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WST-1 assay / Trypan blue exclusion assay

2020학년도 2학기 WST-1 assay / Trypan blue exclusion assay-2020. 10. 26. 실험-1. 개요Cell viability assay란 세포 생존율을 측정하기 위해 진행하는 실험을 의미한다. Cell viability assay에는 많은 방식이 있는데, 그중 실험에 사용한 방식은 WST-1 assay와 Trypan blue exclusion assay이다.WST-1 assay는 생존 세포의 미토콘드리아에 존재하는 succinate tetrazolium reductase가 WST-1(Water Soluble Tetrazolium salt)를 환원시킬 때 생성되는 formazan이라는 오렌지색 발색 물질의 양을 통해 세포의 생존율을 측정하는 방식이다. 생존 세포가 많을수록 succinate tetrazolium reductase의 활성이 증가하기 때문에 formazan의 오렌지색이 더욱 진하게 발색된다. 이를 spectrophotometer을 이용하여 흡광도를 측정하여 생존 세포 수를 알 수 있다.이와 같은 방식의 세포 생존율 측정법에는 MTT와 XTT, MTS가 있다. 그러나 대부분의 실험에서 WST-1 방식을 선호하는데, 그 이유는 WST-1 방식이 가장 간단하고 활용도가 높기 때문이다. MTT의 경우 반응 후, wash 과정과 crystal formazan 결정을 녹이는 과정 등 복잡한 과정을 거쳐야 하고, XTT와 MTS는 WST-1에 비해 용해성이 낮다. 또한, WST-1의 경우 생존율 측정만 가능한 MTT와 달리, DNA나 RNA를 추출하거나 western blot 등의 다른 실험이 가능하다.Trypan blue는 cell culture에서 세포 수를 확인하기 위해 사용되는 일반적인 시약이다. 생존 세포의 경우 세포막이 정상적인 기능을 하기 때문에 trypan blue가 통과할 수 없다. 따라서 현미경 상에서 동그랗고 하얗게 빛나는 모양으로 관찰된다. 하지만 죽은 세포의 경우는 세포막이 망가졌기 때문에 trypan blue가 통과한다. 따라서 현미경으로 이를 관찰하면 파란색으로 염색된 세포가 관찰되며 터지거나 찌그러진 모양의 세포가 관찰되기도 한다.DMSO(Dimethyl Sulfoxide)는 세포 동결 보호제로 사용되거나, 물에서 녹지 않는 화학물질들을 녹이는 데 사용된다. 세포 동결 시, DMSO를 세포와 함께 얼리면 동결 과정에서 DMSO가 세포막을 통과하여 세포가 결정화되어 죽는 것을 막는다. 또한, 물의 어는점을 낮추기 때문에 세포가 서서히 얼도록 돕는다. 그러나 DMSO의 경우 독성(toxicity)이 있어서 일반적으로 10% 이하의 농도로 사용해야 하며, 세포마다 DMSO에 대한 생존율(viability)이 다르기 때문에 물질을 녹일 때 이용한다면 DMSO에 대한 세포의 생존율을 미리 찾아두어야 한다.실험에는 SH-SY5Y cell(Human neuroblastoma cell)이 사용되었다.2. 실험목적각각 WTS-1 assay와 Trypan blue exclusion assay를 이용하여 DMSO 농도별(0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%) 세포 생존율(cell viability) 확인한다.3. 실험재료 및 방법-실험재료1. 96well cell culture plate2. EZ-Cytox (WST-1)3. Spectrophotometer4. Micropipette 10㎕5. 10㎕ pipette tipCO_26. Incubator7. Serum free media8. DMSO1. 60Φ dish2. Serum free media3. Micropipette 1000㎕, 10㎕4. 1000㎕, 10㎕ pipette tipCO_25. Incubator6. DMSO7. PBS8. Trypsin EDTA9. Hematocytomer10. Trypan blue11. 15㎖ tube-실험방법1. Cell을 96well plate에 well당 25,000개 seeding(100㎕)하여CO_2 Incubator에서 24시간 배양2. 24시간 이후 96well을 serum free media로 1회 wash3. serum free media를 media마다 100㎕ 분주4. 준비된 DMSO를 농도별(0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%)로 처리5. EZ-Cytox 10㎕을 각 well에 첨가6. 30~60분 동안CO_2 Incubator에서 반응7. 30~60분 후 spectrophotometer 450㎚로 측정1. Cell culture를 하여 약 13,500개의 cell을 60Φ dish에 seeding2. 