1효소 반응 속도론3. 실험 방법1. 0.1 M phosphate buffer solution 40 mL를 준비하고 실온에 방치한다.2. 0.1 M phosphate buffer solution 1 mL에 trypsin을 1 mg/mL 농도로 녹여 준비하고 실온에 방치한다.3-1. 기질을 DMF에 녹여서 각각의 농도 별로 (10, 20, 40, 80, 160, 200 mM) 준비한다. 200 mM의 기질 용액을 희석하며 만든다.3-2. 4-nitroaniline을 DMF에 녹여서 각각의 농도 별로 (2.5, 5, 10, 20 mM) standard solution을 준비한다. 200 mM의 용액을 희석하며 만든다.4-1. 2 mL tube에 0.1 M phosphate buffer solution 1960 μL를 넣고 기질 용액 20 μL을 넣은 후 뚜껑을 닫고 잘 섞어준다.4-2. 2 mL tube에 0.1 M phosphate buffer solution 1980 μL를 넣고 4-nitroaniline 용액 20 μL를 넣은 후 뚜껑을 닫고 잘 섞어준다.5-1. 기질 혼합액을 PMMA cell에 옮긴 후 20 μL의 효소 용액을 넣는다. UV-vis spectrophotometer로 5분간 20초마다 파장 410 nm에서 흡광도를 측정한다.5-2. 4-nitroaniline 혼합액 (standard solution)을 PMMA cell에 옮긴 후 UV-vis spectrophotometer로 파장 410 nm에서 흡광도를 측정한다.4. Note- 피펫 사용법: 피펫의 휠을 돌려 volume 조절 후 피펫에 맞는 팁을 끼우고 push button을 중간까지만 누르고 팁을 용액에 넣는다. 천천히 push button을 올리면 용액이 설정한 부피만큼 올라온다. 이때 push button을 한 번에 올리게 되면 용액이 튀어 피펫 안으로 들어가면 고장의 원인이 된다. Push button을 끝까지 눌러 용액을 원하는 곳에 주입한다. 용액을 주입한 후 push but래 두지 않는다.(4) Fume hood는 유독한 증기를 덕트를 통해 흡입한다.(5) 200mM 기질 용액을 희석해서 160~10mM 기질 용액을 제조하는 방법: 200mM 기질 용액 x0μL을 희석하여 160mM 기질 용액 x1μL을 제조하고, 200mM 기질 용액 x2μL을 희석하여 80mM 기질 용액 x3μL을 제조하고, 200mM 기질 용액 x4μL을 희석하여 40mM 기질 용액 x5μL을 제조하고, 200mM 기질 용액 x6μL을 희석하여 20mM 기질 용액 x7μL을 제조하고, 200mM 기질 용액 x8μL을 희석하여 10mM 기질 용액 x9μL을 제조한다. V1*M1=V2*M2라는 관계를 통해 x1=x0*(200/160), x3=x2*(200/80), x5=x4*(200/40), x7=x6*(200/20), x9=x8*(200/10)임을 알 수 있다.5. 결과 및 논의1) 실험 결과- 기질 농도별 Absorbance 측정 결과 및 Trypsin 반응의 생성물 농도① 기질 농도별 Absorbance 측정 결과(x축:time(min), y축:absorbance)② Trypsin 반응의 생성물 농도(x축: time(min) y축:concentration of product(μM)Trypsin 반응의 생성물인 4-nitroaniline의 농도를 구하기 위하여 standard solution의 absorbance를 이용한다. Standard solution은 시간에 따라 반응이 일어나지 않으므로 standard solution의 absorbance 데이터로 4-nitroaniline의 농도별 평균을 구한다. 4-nitroaniline 25 μM에서의 absorbance는 0.218, 50 μM에서 0.405, 100 μM에서 0.832, 200 μM에서 1.709이다.Beer’s law인 A=εbc를 이용하여 A/c=ε*(1cm)=(그래프의 기울기)이므로, ε= 8600 L/mol*cmStandard solution absorbance 측정 결과에 기질 농=0.0092mg, 기질 농도 160 mM 일 때 0.0092mg*(160mM/200mM)=0.0074mg, 기질 농도 80 mM 일 때 0.0092mg*(80mM/200mM)=0.0037mg,기질 농도 40 mM 일 때 [(0.018mL*200mM)/(434.9mg/mmol)]*(40mM/200mM)=0.0017mg,기질 농도 20 mM 일 때 0.0092mg*(20mM/200mM)=0.00092mg,기질 농도 10 mM 일 때 [(0.018mL*200mM)/(434.9mg/mmol)]*(10mM/200mM)=0.00041mg이다.- Standard 용액 (4-nitroaniline 용액)에 포함된 4-nitroaniline 의 질량 (standard 용액 20 μL 기준)20 μL = 0.02 mL, 4-nitroaniline 분자량: 138.12 g/mol4-nitroaniline 농도 20 mM 일 때 (0.02mL*20mM)/(138.12mg/mmol)=0.0029mg, 4-nitroaniline 농도 10 mM 일 때 0.0029mg*(10mM/20mM)=0.00145mg, 4-nitroaniline 농도 5 mM 일 때 0.0029mg*(5mM/20mM)=0.000724mg, 4-nitroaniline 농도 2.5 mM 일 때 0.0029mg*(2.5mM/20mM)=0.000362mg이다.