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[일반생물학실험2] 4. Meiosis (현미경 관찰)

예비 reportTitleMeiosis (현미경 관찰)Purpose감수분열 중인 세포의 현미경 표본을 제작하여 감수분열 과정을 현미경으로 관찰한다.Introduction감수분열 (Meiosis): 유성 생식을 하는 생물의 생식세포 형성과정에서 일어나는 세포분열로, 대부분의 다세포 생물들은 이를 통해 정자와 난자라는 생식세포(배우자)를 만들고 이들이 융합하여 접합체를 형성하여 새로운 개체를 탄생시킨다.감수분열 과정(단계)감수분열이 일어나는 과정은 체세포 분열과 동일, 중간에 간기가 없는 연속 2회의 분열이 일어남으로써 염색체 수(n)가 일반 체세포의 절반으로 줄어들게 된다.제1분열-상동염색체 분리, 염색체 수 반감1. 간기 – DNA 복제 (2배)2. 전기 – 염색체 형성, 이가 염색체 형성, 방추사 나타남3. 중기 – 핵막 소멸, 방추사 동원체에 부착, 적도 배열4. 후기 – 상동염색체 분리5. 말기 – 핵막 나타남, 세포질 분열제2분열-샹동1. 전기 – 아주 짧게2. 중기 – 핵막 소멸, 방추사 동원체에 부착, 적도 배열3. 후기 – 염색 분체 분리4. 말기 – 핵막 나타남, 염색사로 풀어짐, 세포질 분열Reference-Enger ED, Ross FC, Bailey DB, 2013. Concepts in Biology, 14th ed, McGraw-Hill Publishing Co.-동물학백과, 한국통합생물학회결과 reportTitleMeiosis (현미경 관찰)Materials / Method감수분열 프레파라트 (동물/식물)광학현미경프레파라트를 현미경의 재물대 위에 올려놓은 뒤, 렌즈에 프레파라트가 닿지 않게 조심하면서 조동나사를 이용하여 재물대를 위로 올린다.접안렌즈에 눈을 대고 재물대를 천천히 아래로 내리며 상을 찾는다.상이 보이기 시작하면 미동나사를 이용해 상의 초점을 맞춘다.관찰하고자 하는 상을 찾으면 고배율 렌즈로 교체하여 상을 관찰한다.Results현미경으로 관찰한 세포의 감수분열Discussion첫번째 사진은 세포질이 반씩 나뉘어져 있는 것으로 보아 감수 제 1 분열을 마치고 감수 제 2 분열로 넘어가는 그 중간 과정에 있는 것으로 판단된다. 두 번째 사진에서는 염색체들이 세포의 적도면에 배열되어 있는 것으로 보아 중기의 모습임을 알 수 있다. 세 번째 사진에서는 염색체가 뚜렷하게 관찰되지 않고 핵으로 추정되는 둥그런 막에 둘러싸여 있는 것을 관찰할 수 있다. 이는 전기에 염색사가 염색체로 바뀌며 아직 핵막이 소멸되지 않는 전기의 모습이다. 마지막으로 네 번째 사진은 염색체의 모습을 쉽게 관찰할 수 있으며 상당 부분의 세포들은 적도면에 염색체가 배열되어 있는 것을 관찰할 수 있으므로, 중기와 후기의 모습이라고 할 수 있다.Reference-Enger ED, Ross FC, Bailey DB, 2013. Concepts in Biology, 14th ed, McGraw-Hill Publishing Co.-동물학백과, 한국통합생물학회

자연과학| 2021.08.25| 3페이지| 1,000원| 조회(370)

관찰, 현미경, 실험, 생물, 세포분열, 감수분열, 일반생물학실험, meiosis

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[일반생물학실험2] 3. Observation of colony (미생물 도말)