다음 날 DMSO를 농도별(0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%)로 처리3. Cell dish를 기울여 media를 15㎖ tube에 collect4. PBS 1㎖로 1회 wash, PBS도 15㎖ tube에 collect5. Trypsin-EDTA를 dish 당 500㎕ 넣고 activation(1분)6. Cell dish를 가볍게 tapping하여 cell을 띄운 후 dish를 기울여 cell을 수거하고 15㎖ tube에 넣음7. Tube에 cell solution 10㎕와 trypan blue 10㎕을 1:1로 섞고 1~2분 동안 반응8. 10~20번 pipetting 후 10㎕을 따서 hematocytometer에 loading9. 현미경을 보며 live cell, death cell의 개수를 셈10. 공식을 이용하여 cell 수를 계산-실험 시 주의사항1) DMSO 농도에 따른 결과를 비교하는 실험이므로 농도가 변하거나 실험결과 값이 혼동되지 않도록 주의해야 함.2) DMSO 농도를 제외한 다른 변인이 달라지지 않도록 주의해야 함. 특히 pipette을 이용하며 pipette tip을 반드시 갈아 주어 용액이 섞이지 않도록 주의해야 함.3) 정확한 관찰을 위해 hematocytometer에 loading 할 때 먼지와 같은 이물질이 섞이지 않도록 주의해야 함.4. 실험결과TreatBlankDMSO0%1%2%3%4%5%No1234567A-0.050717-0.055917-0.0067170.002883-0.009017-0.052717-0.053817B-0.0036171.2326831.1558830.9677831.028483-0.054417-0.049417C0.0034831.2995831.1960830.9969830.931283-0.025717-0.025417D0.0110830.9889831.0274830.970883-0.020617-0.045417-0.047117E0.0055831.0112831.1347830.753983-0.042217-0.037817-0.042217F-0.0220171.0895830.9778830.852483-0.047117-0.046917-0.048317G0.0054831.0221831.0615830.833283-0.044117-0.042617-0.045717H-0.054017-0.045417-0.054317-0.046517-0.046217-0.046117-0.046917average0.001.1073831.0922830.8959000.300950-0.042150-0.0430370.001.000.990.810.27-0.04-0.040%1%2%3%4%5%live cell38343517199death cell21821296447total cell594256468356cell count29.521.028.023.041.528cell viability (%)64.41%80.95%62.50%36.96%22.89%16.07%related cell viability1.001.260.970.570.360.255. 고찰WST-1 assay 실험은 이상적인 결과를 얻지 못하였다. 4%와 5%의 blank 평균이 마이너스 값이 나왔는데, 이는 불가능한 값이다. DMSO에 의해 많은 수의 세포가 죽었다 하더라도 그 평균이 음의 값이 나올 수는 없다. WST-1 assay 실험이 제대로 진행되지 않은 여러 요인에 대해 고려해보았는데, EZ-Cytox(WST-1)의 반응을 위해CO_2 Incubator에 96well plate를 넣는 과정에서 충격이 가해졌기 때문이라는 가정이 가장 유력하다. 충격으로 인해 plate에 붙어있던 살아있는 세포가 떨어지게 되었을 가능성도 있으며, 이 과정에서 세포가 파괴되었을 수도 있다. 따라서 조작 변인 외의 외부 요인으로 인한 세포 파괴로 실험결과에 영향을 미쳤다고 생각한다.Trypan blue assay 실험 역시 이론과는 다른 결과를 얻었다. 0% 농도의 cell viability보다 1% 농도의 cell viability가 더 높은 점, 0% 농도의 cell viability가 비정상적으로 낮은 점 등이 이상적인 실험결과 값과 다르다. 또한, 전반적으로 수집된 cell의 수가 적다. 이러한 결과가 나온 이유로는 cell dish에서 cell을 떼어내는 과정이 꼼꼼하지 못하였기 때문이라고 생각한다. Cell dish에서 PBS, Trypsin-EDTA를 이용하여 배양된 cell을 떼어내는 과정에서 cell의 분리를 꼼꼼히 확인하지 않고 실험을 진행하였다. 이 때문에 살아있는 cell이 cell dish에 많이 남아있게 되어서, 전반적으로 cell의 수가 적게 수집되고, cell viability를 측정하는 데 영향을 미치게 되었다고 생각한다.

