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생화학및분자생물학실험 Medium preparation and Restriction enzyme 결과보고서

Medium preparation and Restriction enzyme결과보고서실험 목표- 미생물 배양에 이용되는 다양한 배지와 역할에 대해 배워보고, 직접 제조해 봄으로써 생화학 실험에 대한 기초적인 테크닉을 익힌다.- Endonuclease와 Exonuclease에 대해서 알아보고, 그 중 type 2 endonuclease에 속하는 Nde 1과 Hind 3를 이용하여 vector와 insert에 restriction enzyme처리를 해본다.실험 결과고체배지 만들기 (100 ml 기준)준비된 시약(LB broth 2.5g, Agar 1.5g)과 D.W 100ml을 삼각 플라스크에 모두 넣어준 뒤 autoclave로 멸균 후 천천히 식혀주었다. 알코올 램프를 켜고 식혀진 고체배지 용액(50 ℃ 이하)에 항생제를 첨가 후 각각의 준비된 plate에 20~25ml씩 분주하여 천천히 굳혔고 이후 고체배지가 굳으면 Wrap으로 싸서 냉장 보관(4℃)하였다.Restriction enzyme 처리Autoclave된 e-tube에 (Volume이 큰 순서대로) D.W, 10X reaction buffer를 넣고 이 용액을 insert DNA e-tube와 vector DNA e-tube에 각각 mix하였다. 그리고 insert DNA e-tube와 vector DNA e-tube 각각 restriction enzyme인 Nde I 과 Hind III를 넣었다. (용액의 양은 위 표 참고) 그리고 두 개의 e-tube를 37℃ heating block에서 2시간 incubation한 뒤 agarose gel 전기 영동을 시켰더니 아래와 같은 결과가 나왔다.왼쪽 marker 기준, Vector DNA의 size를 살펴보면 제한효소 처리가 되지 않은(uncut) 부분은 약 5000bp와 5000bp를 훨씬 넘는 크기, 즉 두 개의 band가 나왔다. 제한효소 처리 후 gel extraction을 통해 추출한 DNA의 size는 약 4000bp~5000bp 사이인 약 4500bp 정도로 하나의 밴드가 나타난 것을 알 수 있었다.왼쪽 marker 기준, Insert DNA를 살펴보면 PCR product는 위에서 아래로 끌리는 현상이 발견됐고 size는 약 1200bp정도로 나타났다. gel extraction 과정을 거친 뒤에는 1000bp~1200bp 사이인 약 1100bp정도로 하나의 밴드가 나타났다.토의사항Vector DNA, Insert DNA 전기 영동 결과에서 Nde I 과 Hind III, 즉 두 개의 제한효소로 처리했음에도 밴드가 하나만 나온 이유는 절단 자리가 하나밖에 없기 때문이다.(+)극 부분에 vector cut 이후 DNA가 extraction된 이유는 DNA의 phosphate group이 음전하를 띠고 있기 때문이다.이번 실험에서 아쉬웠던 점은 메스 실린더 눈금을 읽을 때 평평한 곳에 두고 눈금과 눈높이를 맞춰 읽어야 오차가 발생하지 않는데 그렇게 하지 못했던 것이 아쉬웠다. 또한 vector와 insert의 유전자 제한 지도를 참고하면 어느 제한효소로 인해 잘린 것인지 알 수 있었을 텐데 유전자 제한 지도 정보를 찾을 수 없었던 점 또한 아쉬웠다.실험 중 궁금한 점Vector DNA 전기 영동 결과에서 제한효소 처리하지 않은 것은 밴드가 2개가 나오는 이유가 무엇인지 궁금했다.PCR product 결과에서 밴드 끌림 현상(퍼짐 현상)이 나타난 이유와 이를 해결하려면 어떻게 해야 하는지 궁금했다.