예비 reportTitleObservation of Colony (미생물 도말)Purpose미생물을 여러 방법으로 도말해 미생물을 관찰해본다.Introduction-colony: 한 종의 미생물이 모여서 눈에 보이는 크기로 자란 덩어리-도말: 배지 위에 균액을 스며들게 접종하여 배양시키는 방법으로 single colony를 얻는 데 사용한다.도말 방법Streaking: 미생물에게 필요한 영양분이 포함된 액체에서 배양하는 방법미생물이 빠르게 생장 – 빠른 시간안에 대량 생산 가능배지를 섞어주는 과정을 통해 영양분 및 산소가 고르게 퍼져 생장 속도가 빠름Spreading: 그 액체배지에 한천을 더하고 멸균한 후에 고체로 변하기 전에 페트리 접시에 부어 평평한 상태의 고체배지에서 배양하는 방법미생물이 같은 위치에서 계속 세포분열을 함 – 개체군의 크기 증가, colony 형성 (육안으로 확인 가능)Streaking에 비해 비교적 느린 생장Reference-한국미생물학회, 미생물학백과결과 reportTitleObservation of Colony (미생물 도말)Materials / Method알코올램프LB plateLoopBacteria준비한 bacteria 샘플에 loop를 살짝 담그고 loop에 bacteria에 묻게 한다알코올 램프를 키고 LB plate의 뚜껑을 연다LB plate에 3획으로 streaking을 실시한다.Results배양 후 plate의 사진들Discussion이 LB plate 대부분이 첫번째 획이 가장 진하고, 그 다음 두번째, 세번째 획으로 갈수록 점점 선이 연해지는 것을 관찰할 수 있다.이 실험은 bacteria를 loop에 묻혀 bacteria에게 필요한 영양분이 포함된 plate에 streaking 도말을 진행한 것이다.결과적으로 획의 방향을 바꿀수록 점점 더 연해지는 박테리아를 육안으로 확인할 수 있었다.Reference-한국미생물학회, 미생물학백과

자연과학| 2021.08.25| 3페이지| 1,000원| 조회(271)

관찰, 미생물, 실험, 생물, 도말, colony, 일반생물학실험

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[일반생물학실험2] 3. DNA ligation & Transformation in E.coli Top10F