자연과학| 2021.06.18| 6페이지| 2,500원| 조회(1,332)

Trypan blue, WST-1, WST-1 assay

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양서류, 조류 배아 관찰

2020학년도 2학기 Frog / Chick embryo slides 관찰양서류 배아 초기 발생과정 관찰-2020. 11. 02. 실험-Ⅰ. Frog / Chick embryo slides 관찰1. 개요척추동물의 기관과 조직은 발생 초기, 낭배형성(gastrulation) 과정에 형성되는 초기 삼배엽-외배엽(ectoderm), 중배엽(mesoderm), 내배엽(endoderm)-에서 유래된다. 외배엽은 주로 표피, 중추신경계, 신경제세포(neural vrest cell)로 분화하고, 내배엽은 주로 소화관 상피세포와 소화관 부속선(췌장, 담낭), 간, 폐, 기관지로 분화한다. 중배엽은 골격계, 근육계, 내부 비뇨생식기계 및 순환계로 분화한다.-C.S.(Cross Section) : 횡단면, 단면도-W.M.(Whole Mount) : 온조직표본고정-Sag.s.(Sagittal section) : 시상 절단, 시상 단면2. 실험목적양서류와 조류 배아의 초기 발생과정을 관찰 및 이해한다.3. 실험준비1) 실험재료1. 광학현미경2. Frog embryo slidesDevelopmental stages : crescent blastopore(mid-gastrula), yolk plug(late gastrula), neural plate (early neurula), neural fold (mid neurula), neural tube (late neurula)3. Chick embryo microslidesDevelopmental stages :12-16 hour : whole mount18 hour, 24 hour : whole mount, cross section33 hour, 56 hour, 72 hour, 96 hour : whole mount, cross section, sagittal section2) 실험 시 주의사항slide가 파손 또는 분실되지 않도록 보관하여야 하며, 실험 이후 순서대로 정리함.4. 실험과정 및 결과프린트의 구조들이 보이는 slide를 rm), 내배엽(endoderm), 원구(blastopore)Mid-GastrulaLate-Gastrula외배엽(ectoderm) : 외배엽에서 중추신경계(뇌와 척수)로 분화하는 신경관과 신경제(神經提) 등이 분리해서 태아피하에 매몰함. 남은 외배엽은 그대로 태아의 외표면을 뒤덮고 표피 및 그 부속기관의 상피, 구강이나 비강의 점막상피, 하수체전엽세포 등으로 분화.중배엽(mesoderm) : 외배엽과 내배엽의 중간에 나타나는 배엽. 많은 동물에서 체강벽을 형성하여 배엽 사이 틈을 메움. 성체의 기관계나 조직 중, 주요부분이 중배엽에서 유래하는 것은 동물군에 따라 차이가 있으며 근육계, 결합조직, 골격계, 순환계, 배출계, 생식계 등이 있음.내배엽(endoderm) : 초기 배아의 가장 안쪽 배엽. 할구가 배 안쪽으로 함입됨으로써 얇은 판의 형태로 형성됨. 내배엽은 이후 기관계의 상피층을 형성하고 소화관, 호흡관, 췌장, 간 등의 안쪽 벽으로 분화.원구(blastopore) : 포배기에 함입이 일어나, 장차의 중배엽 및 내배엽의 세포군이 배의 내부로, 배 표면에서 배의 내부로 배접(褙接)되는 것처럼 함입될 때 생기는 원형 또는 곡선상(또는 말굽형)의 합입구.