자연과학| 2021.06.08| 2페이지| 3,500원| 조회(204)

화학, 결과레포트, 생화학및분자생물학실험

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생화학및분자생물학실험 Protein 정량/SDS-PAGE 예비보고서

Protein 정량/SDS-PAGE예비보고서실험 목적정제한 G protein alpha S1을 단백질 정량법 중 하나인 bradford assay를 통해 단백질의 양을 확인한다.정제한 단백질 sample을 전기영동(SDS-PAGE)하고 Coomassie brilliant blue R-250을 이용하여 염색 단백질을 염색해본다. 이를 통해 정제된 단백질의 purity 와 size를 확인해본다.이론Protein quantification methodProtein quantification 원리정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정활성과 농도가 정량 분석의 핵심이며, 단백질의 농도, inhibitor 유무, Sensitivity 등을 기반으로 여러 분석 방법 중 하나를 선택함Protein quantification 종류① BCA (Bicinchoninic Acid) assay: 단백질이 구리 이온(, )을 환원시킬 수 있는 성질을 이용한 분석법이다.Lowry법을 계량한 것으로, Follin acid 대신 Bicinchoninic acid(BCA)를 사용하는 2 step 과정이다.* 장점: 최종 sample 안정성이 높아 고온에서 단백질 정량 가능, 방법 간단단점: 반응이 느림. 단백질 변성 우려② Absorbance 280nm (UV assay): 방향족 아미노산인 Phe, Tyr, Trp에 의한 280nm에서 최대 흡광을 이용한 방법이다.주어진 단백질을 구성하는 Phe, Tyr, Trp의 잔기 개수를 알면 자외선 흡광 계수를 계산할 수 있고 자외선 흡광 계수를 알면 시료의 농도를 측정할 수 있는데, 이때 Lambert-Beer 법칙이 적용된다.- Lambert-Beer 법칙:A= εbcε: molar absorption coefficient (L·mol-1· cm-1)b: path length (cm)c: molar concentration of the sample) (mol/L)* 장점: 사용한 단백질 재사용 가능, 단백질의 변성 없음단점: pH, ionic strength, buffer 등의 영향을 받음.③ Bradford assay: UV-visible spectrophotometer를 이용해 흡광도를 측정하여 standard 물질인 BSA나 BGG를 기준으로 자신의 시료에 단백질이 얼마만큼 들어있는 지 측정하는 방법이다. (Standard 물질과 Dye 처리한 단백질의 흡광도를 비교함.)Dye로 Coomassie Blue G-250 사용하면 acid 조건하에서 단백질과 dye과 결합하고, 갈색 용액(465nm에서 최대 흡광)이던 dye가 청색 용액(610nm에서 최대 흡광)으로 스펙트럼이 이동한다. 두 용액 차가 595nm가 되는데, 이 때가 측정 시 최적의 파장이다.* 장점: 간단하고 시간이 적게 소모단점: Lowry나 BCA 분석법에 비해 2배가량 감도가 높음.④ Biuret assay: 단백질의 peptide bond와 뷰렛 시약의 의 결합을 통해 단백질을 정량하는 방법이다. 단백질의 nitrogen에 결합한 이온은 보라색의 착화합물을 형성한다.* 장점: 계면활성제의 영향이 적음단점: 낮은 감도로 인해 비교적 많은 양의 단백질(1~20mg) 필요⑤ Lowly assay (Folin-Ciocalteau): Biuret assay에 기반을 둔다. 가 Follin reagent와 Folin-ciocalteau 반응을 하는 원리를 이용하는 2 step 과정이다.- 1 step: Biuret reaction- 2 step: Folin-Ciocalteu reaction: 와 Trp, Tyr의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex(노란색))를 환원시켜서 진한 청색으로 변함.* 장점: 5ug/ml 정도의 단백질 양을 정량 할 수 있는 민감도를 가짐.단점: 절차가 복잡하고 다른 화학물의 간섭을 많이 받음.SDS-PAGE method (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoration): 단백질의 크기를 분석하는 가장 일반적인 방법이다. 단백질에 SDS를 반응시켜 (-) 전하를 띠게 한 후, Polyacrylamide gel에 단백질을 분주하여 크기에 따라 분리하도록 한다.