 10-6 (mol/L) x 75000g/mol = 0.08445 g/L단위를 mg/ml로 환산 시 0.08445 mg/ml입니다.Silk와 FITC의 molar ration을 구하기 위해서 위의 식으로 FITC단백질의 농도도 같이 구해야 한다.A280 = 0.631, Amax = 0.326, CF = 0.30000, = 68000, dilution factor = 1FITC 단백질의 농도(M) = 0.631nm – (0.326nm x 0.30000) x 1/68000 M-1cm-1FITC 단백질의 농도(M) = 7.841 x 10-6 M우리가 실험에서 Mix silk 1ml, FITC는 5ul를 사용한 결과로Silk 단백질 농도 = 1.126 x 10-6 mol/L x 1L/1000ml x 1ml/10-3ulFITC 단백질의 농도 = 7.841 x 10-6 mol/L x 1L/1000ml x 1ml/5x10-3ul약 1:34.8 비율이 나옵니다.silk 당 labelling된 FITC의 정도를 계산하시오 (20점)Amax = 0.326, = 68000, M = 위에서 구한 값, dilution factor = 1Moles dye per mole protein = 0.326 x 1/68000 x 1.126 x 10^-6Moles dye per mole protein = 4.258입니다.sample의 dialysis 전과 후의 흡광도를 비교해보고 왜 이런 차이가 나는지 설명하시오. (20점)실험 시 우리가 사용했던 dialysis bag은 MWCO로 12~14kDa이다. 이것은 membrane에 단백질크기가12~14kDa되는 것은 투과시키고, 우리가 얻고 싶은 silk의 크기는 약 75kDa이므로 silk만 얻을 수 있다.Dialysis이 전 A280=0.790, A495 = 2.928Dialysis이 후 A280=0.631 A495 = 0.326Dialysis 후 흡광도가 전 흡광도 보다 낮게 측정된 것을 볼 수 있다. 그렇기 때문에 빛을 흡수하는 다른 물질은 걸러지고 흡광도에 영향을 주지 않는 물질과 순수한 Silk만 남아있기 때문에 흡광도가 낮아졌다고 생각합니다.4) 흡광도가 원하는 범위보다 낮게 나오면 보완해야 할 수 있는 방법에는 어떤 것이 있는지 설명하시오. (10점)원하는 흡광도 범위보다 낮게 나오는 경우에는 시료를 보관할 때 빛이 들어가 측정 값에 오차를 줄 수 있으므로 완전하게 빛이 차단된 공간과 빛을 차단시킬 도구를 이용해 시료를 보관해야 하며 실험 시 어두운 공간에서 흡광도를 측정해야 한다. 또한 시료가 오래되어 변성이 될 가능성으로 흡광도가 낮게 측정이 될 수 있어 반응시킨 후 빠른 시간 내에 측정해야 한다.

자연과학| 2022.02.06| 4페이지| 2,000원| 조회(227)

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Animal Cell Culture& Counting 생물공학실험보고서