-관찰할 구조) Neurula(신경배) : 신경판(neural plate), 신경주름(neural fold), 신경관(neural tube), 척삭(notochord)Early NeurulaMid-NeurulaLate Neurula신경판(neural plate) : 주로 척삭동물의 발생 초기 원장 형성 종료 후에 외배엽 배측정중에 생기는 후방에서 폭 좁게 비후된 부위. 후에 그 주요부가 중추신경계와 안원기를 형성gka. 신경판의 미단은 대부분 폐쇄된 원구에 접함.신경주름(neural fold) : 신경판 주위의 외배엽이 융기하여 형성됨. 초기 신경주름영역은 주로 신경관을 형성함.신경관(neural tube) : 양측 신경주름이 배방정중에서 합쳐져 형성됨. 중추신경계 및 척추동물에서는 눈 일부를 형성. 전방은 하게 신장하고 동시에 모든 조직 중에서 가장 빠른 시기에 조직분화를 일으킴.프린트의 그림 (A), (B), (C), (D)에 표시된 구조들이 보이는 slide를 찾아서 각 구조를 표시한다.각 구조들이 어느 시기에 관찰되는지를 기록한다.(A) 33 hour (c.s.)1) Primitive streak (원조) : 원조가 나타나면 외배엽의 세포는 원조를 향해 이동하고 원조에서 홈으로 향해 빠져들어 외배엽과 내배엽 사이를 이동하여 중배엽이 됨.2) Epiblast : 낭배의 외피, 외배엽이 됨.3) Migrating mesodermal cell : 이동 중인 중배엽 세포(B) 33 hour (sag,s,)1) Neural plate (신경판) : 중추신경계와 안원기를 형성.2) Lateral mesoderm : 중배엽 측면3) Paraxial mesoderm (축주위중배엽) : 척추동물의 배에서 배면 정중선상에 있는 체축을 따라 양측에 배방에서 복방으로 향하여 발달한 중배엽.4) Epidermis : 표피(C) 56 hour (c.s.)1) Neural tube (신경관) : 중추신경계 및 척추동물에서는 눈 일부를 형성. 전방은 뇌로, 후방은 척수로 분화.2) Somite (원체절) : 척추동물의 배발생에서, 특히 중배엽에 현저하게 나타나는 분절구조.3) Intermediate mesoderm : 중간 중배엽4) Somatic mesoderm : 벽쪽중배엽5) Coelom (체강) : 동물의 체벽과 여러 내장 사이의 빈 곳.6) Splanchnic mesoderm : 내장쪽중배엽(D) 72 hour (c,s,)1) Notochord (척삭) : 중추신경계의 유도를 일으킴.2) Dorsal aorta : 등대동맥3) Intraembryonic coelom (배아속체강) : 측판내강의 신절에 가까운 부위. 그 연장은 배체외역의 배체외체강으로 이어짐. 성체에서는 대부분 복막강이 됨.4) Extraembryonic coelom (배아외체강)5) Dermatome of site : 원체절 추판5. 고찰Frog embryo slides와 Chick embryo slides를 관찰하며 동물 배아의 초기 발생과정을 관찰하는 것은 매우 흥미로웠다. 특히 Chick embryo slides를 관찰하며 내가 상상하던 척추동물의 발생과정보다 훨씬 복잡하다고 느꼈고, embryo의 모양도 상상하던 것과 매우 다르다고 생각했다. Embryo를 관찰하며 가장 신기했던 부분은 배아 내부에 빈 곳을 만들며 중배엽과 내배엽이 외배엽 안쪽으로 들어가는 과정이었다. Slides를 관찰하기 전, 글자로 적힌 것만을 보고 떠올렸을 때는 외배엽 안쪽으로 중배엽과 내배엽이 이동하는 모습을 전혀 상상할 수 없었기 때문이었다.다만 실험을 진행하며 아쉬웠던 점은, Chick embryo slides의 시간 단계가 적게 느껴졌다. 