* SDS ->단백질의 구조를 풀어주어 모든 단백질이 풀어진 구조의 상태로 전기 영동 하기 위해서->단백질이 가지고 있는 고유의 전하를 없애고 크기에 따른 (–)전하를 부여하기 위해서* Sample loading dye (Sample buffer): 전기영동을 하기 전 단백질과 섞어주어 단백질을 denaturation 시키고 (-)전하를 가지게 한다.* Gel 조성- 4 x Separating gel buffer (1L) = 1.5 M Tris-Cl (pH8.8) + 0.4 % SDS + 3’DW- 4 x Stacking gel buffer (1L) = 0.5 M Tris-Cl (pH6.8) + 0.4 % SDS + 3’DWAcrylamide/bis-acrylamide: 가교 형성하는 재료Ammonium persurfate (APS): Radical 반응을 시작시키는 개시제Tetramethylethylenediamine (TEMED): Radical 반응과 polymerization을 촉매* Separating gel / Stacking gelSeparating gel이 하는 역할: 단백질을 크기 차이에 의해 분리시킨다.Stacking gel이 하는 역할: 단백질이 동일선상에서 출발할 수 있도록 정렬시킨다. 즉 분자의 크기 차이에 의한 분리를 더 정확히 할 수 있다.* Isoelectric point (pI): 단백질의 알짜 전하가 0이 될 때의 pH등전점(pI) 전기영동(isoelectric focusing): 단백질이 가지고 있는 산성과 염기성 잔기들의 상대함량에 근거하여 전기영동법으로 분리할 수 있다.* SDS running buffer25 mM Tris-Cl pH8.3 + 192 mM Glycine + 0.1% SDS* SDS-PAGE Staining- 일반적으로 CBB법이 간편하고 저렴하며 감도도 우수한 편이다. (detection limit: 100 ng)- 보다 높은 감도로 detection이 필요할 때에는 silver staining법을 이용한다. (~ng)- SDS-PAGE Coomassie blue Staining: 1g Coomassie brilliant R250 + 45% Methanol + 10% Glacial acetic acid + DW (1 L)- SDS-PAGE Coomassie blue Destaining45% Methanol + 10% Glacial acetic acid + DW (1 L)Or boiling in waterMethanol: protein 고정 (protein의 확산 방지).Acetic acid: Protein과 Coomassie brilliant R250의 결합력 강화실험방법 및 주의사항Bradford assay (Protein quantification)① Standard curve를 그리기 위해 BSA solution을 농도 별로 준비한다.② BSA (2mg/ml in PBS)를 준비한 뒤 ½씩 dilution 하여 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, ...... 총 8개의 농도로 준비한다.③ 정제한 단백질(sample)은 without dilution, 1/2 dilution, 1/10 dilution 총 3개의 농도로 준비한다.④ 96well plate에 농도 별 준비한 BSA 8종/단백질 3종을 2개씩 10ul씩 넣어준다.⑤ 1X bradford solution을 240ul씩 넣어주어 반응을 진행시킨다. (상온에서 10분)⑥ Plate reader를 통해 595 nm에서 absorbance를 측정한다.⑦ BSA를 통해 standard curve를 그린 후 정제한 단백질의 농도를 계산한다.SDS-PAGESample preparationSample (80 μl)과 5x sample buffer (20 μl)를 섞어 약 10분간 끓인다.Centrifugation해서 10초간 spin down 시킨다.Gel preparation (※ SDS는 발암물질이므로 장갑 착용 후 진행)Gel kit를 조립한다.Acrylamide의 농도를 선택하고 separating gel 용액을 만든 후 pipetting하여 바로 Gel kit에 넣는다.Isopropanol을 위에 넣어준다.Gel이 다 굳으면 물로 깨끗이 씻어준 뒤, stacking gel 용액을 만들어 넣은 후 comb을 꼽는다.굳으면 분리해서 사용한다.Gel loadingGel에서 comb를 뽑고 잘 분리한다.전기 영동 장치에 gel을 설치하고 SDS-running buffer를 채워준다.Pipet을 이용해서 well에다 sample (25 μl)을 잘 채워준다.Gel running160V, 400 mA 설정 후 55분간 전기영동 한다.Gel staining전기 영동이 끝난 gel을 separating 부분만 잘 분리한다.Staining solution이 담긴 통에 넣어주고 20분간 기다린다.Gel destaining끓는 물에서 10분가량 끓여준다.