예비 reportTitleDNA ligation & Transformation in E.coli Top10FPurposeDNA ligation과 이에 사용된는 E.coli 의 transformation에 대해 알아보고 실험을 통해 이를 관찰한다.IntroductionDNA ligation: single strand의 DNAdml 5’ phosphate와 다른 DNA의 3’OH를 ligase효소가 ATP를 에너지로 하여 phosphodiester bond로 연결시키는 반응이며, 이로 인해 두 DNA fragment를 연결시킨다.이 때, ligase는 에너지를 이용해 두 DNA 분자를 결합시키므로 합성효소라고도 한다.Ligase의 종류Bacteriophage T4 DNA ligaseE. coli DNA ligase두 효소 다 나란히 나열된 5’phosphate 와 3’hydroxyl termini 사이에 phosphodiester bond를 형성하고, 두 ligase는 blunt-ended DNA, cohesive-ended DNA, nicked DNA 등에 모두 작용할 수 있지만, E.coli DNA ligase는 blunt-ended DNA 에 작용하는 힘이 비교적 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA ligase를 더 많이 사용하는 경향이 있다.ReferenceMartha R. Taylor, 2018, Campbell Biology: Concepts & Connections, Pearson Education, 9th editionRobert F. Weaver, 2013, 분자생물학, 라이프사이언스, 5판결과 reportTitleDNA ligation & Transformation in E.coli Top10FMaterials / MethodDNA ligation-Materials: insert DNA(cut), Vector DNA(cut), DNA ligase, DNA ligase buffer(10X), Ice, EP tube, Pipette, tip-Methods1. EP tube에 많이 들어가는 순서대로 아래 조성과 같이 각 sample을 담는다.Insert DNA7 μlVector DNA1 μlDNA ligase buffer(10X)1 μlDNA ligase1 μlTotal10 μl2. RT에서 10분 기다린다.(이후 다음 실험 바로 진행하지 않으면 65℃ 10min)TransformationCompetent(CP) cell 준비-Materials: Bacteria, 50mM , ice, EP tube, Pipette, Tip-Methods1. Bacteria를 400 μl broth에 접종하여 Fresh culture 37℃, 1.5hr 진행한다.2. Ice에 10 min 방치 후 centrifugation 1000g, 4℃, 5min 진행한다.3. Sup 버리고 50mM ,, 200 μl add (Fresh cultured volume의 1/2)4. 아주 천천히 Pipetting하여 cell을 잘 풀어준다.5. Ice에 5 min 방치 후 Centrifugation 1000g, 4℃, 5min 진행한다.6. Sup 버리고 50mM ,, 40 μl로 pipetting하여 잘 풀어준다.7. 완성된 CP cell은 항상 ice에 보관 혹은 4℃ 에서 보관한다.Transformation-Materials: CP cell, ligated DNA, LB broth, Ice, EP tube, pipette, tip, heating blocker(or Water bath)-Methods1. CP cell 50 μl + Ligated DNA 10 μl 섞어주고 Ice 10min 기다린다.2. 42℃ heat shock 1min 30s진행3. Ice에 5min 방치한다.4. LB broth 800 μl 넣고 37℃, 1hr incubation 진행한다.5. Centrifugation 1min 정도 진행한 뒤 적당히 LB 제거한다.6. 