관찰한 slides에서는 chick embryo의 primitive streak나 neural plate가 형성되는 시기가 33 hour 즈음이지만, 실제로 primitive streak나 neural plate는 이보다 조금 더 앞서 형성된다. 이와 같은 결과가 나온 이유는 준비된 chick embryo slides의 시간 단계가 적기 때문이라고 생각한다. 만약 사이사이의 더 많은 시간대에 따른 chick embryo slides가 있었다면, 더욱 정확한 추론이 가능했을 것으로 생각한다.Ⅱ. 양서류 배아 초기 발생과정 관찰1. 개요1. 수정(fertilization) : 난자(egg)와 정자(sperm)가 결합하여 2배체(diploid zygote)를 이룸.-이때, 정자는 난자의 동물극(animal pole)에서 수정하고, 정자가 들어간 쪽이 배(ventral), 반대쪽이 등(dorsal)이 됨.-동물극(animal pole) : 난자 위쪽의 짙은 부분-식물극(vegetal pole) : 난자 아래쪽의 흰 부분2. 포배(blastula) : 난할(cleavage)을 12번 거친 이후 단계.-동물 반구가 식물 반구보다 빠르게 분열함.-난할( 크기는 크게 변화하지 않음.-동물극에 함입이 발생하며 포배강(blastocoel)이 형성됨.-포배 이후에는 난할이 아닌 체세포분열이 진행됨.3. 낭배(Gastrula) : 원구(blastopore) 형성.-삼배엽(3 germ lagers) 형성.-중배엽, 내배엽이 외배엽의 안쪽으로 들어감.4. 신경배(neurula) : 신경판(neural plate)이 형성되어 신경관(neural tube)을 형성함.5. Tailbud(꼬리싹) stage6. 올챙이(tadpole)Paraformaldehyde fixing 원리 : Paraformaldehyde와 단백질과의 반응이 진행되며 조직구조가 고정됨.2. 실험목적양서류 배아 초기 발생과정을 관찰 및 이해한다.3. 실험준비1) 실험재료1. 광학현미경2. Xenopus laevis embryo3. 12 well plate4. 6 well plate5. 핀셋2) 실험 시 주의사항관찰하는 동안 Embryo가 손상되지 않게 주의해야 함.4. 실험과정 및 결과1. 12 well plate의 embryo를 관찰하여 각 stage의 특징을 관찰.2. 6 well plate의 embryo를 관찰하여 12 well plate의 embryo의 특징과 비교, 각 well의 stage와 특징을 추측.Stage : 15-16NeurulaStage : 9BlastulaStage : 26-27TailbudStage : 42TadpoleStage : 2CleavageStage : 10-12Gastrula5. 고찰이전 실험에서 진행했던 slides 관찰보다 직접 embryo를 관찰함으로써 올챙이 발생과정의 더 구체적인 구조에 관해 이해할 수 있게 되었다. 특히 배아의 여러 면을 관찰하며 할구의 개수를 직접 세어보는 등 분할과정을 제대로 관찰할 수 있었던 점이 좋았다. 분할과정을 그림이나 단면으로만 본다면, 마냥 이해하기 어려운 부분이 있는데, 이를 embryo를 직접 관찰함으로써 쉽게 이해할 수 있었다. 그리고 개구리(올챙이)가 후구동물임은 알고 있

자연과학| 2021.06.18| 6페이지| 2,500원| 조회(274)

배아, 양서류, 배아 초기

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Mega X를 활용한 계통수 분석