자연과학| 2021.06.08| 6페이지| 3,000원| 조회(306)

화학, 예비레포트, 생화학및분자생물학실험

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생화학및분자생물학실험 Plasmid miniprep / DNA electrophoresis / Transformation 예비보고서

Plasmid miniprep / DNA electrophoresis / Transformation예비보고서실험 목적Plasmid mini prep kit를 이용해서 E.coli로부터 DNA를 분리하여 정량 해보고 Agarose gel electrophoresis를 통해 확인한다.얻어진 DNA와 Protein Expression용 Competent cell을 이용하여 Transformation한다.이론Electrophoresis: 콜로이드 용액 속에 전극을 넣고 직류 전압을 가했을 때 콜로이드 입자가 어느 한쪽의 전극을 향해서 이동하는 현상.Agarose gel electrophoresis: gel electrophoresis의 하나로서 정제된 한천 겔(gel)을 지지체로 사용하여 직류 정전압의 전류를 통함으로써 하전된 목적물질을 분리한다. 핵산 특히 DNA 분자나 그의 단편(제한효소처리로 생성된 단편)의 분리에 사용되고 있다. 보통 0.5~2.0% 농도의 agarose를 사용한다. 이 겔(gel)을 유리관 중에 만든 디스크(disc)식과 수직 혹은 수평의 겔 판(gel plate) 중을 전기 이동시키는 평판식이 있다. DNA는 -(음)로 하전하므로 ＋(양)전극으로 영동 하며 분자의 크기에 따라 작을수록 빨리 영동 한다. 또 영동속도는 DNA 분자의 형상에 따라서도 다르며 같은 분자량이라도 폐환상, 직쇄상, 개환상의 순으로 이동한다. DNA의 위치는 에티듐브로미드 용액으로 염색시켜 자외선으로 조사하면 붉은 색 또는 오렌지색의 밴드로 검출된다. DNA의 제한효소처리와 조합시켜 DNA 단편의 분자량결정, plasmid의 검출, 특정 DNA 단편의 분리 등 핵산 연구법 중에서도 장치의 간편화 등으로 일상적인 방법으로 이용되고 있다Plasmid mini prepMini prep: DNA를 소량 추출한다는 의미이며 Plasmid DNA를 추출하는 것이 목적이다.원리: 세균의 세포벽과 세포막을 부수고 DNA만을 분리한다. Chromosomal DNA와 Plasmid DN종류Alkaline Lysis Mini prep가장 일반적으로 쓰이는 분리법이다. Plasmid DNA는 Plasmid를 지니고 있는 Bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 SDS, NaOH를 함유하는 용액으로 처리해 용균 된다. (SDS는 Bacterial Protein 변성, NaOH는 Chromosomal DNA와 Plasmid DNA 변성) 다음 Potassium Acetate를 첨가해 혼합액을 중성화 시키는데 이것은 Covalently closed plasmid DNA를 빠르게 Reanneal 시킨다. Chromosomal DNA와 Bacterial Proteins의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로 제거될 수 있다. (SDS와 Potassium은 화합물을 이룬다) Plasmid DNA는 상등액에 남게 되고, Ethanol Precipitation으로 집중시킬 수 있다.Boiling mini prepPlasmid를 지닌 Bacteria는 Lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨질 수 있다. Chromosomal DNA는 상등액에서 Tsopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. Boiling mini prep는 적은 양의 Plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만, 분리된 Plasmid DNA는 Alkaline lysis mini prep보다 quality가 떨어진다.Lithium mini prepPlasmid DNA는 평판 또는 액체 배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacteria cell은 Trito X-100/LiCl과 Phenol/Chloroform을 처리해야한다. 이것은 Plasmid DNA의 가용성화와 Chromosomal DNA, Cellular debris 등에 침전을 일으킨다. Debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 방법으로 Chromosomal DNA 등을 제외 유전자와 숙주와 plasmid사이의 상호작용에 의해 결정된다. plasmid는 한가지 이상의 유전자를 암호화하고 있는데, 숙주의 생장에 필수적인 유전자를 지니지는 않지만 특정 환경에 생존하기 위해 중요한 기능을 수행하는 경우가 많다.DNA quantitationSpectrophotometry원자 또는 분자가 외부에서 빛 에너지를 흡수 → 분자운동 (전자 전이 및 진동, 회전, 병진)바닥 상태에 있는 원자나 분자는 그 종류에 따라 특정 파장의 자외선 및 가시광선을 흡수하며 전자전이를 일으키면서 흡수 스펙트럼을 나타낸다.