멸균대에서 spreading 진행한다.7. 37℃ incubation 하고 다음날 자란 colony를 확인한다.Resultscolony를 확인한 결과, 2>5>3>4>6>1 순으로 가장 많이 colony가 형성되었다.Discussion정상적으로 실험을 진행했을 때에 가장 colony가 잘 형성되었다. 이를 기반으로 가장 반대로 colony가 적게 형성된 샘플 순서대로 가장 영향력이 큰 요인이라는 것을 판단할 수 있다.첫번째로 가장 적게 형성된 샘플은 1조 샘플로, heat shock 과정을 생략했다. Heat shock 과정은 가 처리된 CP cell 이 일시적으로 세포막의 불균형을 유도해 외부로부터 ligated DNA가 cell안으로 들어갈 수 있도록 만드는 과정이다.이러한 과정이 생략되면 ligated DNA 가 cell 안으로 들어가기 어렵기 때문에 이렇게 재조합된 plasmid가 들어있는 cell의 개수가 적게 나타날 수밖에 없다.두번째로 영향을 미치는 요인은 바로 CP cell의 양이다. 이는 당연한 결과이다. 재조합한 plasmid를 균에 넣어 분열시킴으로써 특정 gene을 증폭시키는 원리인데, cell의 개수가 반으로 줄어들면 이는 incubation 후의 양도 정상적인 결과보다 훨씬 적은 수만큼 증폭될 것이 분명하다.그 다음 요인은 4조와 3조의 샘플을 함께 비교할 수 있다. 두 샘플은 LB broth 에서 각각 온도와 시간에 변화를 주었다. 결과적으로, 배양 과정에서는 시간도 중요하지만 온도가 더 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 이 실험에 사용된 bacteria는 20℃보다도 37℃ 부근에서 30분 보다는 1시간 동안 배양하는 것이 가장 적절하다는 것 또한 알 수 있었다.가장 영향을 적게 미치는 요인은 바로 모든 과정을 거치고 spreading후 incubation 시 온도이다. 5조와 4조의 샘플은 같은 박테리아를 배양하고, 똑같이 온도를 변화시켰는데 colony의 개수에 이렇게 차이가 발생한 이유는 LB broth 때문이라고 생각했다. LB가 존재할 때 분열이 더 촉진되기 때문에 LB broth에서 온도를 낮춘 4조 샘플과 LB를 제거한 후에 온도를 낮춘 5조 샘플 중 4조의 샘플이 더 분열이 적게 일어난 것이다.이렇게 나열한 순서대로 영향력이 크다고 확신할 수는 없다. 온도를 더 낮추거나 시간을 더 많이 바꾸면 그만큼 colony의 수가 줄어들 것이기 때문이다. 확실한 것은 heat shock 은 필수적인 과정이며, 배양 과정에서의 온도는 37℃, 시간은 1hr이 가장 적당하다는 것이다.CP cell을 제작할 때 를 넣는 이유는 cell이 DNA를 받아들일 수 있도록 하기 위한 처리 과정이었다. 본래 DNA는 음전하를 띠고, cell의 membrane도 음전하를 띠어서 DNA와 cell membrane은 척력을 가진다. 이를 해결하기 위해 칼슘 양이온을 처리해 칼슘 이온이 membrane에 존재하는 인지질과 결합해 중화되도록 만드는 것이다. 이를 통해 DNA가 주입되도록 유도한다.primer 제작실제 인슐린의 염기 서열을 이용해 primer를 제작해 보았다. 개시코돈부터 시작해 앞에서부터 18개의 염기와 종결 코돈에서부터 거꾸로 22개의 염기를 잡아 각각의 서열에 대응하는 forward primer와 reverse primer를 제한효소까지 붙여 제작했다.forward primer: CTGCAGTACCGTTGTCGATTCGTCreverse primer: TTATTGCCTCGTTTTTTCTGAAATCGAT각 primer의 파란 염기서열은 pst I 과 Sal I 제한 효소이다.Reference-Martha R. Taylor, 2018, Campbell Biology: Concepts & Connections, Pearson Education, 9th edition-Robert F. Weaver, 2013, 분자생물학, 라이프사이언스, 5판