MEGA X 프로그램을 이용한계통수(phylogeny tree) 분석 실험보고서-2020. 10. 05. 실험-1. 개요계통은 생물의 진화 역사를 의미한다. 계통을 알기 위해서는 생물 종 사이의 진화적 유연관계를 밝혀야 하는데, 이때 진화적 유연관계를 파악하는 데 다양한 방법이 존재한다. 과거에는 생물 종 간의 외적·기능적 공통점과 차이점을 분석하여 유연관계를 파악하기도 했고, 화석과 같은 자료를 통해 파악하기도 했다. 최근에는 분자생물학 기술을 이용하여 생물의 유전 정보를 통해 유연관계를 파악하는 방식이 주로 이용된다. 이렇게 파악한 종 간의 유연관계를 통해 계통을 추측하는데, 이때 계통을 나타내는 방법으로 계통수(phylogeny tree)가 사용된다. 계통수는 ‘동물이나 식물의 진화과정을 수목의 줄기와 가지의 관계로 표시한 것’으로 그림으로 표현함으로써 생물의 유연관계와 진화 경로를 쉽게 파악할 수 있다는 장점이 있다. 계통수는 독일의 생물학자 에른스트 헤켈(Ermst Haeckel)에 의해 처음 사용되었으며, 진화론을 주장한 찰스 다윈(Charles Robert Darwin) 역시 생물의 진화 관계를 파악하며 계통수를 작성하기도 했다.계통수는 하나의 공통조상(ancestral lineage)으로부터 시작된다. 공통조상으로부터 뻗어 나온 가지는 진화를 거듭하여 새로운 분류군(taxon, taxa)에 도달한다. 이때 가지가 나뉘는 포인트를 마디(branch point)라고 한다. 물론 마디가 항상 이분법적으로 나뉘는 것은 아니다. 때로 하나의 마디에서 세 개 이상의 가지가 분류되기도 하는데 이를 다분기(polytomy)라고 한다. 계통수에서 공통조상으로부터 갈라져 나왔으며 다른 가지로 갈라지지 않고 이어진 분류군은 기저 분류군(basal taxon)이라고 하며, 최종적으로 같은 가지에서 갈라져 나온 분류군 사이를 자매분류군(sister taxa)이라고 말한다.계통수에서 공통조상으로부터 진화한 분류군을 묶어 분기군(clade)이라고 부른다. 분기군은 3개로 구분할 수 있다. 첫 번째로 단계통 그룹(monophyletic group)이다. 단계통 그룹은 같은 조상 종으로부터 파생된 모든 후손 종의 집합을 의미한다. 예를 들어 공통조상에서부터 뻗어져 나온 가지 중, A라는 중간 조상에서a _{1} ,``a _{2} ,``a _{3}의 후손이 파생되었고 이들을 모두 하나의 분기군으로 분류한다면, 이들은 단계통 그룹이 된다. 다음은 측계통 그룹(paraphyletic group)이 있다. 측계통 그룹은 같은 조상 종에서 진화한 후손 종의 일부만 포함된 집합을 의미한다. 예를 들어 앞선a _{1} ,``a _{2} ,``a _{3} 중a _{3}를 제외한a _{1} ,``a _{2}만을 한 그룹으로 분류하면, 이 그룹은 측계통 그룹이 된다. 마지막으로 다계통 그룹(polyphyletic group)이 있다. 다계통 그룹은 여러 조상 종으로부터 파생된 후손 종들이 포함된 집합이다. 앞선 A 분류군 이외에 B 분류군이 있다고 가정하였을 때, B 분류군의 후손으로b_{1} ,``b_{2} ,``b _{3}가 있다고 하자. 이때a _{1} ,``a _{2} ,``a _{3}과b _{1}를 하나의 분기군으로 분류하여a _{1} ,``a _{2} ,``a _{3} ,``b _{1}이 포함된 그룹이 만들어진다면, 이 그룹은 다계통 그룹이 된다. 측계통 그룹과 다계통 그룹은 분류군의 형태 정보가 충분하지 않을 때 발생하기도 한다.계통수를 분석하여 분류군 사이의 진화적 유연관계를 파악할 때, 외군(outgroup)을 설정하기도 한다. 외군은 분석하고자 하는 분류군들 외에 설정된 분류군이다. 외군과 반대되는 개념으로 내군(ingroup)이 있으며, 내군은 계통수에서 분석하고자 하는 대상이 되는 분류군을 뜻한다.DNA 분자 정보를 이용하여 계통을 분류하는 경우, 가능한 계통수가 여러 개 만들어지기도 하는데, 이때 가장 가능성이 큰 계통수를 결정하고자 최대 단순법(maximum parsimony)가 이용된다. 