- 실험 결과 datasheetConcentration of substrate [μM]Rate of absorbance [A410/min]V [μM/min]1/[S][μM-1]1/V [min/μM]20000.192922.4350.00050.044616000.181521.1020.0006250.04748000.100511.6820.001250.08564000.05276.13150.00250.16312000.02983.46150.0050.28891000.0151.7420.010.57411/Vmax [min/μM]Lineweaver-Berk equation의 y 절편00.02397Kcat/KM [μM-1 sec-1]-0.00000697- Michaelis-Menten equation, Lineweaver-Berk Equation 그래프- Trypsin 반응 후 용액오른쪽부터 차례로 (10, 20, 40, 80, 160, 200 mM)2) 결과 해석 및 논의- 실험 결과에 기반한 효소 촉매 반응의 속도론적 해석Vmax는 효소가 기질로 포화되었을 때, 단위 시간당 생성물로 전환하는 기질 분자의 수를 나타낸다. Km은 촉매반응이 일어나기 위해 요구되는 기질 농도의 척도이다. 즉 Km 값이 작을수록 효소와 기질의 촉매 효율(Kcat/Km)이 높아진다. 이때 촉매 효율은 촉매 반응 속도와 반응 세기를 고려한다. Michelis-Menten curve는 기질농도[S]에 따른 반응속도 V0의 그래프로 Michaelis-Menten kinetics를 따르는 효소는 최대 속도 Vmax에 점근적으로 도달한다. Lineweaver-Burk equation을 통해 구한 Vmax을 통해 효소의 최대 속도는 점근적으로 61.73 μM/min이라는 것을 알 수 있다. 다시 말해 효소의 농도가 계속해서 높아지면 효소 촉매 반응 속도가 비례하여 빨라지는 것이 아니라 일정하게 수렴한다는 것을 알 수 있다. Km은 Vmax/2의 속도에 도달할 때의 기질의 농도이므로 기질의 농도가 3437.13 μM일 때 효소의 속도가 30.865 μM/min에 다다르는 것을 알 수 있다.- 효소 반응과 일반 화학 촉매 반응의 차이점 분석효소는 거의 단백질로 구성되어 있으므로 일반 화학 촉매와는 다르게 온도와 pH에 민감하다. 즉 효소 반응은 일정 온도를 벗어나거나 일정 pH 범위에서 벗어나면 단백질 변형이 일어나 효소가 제 기능을 하지 못한다. 일반적으로 효소의 반응 속도는 일반 화학 촉매 반응 속도보다 빠르며 분자량이 더 크다. 효소의 경우 inhibitor(저해제)와 같은 분자가 효소를 반응하지 못하게 막을 수 있다.- 속도 상수의 중요성속도 상수는 k=Ae-E/RT 는 영향(1) pH: 효소 반응 속도가 최대인 pH를 최적 pH라 한다. 반응 시 최적 pH를 벗어나면 효소의 입체 구조가 변하여 활성을 잃게 하므로 효소 반응 속도가 급격히 감소한다. 최적 pH를 많이 벗어나 효소에 변성이 오면 다시 최적 pH가 되어도 효소 반응이 이루어지지 않으므로 불가역적이다. 위 실험에서 사용한 효소인 trypsin의 최적 pH는 8 정도이다.(2) 온도: 일반 화학 반응에서는 반응 온도가 높을수록 반응에 참여하는 분자의 운동 속도가 빨라져서 반응 속도가 증가한다. 그러나 효소 촉매 반응에서는 효소가 단백질로 이루어져 35°C~40°C 사이에서 최대 반응 속도에 이른다. 이때 온도를 최적 온도라 한다. 효소가 최적 온도 이상에서는 변형되어 반응 속도가 급격히 감소하고, 고온에서 변성된 효소는 온도를 최적 온도로 다시 낮추어도 활성화되지 않는다. 이 실험에서 사용한 효소인 trypsin의 최적 온도는 35°C~40°C이다. 따라서 trypsin reaction을 trypsin의 최적 온도에서 실시해야 한다.(3) 효소와 기질 농도에 따른 반응 활성도: 효소의 농도가 일정할 때, 반응 속도는 기질의 농도가 증가함에 따라 증가하다가 기질의 농도가 일정 수준이 되면 더는 enzyme-substrate 복합체를 만들 효소가 남지 않아서 반응 속도가 일정해진다. 기질의 농도가 일정할 때, 반응 속도는 효소의 양이 증가함에 따라 증가하다가 효소와 기질이 모두 반응하여 생성물을 만들게 되면 반응이 끝나게 되어 반응 속도가 감소한다.- UV Spectrometer 정량분석 원리 및 blank 보정 (또는 baseline 보정) 이유UV-vis spectrophotometer는 시료의 분석하고자 하는 파장을 결정한 후 파장대를 고정해 일정한 두께의 흡수 용기를 사용하여 standard solution의 몇 가지 농도에 대해 흡광도를 측정하여 농도-흡광도 곡선을 얻는다. 마찬가지로 파장대를 고정해 같은 두께의 흡수 용기를 사용하여 시료를 포함하는 solu.