자연과학| 2021.08.25| 4페이지| 1,500원| 조회(446)

DNA, E.coli, 실험, 생물, Transformation, ligation, 일반생물학실험

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[일반생물학실험2] 2. DNA digestion with restriction enzyme

예비 reportTitleDNA digestion by restriction enzymePurpose제한효소를 이용해서 DNA를 절단하고 Agarose gel을 가지고 전기 영동기를 이용해 관찰한다.Introduction-Restriction enzyme: 이중가닥 DNA 분자의 특정 염기 서열을 인식해서 그 주변을 절단하는 것을 촉매하는 효소세균이 박테리오파지에 의해 공격을 받을 때 생산하는 효소로, 바이러스의 침입으로부터 자신을 방어하는 기능을 함.I, II, III형의 제한 효소가 있다.I형과 III형은 제한 효소와 메틸화 효소가 합쳐져 있어 하나의 효소 복합체로 작용하지만, II형은 메틸화 효소와 별도로 작용한다. 또한, 세 효소 모두 특정 DNA 염기 서열을 특이적으로 인식하지만, I형과 III형은 인식자리와 제한 자리가 다르다. 다시 말해서, 인식했던 염기서열과 관련없이 무작위로 절단한다. 반면, II형은 인식 자리와 제한 자리가 같아 인식했던 염기서열 주변의 염기서열을 절단하는 성질을 가지고 있어 실험에 자주 사용된다.Restriction digestion은 이렇게 특정 DNA염기 서열이 절단되는 반응을 말하며, restriction endonuclease라고도 불린다. 절단 후에는 DNA 가닥이 blunt ends와 sticky ends로 나뉘어진다. 이 반응에 의해 생긴 DNA 파편은 후에 주로 molecular cloning 기술에 사용된다.Reference-Hartl, Daniel L., Jones, Elizabeth W., 2001, Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones & Bartlett Learning, Fifth Edition.-Roberts RJ, 1976, Restriction endonucleases, CRC Critical Reviews in Biochemistry, p123–64.-Pingoud A, Alves J, Geiger R, 1993, Enzymes of Molecular Biology, Totowa, NJ: Humana Press, p. 107–200.결과 reportTitleDNA digestion by restriction enzymeMaterials / MethodDNA template, Restriction enzyme, Restriction enzyme buffer, pipette, pipette tip, 1.5ml tubeTotal volume에 맞는 buffer(10x) volume을 계산한다.1.5ml tube에 아래 조성에 맞춰 각 sample을 담는다.(만약, DNA의 양이 충분하지 않을 경우 DDW를 이용해 total volume을 맞춰준다.)DNA23 μlRestriction enzyme 12 μlRestriction enzyme 22 μlRestriction enzyme buffer (10x)3 μlTotal30 μltapping하여 잘 섞어준 후, 37°C incubator에서 3~4 hr 반응시킨다.ResultsInsert DNA: 1000 bpVector (pCES208): 5930 bpL: Ladder(Size marker)1: insert DNA (No cut)2: Vector (No cut)3: insert DNA (cutting by Pst I, Sal I)4: Vector (cutting by Pst I, Sal I)5: Vector-insert DNA6: lane 5 cutting by Pst I, Sal I7: lane 5 cutting by BamH I, Sal I절단되지 않은 1번 2번 lane을 기준으로 3번과 4번은 띠가 한 개씩 나타났고, 5번을 기준으로 6번과 7번은 띠가 2개 이상씩 나왔다.Discussion먼저, 1번과 2번은 DNA와 vector의 결과로 절단되지 않은 1번과 2번을 기준으로 3번과 4번을 비교하였고, 이를 바탕으로 5번을 기준으로 6번과 7번을 비교해보았다.3번과 4번 은 각각 효소에 의해 절단되었음에도 불구하고 lane에 띠가 한 개씩 밖에 나타나지 않은 이유는 절단된 fragment가 너무나도 작아 agarose gel에서 보여지지 않았기 때문이다. 그렇기 때문에 잘리고 남은 분자가 각각 1번 2번에 있는 띠와 비슷한 위치에서 발견이 된 것이다.반면, vector와 insert를 함께 넣은 lane에서는 더 높은 위치에서 띠가 발견되었고, 이를 각각 다른 효소로 절단했을 때의 결과는 6번과 7번으로, 서로 달랐다. 먼저, 6번 lane에서는 Pst I, Sal I 효소를 사용했고, 7번 lane에서는 BamH I, Sal I 효소를 사용했다. 이 실험에 사용된 pCES208 vector의 맵을 보면 원형의 vector의 한 부분에 효소의 활성자리가 모여있고, 세 활성자리를 고려해보았을 때, Pst I와 Sal I로 절단했을 때보다, BamH I와 Sal I 효소를 사용했을 때, 그 fragment의 길이가 더 길다는 것을 알 수 있다. 6번 lane에서도 기존의 vector와 DNA의 띠보다 더 아래쪽에 위치해있는데, 7번은 6번보다도 더 떨어져 있는 것을 관찰할 수 있다. 이는 분자들의 크기가 커짐에 따라 agarose gel에서의 분자 이동 속도가 느려져 lane에 나타난 띠들의 위치도 아래로 향하는 성질 때문이다.또한, 2번과 4번을 비교해본 결과, DNA와 다르게 이동 속도에 큰 차이가 발생했다는 것을 알 수 있다. 이는 본래 원형이었던 vector가 제한효소에 의해 절단되면서 linear한 형태로 바뀌게 되었기 때문에 발생한 일이다. Linear 형태로 바뀌면서 전기 영동 시 이동 속도에 영향을 준 것으로 판단했다.Reference-Hartl, Daniel L., Jones, Elizabeth W., 2001, Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones & Bartlett Learning, Fifth Edition.-Roberts RJ, 1976, Restriction endonucleases, CRC Critical Reviews in Biochemistry, p123–64.-Pingoud A, Alves J, Geiger R, 1993, Enzymes of Molecular Biology, Totowa, NJ: Humana Press, p. 107–200.

자연과학| 2021.08.25| 4페이지| 1,500원| 조회(325)

제한효소, DNA, 실험, 생물, restriction enzyme, 전기 영동, Agarose gel

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[일반생물학실험2] 1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