흡수하는 파장 → 원자 또는 분자의 전자구조, 조성흡수하는 빛의 세기 (흡광도) → 원자나 분자의 농도 결정A= εbc(ε: molar absorption coefficient (L·mol-1· cm-1), b: path length (cm), c: molar concentration of the sample) (mol/L))double-stranded DNA 0.020 (μg/ml)-1 cm-1single-stranded DNA and RNA 0.027 (μg/ml)-1 cm-1T (Transmittance) = I1/I0 and %T = 100 x TA (Absorbance) = log10 I0/I1 = log10 1/T = log10 100/%T = 2-log10 %TA260: DNAA280: ProteinA260/280: Purity (DNA and RNA: 1.8 and 2.0)A260= 1.0 → 50μg/ml double-stranded DNA→ 40μg/ml single-stranded DNA→ 20μg/ml single-stranded oligonucleotide< Cuvette >glass: visible (>370nm)quartz cell: UV & visibleplastic cel: visibleIntensity of fluorescence emitted by ethidium bromide: Comparison with fl은 환경적 변화로 인해 유도될 수 있고, 혹은 실험실에서 인위적으로 만들 수도 있다. 실험적 조건에서, 한 종류의 박테리아에서 추출된 DNA는 유전적 형질이 다른 박테리아에 삽입하여 수용한 박테리아의 유전형질을 변화시키는 것이다. 이러한 자연적인 유전물질의 이동 과정은 질병과는 아무런 연관이 없으며 박테리아가 여러 스트레스 상황에서 DNA 손상에 대한 재조합 수선(repair) 과정을 증강시키는 이로운 적응과정으로 생각되고 있다. 시험관 내에서의 형질전환을 위해서 염화 칼슘과 같은 물질을 이용하여 박테리아 세포벽을 유연화 시켜 DNA 흡수에 좀 더 용이하도록 도와줄 수 있다.실험방법Cell pre-Inocluation지난 시간에 Transformation을 통해 얻은 colony 1개를 Ampicillin이 들어간 5 ml LB media에 접종한다. (전날 6시 진행)접종 후 37ºC incubator에서 16~18시간 incubation한다.Incubation이 끝난 후 Plasmid mini prep kit를 사용하여 Plasmid DNA를 추출한다. (여기서부터 수업시간에 진행)Plasmid mini prep protocolCell culture 5 ml을 Centrifuge 하여 Cell Down 시키고, Supernatant는 제거한다.Pellet에 Buffer S1 250 μl를 섞어 Pellet을 풀어준다. (Vortexing or pipetting)Buffer S2 250 μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)Buffer S3 350 μl를 섞어준다. (Inverting 4~5회)10분 동안 Centrifuge 한다.Centrifuge 후, Supernatant을 Spin column으로 옮긴다. 그리고 30초간 Centrifuge를 해준다.PE(Wash Buffer) 750 μl를 섞고 30초간 Centrifuge를 해준다.추가로 Centrifuge를 1분간 더 해준다. (건조)Spin column에 distilled H2O 50μlside 벽면으로 밀어 제거한다.Comb를 꽂아준다.20분 이상 gel이 굳을 때까지 가만히 둔다.1X TAE buffer로 채워져 있는 보관통에 넣어 보관한다.준비물: 1% agarose gel, TAE buffer, DNA marker, 6X DNA loading dye, power supply, 전기 영동기Plasmid mini prep 후 얻어진 Plasmid DNA에 6x dye (final 1X)를 섞는다. (6x agarose gel loading dye: bromophenol blue, glycerol이 포함)전기 영동기에 1% agarose gel을 올려놓고 TAE buffer를 gel 이 잠길 정도로 채운다.1% agarose gel의 well에 Sample과 Marker를 loading한다.Electrophoresis(100 V, 20 min)를 진행한다.Distilled water 2μl 로 blank를 잡는다.Sample 2μl의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 확인한다.출처www.ibric.org >my board> view: plasmid DNA의 분리 및 정제방법[네이버 지식백과] 플라스미드 [plasmid] (미생물학백과) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5145033&cid=61232&categoryId=61232" https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5145033&cid=61232&categoryId=61232[네이버 지식백과] 전기이동 [electrophoresis, 電氣移動] (두산백과) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1139390&cid=40942&categoryId=32252" https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1139390&cid=40942&categoryId=32252[네이버 지식백과] 아가로오스 젤 전기영동(아가로오스 겔