3주차 예비보고서실험 목적: Cell 계대 하기실험 방법 및 수행 과정 서술Incubate를 열기 전 Cell이 오염되지 않게 손과 후드를 알코올로 소독을 한다.전자현미경으로 Cell의 수, 상태를 확인한다.Pipette을 연결해 기존 plate에 들어있던 media를 버린다.Cell의 balance를 맞춰 주기위해 DPBS를 넣어준다. (wash과정)DPBS를 버린 후 새 trypsin를 넣어준 뒤 현미경으로 다시한번 Cell의 상태를 확인해준다.Trypsin을 제거한 뒤 Cell counting을 위해 growth media를 plate에 넣어 50ml tube에 옮겨 Centrifuge를 돌려준다.Pellet만 남겨두고 상층액은 Suction하여 버려준다.새 growth media를 50ml tube넣고 pipetting을 이용해 뭉쳐 있는 Cell을 풀어준다.일정량의 cell과 trypan blue를 hemocytometer에 넣어 현미경을 통해 직접 눈으로 cell counting을 시작한다.(밝게 빛나는 것은 살아있는 cell, 어두운 것은 죽어 있는 cell이다.)cell수를 계산한 뒤 50ml tube에 있는 cell 적정량과 새 growth media를 새로운 Plate에 옮겨 담아준다.Media가 plate에 빈 공간이 생기지 않도록, cell이 뭉쳐지지 않도록 plate를 충분히 동서남북 방향으로 흔들어준다.Plate를 다시 incubate에 넣어준다.(suspension cell)일정량의 cell과 trypan blue를 이용해 cell counting을 실시한다.새 media와 cell을 새flask에 넣고 shaking incubate에 넣고 3주 뒤 media만 교체를 해준다.실험 시 주의해야할 점Media를 넣고 Centrifuge를 돌린 후 생긴 Pellet을 풀어줄 때 pipette으로 너무 빠르게 풀어주면 cell이 손상할 수 있고, 너무 느리게 풀어주면 cell이 균일하게 풀어지지 않고 뭉쳐져서 배양될 수 있으므로 주의한다.Cell이 마르지 않도록 빠르게 media교체를 한다.Media를 넣을 때 공기방울이 생기지 않도록 주의한다.새 media가 오염되지 않도록 사용했던 pipette은 재 사용하지 않는다.모든 media는 세포에게 손상을 주지 않도록 데워서 사용한다.3주차 결과보고서Cell counting실험 방법 및 수행 과정 서술Flask에 들어있는 배지를 제거하고 DPBS 1ml로 wash를 해준다.(2회반복)DPBS를 제거한 뒤 Flask에 Trypsin-EDTA를 1ml넣어 준 뒤 5분정도 기다린다.DMEM media 3ml을 넣어서 15ml tube에 DMEM media+Trypsin-EDTA를 모아준다.Centrifuge를 1500rpm으로 5 분간 돌려준다.Pellet만 남겨두고 상층액은 제거한 뒤 DMEM media 1ml을 넣어준다.trypan blue 2μL와 cell suspension 10μL를 섞어 hemocytometer에 10μL넣어준다.Cell 수를 계산 한 뒤 새 plate에 cell media 120μL와 DMEM media 3ml을 넣어 CO2배양기에 넣어 배양시킨다.실험 결과(계산 과정 첨부)Day1Day2Counting cell numberCell suspension 농도(cells/mL)최종 seeding cell number (cells)Cell viability (%)Counting cell numberDoubling time (hr)69.5834,000100,08098.6%71.57.75Counting cell number (day1)(77+56+68+77)/4 = 69.5cellCell suspension concentration69.5cell/0.1mm^369.5 x 10^4 cell/cm^3695,000 x 1.2(12/10) =834,000 cell/mLT-25 flask seeded cell number834,000개 : 1ml = 100,000개 : Xml100,000=834,000XX=0.119ml (약 0.12ml)834,000개 : 1ml = Y개: 0.12mlY=834,000 x 0.12=100080개.Cell viabilityTotal : 282Death : 4Survival : 278(278/282) x 100%=98.58%Doubling time(day2)Doubling time equation : t(ln2)/ln(N(t)/N0)t: 시간 N(t): t시간 후 세포 수 , N0: 초기 세포 수= 22hr X ln2 / ln(715000개/10080개) = 약 7.75hrEstablish oxygen diffusion equation for each well.25cm^2xH=3.12cm^3 , H(=Y)=0.1248cm(1): (2x10^-5cm^2/s)x(1.19nmol/ml mmHg)(149.5mmHg/0.1234cm)=2851.04x10^-5nmol/s cm^2 (in)(2): (3x10^-7nmol/s cell)(286cells/cm^2)(0.5mmHg)/1mmHg=4.29x10^-5nmol/s cm^2(oxygenconsumption=out)(1)-(2)=2846.75x10^-5(flow-consumption세포를 T25 flask 표면에서 떼어내어 계대배양을 하기 전에 먼저 DPBS와 Trypsin-EDTA로 rinsing하는 이유는 무엇인가?: DPBS를 넣어주는 이유는 FBS에 Trypsin을 불 활성화시켜주는 Trypsin inhibitor이 들어있기 때문에 DPBS로 세척시켜준다. 세포는 세포막에 adherent protein이 plate 바닥에 코팅 되어있는 물질과 결합을 하는데 Ca 2+와 같은 2가 양이온이 필요하다. Trypsin-EDTA는단백질 분해효소로써 adherent protein이 2가 양이온을 사용하지 못하게 하여 cell과 plate의 결합력을 감소시켜준다. Trypsin-EDTA를 오래 처리할 경우 동물세포 막의 단백질도 분해되어 세포가 사멸할 수도 있다.동물세포 배양기는 CO2 농도를 5%로 유지하여야 한다. 그 이유는 무엇인가?: growth media는 pH를 조절하고 pH변화에 대해 배양중인 세포를 완충시킨다. 이 Ph는 용존 이산화탄소와 중탄산염의 균형에 의존하기 때문에 CO2변화는 PH를 변화시킬 수 있다. 따라서 CO2와 중탄산염을 기반으로 된 완충액을 사용해 세포를 배양할 때 특히 세포가 개방된 plate에서 배양하거나, 형질 전환된 세포가 고농도로 배양되는 경우 외부에서 CO2를 공급해주어야 유지될 수 있다.: 이번 실험은 3T3-L1 cells라는 세포를 종족 유지시키기 위해 계대배양 실험을 실시했다. 처음으로 직접해본 실험으로써 실험 도구를 다루는 방법이 조금 서툴러서 hematocytometer를 현미경에 올려 놓을 때 뒤집어 올려놔서 cell counting할 시료를 다시 만들어서 총 12μL를 낭비했고, Cell이 media에 가라앉기 전에 빠르게 10μL와 trypan blue 2μL를 섞어야 했는데 도구를 잘 못 두어 다시 sample를 만들 때 cell을 pipetting으로 풀지 않고 cell이 가라앉은 10μL를 뽑았기 때문에 cell counting할 때 cell의 양이 많이 나온 것 같다.

자연과학| 2022.02.06| 3페이지| 1,000원| 조회(143)

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