TitlePCRPurposePCR을 통해 DNA를 증폭하는 법을 알아본다.IntroductionPolymerase chain reaction (중합효소 연쇄 반응)은 특정 부분의 DNA를 증폭시키는 기법으로, 아주 소량의 샘플로부터 몇 시간 이내로 수십억 개의 복사본을 만들 수 있다.PCR은 사이클 당 세 단계로 이루어져 있고, 이 사이클이 반복됨으로써 증폭을 일으키며, 이 과정에서 프라이머가 매우 중요한 역할을 한다.DNA 변성반응 혼합물에 열을 가해 94°C로 올림으로써 본래 이중가닥이던 DNA를 단일 가닥으로 분리시킨다. 이 때, 아무리 내열성 DNA 중합 효소여도 온도가 과하게 높아지거나 처리 시간이 과하게 길면 활성을 잃을 수 있으니 주의해야 한다.온도: 90°C ~ 96°C시간: 15~30초프라이머의 결합DNA를 온도를 낮춰 냉각시키면, 프라이머가 타깃 DNA의 양 말단에 있는 염기 서열에 수소 결합한다.온도: 55°C시간: 30초~1분신장 반응DNA 중합효소를 작용시켜 프라이머를 늘린다.온도: 일반적으로는 72°C, Taq polymerase를 사용할 경우 75°C~80°C이 세 단계를 하나의 사이클로 하고, 이 사이클이 반복함으로써 짧은 시간 내에 수많은 타깃 DNA를 증폭시킬 수 있다.PCR 증폭효율에 영향을 미치는 요인각 단계의 반응온도와 시간② Cycle 수반응액 조성 (주형 DNA, dNTP 농도, 농도 등)④ Primer 설계⑤ 사용하는 DNA 중합효소PCR은 생물학 분야에서는 물론이고, 과학 수사 또는 고생물 연구에도 유용하게 사용되고 있다. 또한, PCR 검사를 통해 백혈병이나 림프종과 같은 질병의 진단에도 활용된다.Reference1. Martha R. Taylor, 2018, Campbell Biology: Concepts & Connections, Pearson Education, 9th edition, 288p-289p2. Chien A, Edgar DB, Trela JM, 1976, Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus, J Bacteriol, 127p3. Stoffel, Saiki, Chang, Landre, Abramson, Gelfand, 1993, High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity, PCR Methods and Applications, 24. Angela B. Y. Hui, Annette D. Wong, Carlo V. Hojilla, 2015, Molecular Pathology: A Practical Guide for the Surgical Pathologist and Cytopathologist, Cambridge University Press, 55p-70pTitlePCRMaterials/ Method-Materials: PCR tube, DNA template, Taq polymerase, dNTP, Forward primer, Reverse primer, 10X reaction buffer, D.W (distilled water)-Methods아래 조성에 맞춰 PCR mixture를 만든다.D.W41.5 μl10X reaction buffer5 μldNTP mix (10mM)1 μlDNA template (100ng/㎕)1 μlForward primer (10pmol/㎕)0.5 μlBackward primer (10pmol/㎕)0.5 μlTaq polymerase0.5 μlTotal50 μlPCR mixture를 thermal cycler에 넣어 PCR을 진행한다.PCR이 끝나면 mixture를 agarose gel에 5 μl씩 loading하여 agarose gel electrophoresis를 실행한다.ResultsPCR product size : 5205 base pair (bp)SM : size marker1 : annealing temperature 70.0℃2 : annealing temperature 64.8℃3 : annealing temperature 59.9℃4 : annealing temperature 54.4℃5 : annealing temperature 49.8℃6 : annealing temperature 45.0℃(lane 1~6 : PCR 조성 모두 있음)7 : template x, 8 : dNTP x, 9 : Reverse primer x, 10 : Forward primer x11 : polymerase x(lane 7~11 : annealing temperature 64.8℃)그 외 다른 조건은 모두 같음1번부터 6번까지의 샘플에서는 밴드가 보이는 반면, 7번부터 11번까지는 밴드가 보이지 않는다. 