자연과학| 2021.06.08| 8페이지| 3,000원| 조회(1,570)

화학, 예비레포트, 생화학및분자생물학실험

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생화학및분자생물학실험 Protein 정량/SDS-PAGE 결과보고서

Protein 정량/SDS-PAGE결과보고서실험 목적정제한 G protein alpha S1을 단백질 정량법 중 하나인 Bradford assay를 통해 단백질의 양을 확인한다.정제한 단백질 sample을 전기영동(SDS-PAGE)하고 Coomassie brilliant blue R-250을 이용하여 염색 단백질을 염색해본다. 이를 통해 정제된 단백질의 purity 와 size를 확인해본다.실험 결과이번 SDS-PAGE 실험에서는 pre-made gel을 사용했다. 전기 영동 장치에 pre-made gel을 설치하고 SDS-running buffer를 채워주었다. 그 후 SDS-PAGE에 걸 sample(sample 12μl+4X dye 4μl=16μl)을 만들었다. -> 정제한 단백질(sample)은 cell lysis한 것, Flow through, 정제할 때 wash했던 것, 정제 후 받은 elution으로 종류를 달리하여 각각 12μl씩 채우고 그 각각의 sample에 sample loading buffer를 4μl씩 넣었다.sample들을 100℃에 5분동안 boiling한 뒤에 이 sample들을 SDS-PAGE set에 loading하여 SDS-PAGE를 걸어주었다. 크기 비교를 위해 미리 염색이 되어있는 protein marker를 같이 걸어주었다. Loading 후에는 160V에 40분동안 전기영동을 시켜주었다. (기계 전원을 켜면 기포가 올라오면서 SDS-PAGE가 시작되는 것을 관찰할 수 있다.)전기영동 후 gel이 내려오면 staining 해서 단백질을 가시화했다. -> Gel에 Coomassie brilliant blue R-250을 넣어 염색-> 전기영동 후 gel이 내려온 모습Nano drop이라는 프로그램을 이용해 UV를 통한 단백질 정량을 진행했다. 사용했던 buffer를 blank로 잡아주고 elution 받았던 용액을 nano drop에 loading한 뒤 프로그램을 돌렸더니 단백질 농도가 3.035mg/ml인 것을 확인했다.target인 G protein의 크기는 45kDa이다.토의사항 및 고찰SDS는 발암물질이므로 장갑 착용 후 진행했다.정제한 단백질(sample)에 각각 4μl씩 sample loading buffer를 넣어 단백질들이 잘 가라앉도록 해주었다.각 sample들을 100℃에 5분동안 boiling하여 denaturation 되지 않은 단백질들을 모두 denaturation 시켰다.Sample loading buffer에 glycerol이 들어있어 용액이 가라앉는다.단백질 정량: Protein A280을 선택한 뒤 이번 실험에서 사용한 단백질의 크기(43.90)와 extinction coefficient level을 입력해야 하므로 Lambert-Beer 법칙에 의해 몰 흡광 계수(35.87)를 입력했다.Wash를 거친 후 최종 elution 상태에서 band가 45kDa 근처로 진하고 깔끔하게 나타나는 것을 관찰할 수 있다.이번 실험에서 궁금한 점결과 사진에서 elution부분의 band가 왜 약 35~45kDa까지 넓게 나온 것인지 궁금하다.

