1-1 PCR 정의 및 특징 1) 정의 polymerase chain reaction으로 DNA polymwerase를 통해 원하는 DNA를 증폭하는 기술이다. 아주 미량인 DNA시료에서 원하는 특정 DNA를 수시간에 약 20~50만배로 증폭시킬 수 있다.2) 특징① 일반적으로 PCR(Denaturing->Annealing->Extension) cycle을 약 30번정도 반복하여 target DNA를 약230개로 증폭시킨다.② 세 번째 Cycle에서 target sequence만의 amplify가 나타난다.1-2 PCR 원리 및 과정1) Denaturation(95℃) : 열을 통하여 DNA를 double-strand에서 single-strand로 분리시킨다.2) Annealing(55~65℃) : 온도를 낮추게 되면, single-strand로 변성된 DNA와 primer가 서로 complement하게 결합한다.3) Extension(72℃) : dNTP가 존재하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 연장시킨다.1-3 DNA polymerase 정의 및 특징1) 정의DNA를 template으로 하여 상보적인 DNA 가닥에 nucleotide를 결합하여 새로운 DNA를 합성하는 효소이다.2) 특징 ① DNA를 template으로 하여 DNA를 합성하는 효소는 DNA-dependent DNA polymerase라고 하며, RNA를 template으로 하여 DNA를 합성하는 효소는 RNA dependent DNA polymerase, 혹은 Reverse transcriptase라고 한다.② 다양한 DNA polymerase가 있지만, Taq polymerase가 주로 사용된다.
1-1 Western Blotting1) 정의- 단백질을 감지하고, 양을 확인하여 분자량을 측정할 수 있는 방법- 찾고자 하는 단백질의 antigen epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는 방법- 단백질을 polyacrylamide gel에서 electrophoresis를 이용하여 분리하고, nitrocellulose membrane에 옮긴 후, 찾고자 하는 단백질의 primary antibody와 primary antibody와 반응하는 secondary antibody를 이용하여 band를 형상화하는 과정 2) 특징 - Protein sample을 얻는 Sample preparation, Electrophoresis를 위한 Gel preparation, Transfer, Antibody reaction 등의 여러 개별 단계가 포함된다. - Southern Blot이나 Northern Blot 과정에는 대개 Agarose gel electrophoresis를 포함 하는 반면, Western Blot은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 포함한다. - 여러 단백질 중에서 원하는 단백질만을 시각화하여 검출하는 방법으로 fluorescence (fluorescein isothiocyanate), enzyme reaction (peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase), radioactivity 등의 방법이 이용되고 있다.
1. Background* Cell Transfection1-1 Cell transfection1) 정의 - 관심있는 외부 gene을 삽입하여 외부의 DNA가 cell 내에서 발현되도록 하는 것 - Virus 감염 이외의 방법을 사용하여 핵산(DNA 또는 RNA)을 cell에 인공적으로 도입하 는 과정 2) 특징 - Cell의 특성을 변화시켜 cell 수준에서의 유전자나 단백질의 발현과 기능을 연구할 수 있다. - Eukaryotic cell의 유전자 산물 및 기능을 연구할 수 있는 analytical tool이다. - 유전자의 발현과 단백질 생산의 조절 분석에 사용할 수 있기 때문에, Genomics와 Proteomics 사이의 연결고리가 될 수 있다. - 유전물질을 cell에 성공적으로 도입하는 것은 DNA의 quantity 및 quality, incubating 시간, transfection reagent의 비율, transfected cell의 origin, 그리고 cell culture 내 serum의 유무 등에 따라 달라진다. 3) Transfection 방법 - Chemical Methods ① Calcium-Phosphate 원리 : (+)charge를 띠는 calcium phosphate가 (-)charge를 띠는 DNA와 만나 복합체를 형성하고, 복합체가 cell의 표면에 흡수되고 endocytosis를 통해 cell 내로 진입한다. 특징 : 독성은 없지만, 20~50%의 Transfection 효율로, Primary cell에서는 transfection 이 잘 되지 않는다. ② DEAE-Dextran 원리: (+)charge를 띠는 cationic polymer를 (-)charge를 띠는 DNA와 만나 복합체를 형 성한 후, (+)charge를 띠는 DNA가 (-)charge를 띠는 cell membrane에 융합되 고 endocytosis를 통해 cell 내로 진입한다.
* Cell Culture1-1 Cell Culture1) 정의 - cell을 단독으로 분리시켜 배양하는 과정 -동물이나 식물에서 채취한 세포가 자라기 좋은 인공적으로 조성된 환경에서 성장을 유지 하는 과정 -동물세포배양 : 동물체의 생체조직에서 세포를 분리하여 배양 배지 내에서 유지, 증식시 키는 과정 -식물세포배양 : 화학적 조성이 알려진 배양 배지에서 식물 세포를 생장시키고 유지하는 과정 2) 특징 - Cell culture는 일반적으로 목적하는 cell 이외에 다른 오염 생물이 없어야 하기 때문에 항상 무균 상태에서 이루어져야 한다. - Cell culture condition은 각 cell 유형에 따라 다르다. - Cell은 항상 amino acid, vitamin, mineral, carbohydrate와 같은 필수 영양소를 공급 하는 배지와 성장인자, 호르몬 및 O2, CO2, pH, temperature, osmotic pressure과 같은 적절한 물리화학적인 환경이 유지되어야 한다.1-2 Subculture1) 정의 - Cell culture 후, cell이 많이 자라게 되면 일부 cell을 새로운 plate로 옮겨서 배양하는 과정 - Cell 증식을 위해 새로운 배양 plate에 옮겨 cell의 대를 계속 이어서 배양하는 방법 - 제한된 배양 plate내에서는 cell이 증식을 멈추게 되므로, 이를 막고 cell이 계속해서 증 식하도록 새로운 공간을 제공해주는 방법 2) 특징 - 대부분의 동물 세포는 표면에 부착하여 생장한다. - 일반적으로 세포주의 confluency가 약 80%에 도달하면 subculture를 해야 한다. - Cell의 특성에 따라 Subculture 방식에도 차이가 있다.