특히, 2번과 3번 샘플이 눈에 띄게 선명한 밴드가 관찰된다.Discussion-DNA 중합효소로 Taq polymerase를 사용한 이유초기에 PCR에 사용되는 DNA polymerase는 Denaturation 과정을 지나면 열에 의해 파괴되어 반복적으로 중합효소를 가해줘야 하는 불편함이 있었다. 하지만, taq polymerase는 열에 강한 특성을 가지기 때문에 이를 사용한 후에는 그러한 불편함 없이 한 번 가했을 때 열에 의해 손상되지 않아서 여러 cycle을 돌릴 수 있게 되었다.이번 실험은 PCR로 DNA를 증폭시킨 후 agarose gel 전기영동을 통해 확인을 하는 것이었다.먼저, PCR mixture를 제작하였다. 10X reaction buffer, dNTP mix, DNA template, forward primer, backward primer, Taq polymerase 순으로 넣어주었다. Taq polymerase를 가장 나중에 넣었는데, 이는 그 효소의 온도에 대한 민감성 때문으로 판단했다. 왜냐하면, 다른 재료를 넣는 동안 taq polymerase는 특별히 얼음사이에 놓아둠으로써 차가운 상태를 유지하려고 했기 때문이다. 심지어, 손으로 튜브를 잡을 때에도 체온이 전해지지 않도록 하는 것 또한 그 이유 때문이다. 그 후, PCR 기계에 서로 다른 조작변인을 가진 샘플들을 PCR을 진행했다. 마지막으로, agarose gel 전기 영동으로 ladder에 나타난 band를 확인하였다.전기 영동 결과를 분석해보니, 1~6번 샘플은 밴드가 한 개씩 나왔고, 나머지는 밴드가 관찰되지 않았다. 또한, 1~6번 밴드 중 2번과 3번이 가장 선명하게 나온 것을 확인할 수 있다. 차례대로 해석해보면, 7번에서 11번은 DNA template, dNTP, reverse primer, forward primer, DNA polymerase 중 하나라도 결여되면 PCR은 일어나지 않는 것을 확인할 수 있다. DNA template은 DNA 복제 대상이기 때문에 당연히 이것이 없으면 DNA 중합이 절대 이루어질 수 없다. dNTP 또한 프라이머 후 중합하는 데 필요한 재료들이기 때문에 중합이 이뤄질 수가 없다. 그리고 forward primer나 reverse primer 둘 중 하나가 없다면, 이는 primer가 한 가닥의 DNA에만 붙고, 중합 반응이 한 방향으로만 일어날 수 있다는 것이므로 증폭 효과를 가지지 못하게 된다. 예를 들면, 하나의 이중 나선 구조의 DNA template이 있다면, 두 가닥 중 한 가닥에만 중합이 일어나고 그렇게 해서 만들어진 이중 가닥의 DNA에서 또 한 가닥에만 중합이 일어나게 된다는 것이다. 그렇기 때문에 연쇄적인 반응이 일어나지 못하게 되고, DNA의 수는 cycle이 여러 번 돌수록, 그 수는 PCR 후에 증폭한 DNA 수보다 턱없이 부족하게 된다.1~6번의 샘플을 보면 모두 한 개의 밴드가 관찰되는데, 이는 모두 같은 분자들이 검출되었다는 것이며, (-)전하에서 (+)전하로 이동하는 것으로 보아 (-)전하를 띠는 DNA분자임을 확인할 수 있다. 2번과 3번의 샘플이 유난히 뚜렷한 이유는 annealing 과정이 64.8도나 59.9도에서 가장 잘 진행되었다는 것이라고 해석했다. Annealing 단계는 primer가 염기서열에 수소 결합하는 과정으로, 적정 온도는 primer의 종류에 따라 조금씩 달라진다. 즉, 이 실험에 사용된 primer에는 대략 60도에서 65도가 가장 annealing에 적합한 온도라고 할 수 있다.Reference1. Martha R. Taylor, 2018, Campbell Biology: Concepts & Connections, Pearson Education, 9th edition, 288p-289p2. Chien A, Edgar DB, Trela JM, 1976, Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus, J Bacteriol, 127p3. Stoffel, Saiki, Chang, Landre, Abramson, Gelfand, 1993, High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity, PCR Methods and Applications, 24. Angela B. Y. Hui, Annette D. Wong, Carlo V. Hojilla, 2015, Molecular Pathology: A Practical Guide for the Surgical Pathologist and Cytopathologist, Cambridge University Press, 55p-70p

자연과학| 2021.08.25| 5페이지| 1,500원| 조회(376)

PCR, DNA, 실험, 증폭, 생물, 일반생물학실험

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