자연과학| 2021.06.08| 2페이지| 3,500원| 조회(301)

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생화학및분자생물학실험 Plasmid miniprep/DNA electrophoresis/Transformation 결과보고서

Plasmid miniprep / DNA electrophoresis / Transformation결과보고서*****과 ***** ***실험 목적- Plasmid mini prep kit를 이용해서 E.coli로부터 DNA를 분리하여 정량 해보고 Agarose gel electrophoresis를 통해 확인한다.- 얻어진 DNA와 Protein Expression용 Competent cell을 이용하여 Transformation한다.실험 결과Plasmid mini prep 결과: DNA 순도를 계산하는 것은 A260/A280 이 1.8~2.0 사이 값인지 확인하는 방식으로 이루어지는데 실험 결과 1.9가 나왔으므로 purity는 괜찮다고 볼 수 있다.Agarose gel 전기 영동 결과: Plasmid vector의 크기: 6000bpSupercoiled DNA 상태이기 때문에 원래 크기보다 작은 band 위치에서 보인다.토의사항이번 실험은 Alkaline lysis법을 이용하여 E.coli 세포로부터 plasmid DNA를 추출하고 plasmid DNA의 크기를 전기영동을 이용하여 측정하는 실험이었다. 선택적으로 plasmid DNA만 분리하기 위해 miniprep kit(세포벽을 파괴하는 역할을 하는 S1 buffer, 세포막을 파괴하고 DNA를 변성시키는 역할을 하는 S2 buffer, 단백질 변성의 정도의 차이를 이용하여 원형의 plasmid DNA만을 원형회복 시키고 변성된 단백질이나 핵산이 원형회복 하는 것을 억제하고 응집시키는 역할을 하는 S3 buffer, 남아있는 염들을 씻어내고 plasmid DNA 순도를 높여주는 역할을 하는 PW buffer, 사용한 Column의 membrane에 붙어있는 plasmid DNA를 녹여내는 역할을 하는 EB buffer로 구성)를 이용하였다. Plasmid miniprep 실험 결과 DNA 순도가 알맞게 나왔다.DNA 전기 영동 시 (+)극으로 이동하는 이유: DNA의 당 인산 골격이 음전하를 띠기 때문에 수용액 상태에서 전류를 가할 때 DNA가 (+)극으로 이동한다.양이온과 음이온이 서로 끌어당겨서 DNA의 이동을 돕는다. TAE buffer의 Tris base는 수용액 상태에서 Tris 이온으로 존재한다. 전기장에서 음전하를 띠는 DNA가 양극으로 이동하는 동시에 Tris 양이온이 음극으로 이동한다. 이온이 각 극으로 이동하면서 중간에 서로를 끌어당기고 이동이 촉진된다. 또한 양전하는 수용액 전체에 골고루 분포되어 있어서 (-)극으로 먼저 이동을 마무리하는데 이 때 (+)극이 상대적으로 빈자리가 되어 DNA가 빈 곳을 채워주려고 이동할 수 있다.* TAE buffer는 이온 용량이 작기 때문에 음극과 양극 사이 buffer를 순환시켜 음극에 몰려 있는 Tris 양이온을 전기 영동 중간에 양극 쪽으로 순환시켜주면 DNA가 더 빠르게 (+)극으로 이동할 수 있다.전기 영동에 영향을 주는 요인1) DNA의 크기: 크기가 작으면 빠르게 이동하고 크기가 크면 이동에 방해를 받아서 천천히 이동한다.2) agarose의 농도: agarose의 농도가 높을수록 겔 속 구멍이 적어서 DNA가 천천히 이동한다.3) DNA의 구조: 꼬인 상태로 가장 응집된 초나선(supercoiled) DNA가 가장 빠르고, 선형(linear) DNA가 다음으로 빠르며, 부피가 가장 큰 원형(open circular) DNA가 가장 느리다.4) 전압의 크기: 전압이 클수록 전기 영동에서 DNA의 이동속도가 빠르다.5) Buffer의 이온용량: 이온용량이 클수록 전기를 연결했을 때 극성을 띠는 물질이 효과적으로 이동할 수 있다.EtBr은 DNA를 염색하는 역할을 하는데, EtBr의 평면 구조가 DNA 염기 사이로 끼어드는 성질을 가지고 있다. 결합하였을 때 형광성이 크게 증가하여 UV 조사로 254nm의 자외선을 받으면 590nm의 빛을 반사하여 DNA의 위치를 알 수 있다. DNA가 길고 농도가 진할수록 EtBr이 많이 끼어들어가 더 밝게 빛이 난다.

자연과학| 2021.06.08| 2페이지| 3,500원| 조회(290)

화학, 결과레포트, 생화학및분자생물학실험

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