최대 단순법은 DNA 분자 변화를 추적하여 만들어진 여러 개의 계통수 중에서 염기서열이 변화하는 사건의 수가 가장 적은, 가장 간단한 진화 형태의 계통수를 선택하는 방식이다. 예를 들어 A, B, C라는 3개의 생물 종의 DNA 염기서열의 변화를 비교하여 계통수를 작성하였다고 하자. 다분기의 경우를 고려하지 않았을 때 만들어질 수 있는 계통수는 총 3개이다. 각각 A가 기저 분류군인 경우를 1번 계통수, B가 기저 분류군인 경우를 2번 계통수, C가 기저 분류군인 경우를 3번 계통수라고 하자. 이때, 1번 계통수에서 발생하는 최소한의 DNA 염기서열 변화는 6번, 2번 계통수는 7번, 3번 계통수는 7번이다. 그렇다면 최대 단순법의 원리에 따라 DNA 염기서열이 변화하는 사건의 수가 가장 적은 1번 계통수가 가장 적합한 계통수로 선택된다.MEGA X 프로그램은 분류군의 DNA 염기서열(sequence) 및 단백질 서열 데이터 분석하여 계통수를 작성하는 프로그램이다. 프로그램 사용 방법은 다음과 같다. 분석하고자 하는 샘플의 DNA 염기서열을 5‘-3’ 방향으로 정리하여 통일되게 묶어준 후 이를 fasta 파일 형식으로 저장한다. 이후 MEGA X 프로그램에서 Alignment하여 작성한 fasta 파일을 열고, 옵션을 설정한 후 align을 한다. 이후 시퀀스 사이의 gap을 정리한 뒤 결과를 저장, phylogeny를 한다. 이후 외군 설정 및 계통수의 작성 방식을 추가 설정한다.Bootstrap은 가설을 검증하거나 결론을 도출하기 전에 random sampling을 적용하는 통계방식이다. (random sampling은 중복을 허용) A, B, C, D, E라는 다섯 종류의 생물 종의 진화적 유연관계를 비교하고자 할 때, 만약 조상 종을 모른다면 확실한 모양의 계통수를 작성할 수 없다. 조상 종을 모르는 상태이기 때문에 뿌리를 설정할 수 없고, 상대적인 진화 관계만 추정할 수 있다. 따라서 그려지는 계통수의 모양은 펼쳐진 모양(inferred tree)이 된다. 이때, 이 계통수에 표시된 상대적 진화 관계의 신뢰성을 높이기 위해 bootstrap 방법이 사용된다. 다섯 종의 DNA 샘플을 바탕으로 기본이 되는 샘플을 설정하고, 각 자리를 하나의 제비로 설정하여 무작위로 뽑는다. 이렇게 만들어진 여러 개의 가짜 샘플(pseudosample)을 바탕으로 bootstrap trees를 그린다. n개의 가짜 샘플을 이용하면 n개의 계통수가 그려진다. 앞서 추정한 펼쳐진 계통수에서 각각 A와 B, C와 D의 진화적 유연관계가 가까웠다면, n개의 계통수에서 A와 B, C와 D가 짝지어진 횟수를 구하고, 이를 확률로 계산한다. 이렇게 도출된 확률은 펼쳐진 계통수의 신뢰도와 관계되며, Bootstrap 시행 횟수가 많을수록 정확도가 높아진다.2. 실험목적MEGA X 프로그램을 이용하여 주어진 분석 자료의 계통수를 작성 후 분석한다.3. 실험재료 및 방법-실험재료MEGA X 프로그램, 분석할 샘플들의 sequence-실험방법(1) MEGA X 프로그램 실행 후 분석할 샘플들의 sequence(보고서용 분석 자료)를 불러온다.(2) Phylogeny tree를 그리기 위해 옵션을 설정한 후 실행한다.(3) Phylogeny tree에서 Human을 선택하여 외군(outgroup)으로 설정한다.(4) 외군과 비교하여 종 사이의 유전 관계를 파악한다.

자연과학| 2021.06.18| 5페이지| 2,500원| 조회(871)

실험보고서, 계통수 분석, MegaX

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