Aging 및 Nrl-KO에서의 ERG 변화 분석Scotopic 조건과 Photopic 조건에서의 ERG 결과 비교서론1.1. Abstract이번 실험에서는 시각신호 측정법 중 하나인 Electroretinogram(ERG) 기법을 이용할 것이다.어린 마우스와 나이든 마우스에서 ERG를 시행한 결과 나타난 a-wave와 b-wave에서의 차이점을 토대로 시각 신경의 노화양상을 파악할 것이다. 또한 그 원인을 추론하며 노화와 세포 기능 저하와의 상관관계에 대해 이해할 것이다. 추가적으로 Nrl gene의 기능과 작용 기작에 대한 확인을 위해 ERG기법을 이용할 것이다. 이를 앞선 두 어린 마우스, 나이든 마우스와 비교하는 과정을 거쳐 노화와 Nrl gene과의 관계 또한 파악할 것이다.1.2. Introduction1) Electroretinogram(ERG)· ERG는 망막의 광수용체(Rods, Cones), 망막 내부세포, 신경절 세포를 포함한 다양한 유형의 세포들의 전기적반응을 측정하는 검사방법이다. 망막반응을 측정하기 위해 각막 표면 또는 눈 밑 피부에 전극을 배치한다. 기록 중 대상의 눈이 표준화된 자극에 노출되면 결과 신호가 진폭으로 시간 코스를 표시한다. a-wave, b-wave의 진폭과 시간패턴은 망막에 도달하는 빛의 강도 및 주변 조도에 따라 달라진다. 특히 파동 기울기와 진동 전위와의 상관관계는 내부 망막 장애를 식별하는 유용한 지수가 될 수 있다.· 어둠에 적응한 눈에서는 희미한 빛에 ERG가 수행되고 주로 Rod system에서 발생한다. 반면 조명에 적응한 눈에서는 플래시가 Cone system에서 활동을 일으킨다. 충분한 밝기의 빛은 a파(초기음성파)를 유도하고 이어 b파(양성파)를 유도한다. 파동의 앞부분은 photoreceptor에 의해 생성되고, 나머지 단계는 bipolar, amacrine, Muller cells 및 muller glia의 통합적인 작용으로 생성된다.· ERG는 임상진단 목적으로 주로 쓰이나, 이 외에도 신약 e의 기작에 대한 증거는 Glutamate receptor에 대한 길항체 처리 시험으로부터 얻어졌다. 척추 동물의 망막을 glutamate 대사 길항제인 APB(2-amino-4-phosphobutyric)에 노출시키면 ERG b-wave가 사라지는데 APB sensitive metabotropic glutamate receptor는 On bipolar cells에서만 발견되기에 bipolar cell이 b-wave 생성에 관여한다는 결론을 얻을 수 있었다.·일반적인 빛 자극에 대해 건강한 개인에서 b-wave의 진폭은 a-wave보다 크다.4) PhototransductionPhototransduction은 시각계에서의 감각 전달이다. 빛이 눈의 망막의 rod cell(간상세포), cone cell(원추세포), photosensitive ganglion cell(감광성 신경절세포)에서 전기적 신호로 변환되는 과정으로 어두운 곳에서와 밝은 곳에서 서로 반대 기작으로 신호가 전달된다.· 광수용체 세포는 어둠에 반응하여 탈분극을 하는 특이한 세포이다. 반대로 빛 조건에서는 -60mV까지 과분극된다.· 어두운 곳에서는 cGMP 농도가 높아지고 cGMP에 의해 Na+ channel이 열려 Na+의 유입에 따라 탈분극이 시작된다. 이는 약 -40mV까지 전위를 상승시키고 유지시켜 뉴런 말단에서 Glutamate의 방출을 유도한다. 또한 암조건에서 세포막의 탈분극은 VG Ca2+ channel을 open을 유도하여 세포 내 Ca2+의 증가를 유도하고 신경전달물질인 Glutamate가 세포막과 합쳐져 시냅스 틈으로 방출되도록 한다. Glutamate는 일반적으로는 흥분성으로 작용하지만 시각 신경전달에서는 억제물질로써 작용한다.· 밝은 곳에서는 반대로 cGMP농도가 감소하여 Na+ channel이 폐쇄되어 과분극화가 일어난다. 이에 따라 VG Ca2+ channel이 폐쇄되어 Glutamate의 방출또한 감소하고 망막 신경의 억제가 감소해 신경의 흥분으로 이어진다.빛에 의해nd electrod, Reference electrode, Active electrode, 동공 확산제실험과정마우스를 복강에 마취제를 투여하여 마취시켰다. 이후 동공 확산제를 마우스 눈에 점안하고 5분이상 반응시켰다. 반응 후 G,R,A electrode를 마우스에 장착하였다. G electrode는 FOREHEAD에 부착하여 뇌신경을 측정하였고, R electrode는 OUTER CANTHUS에 장착하여 시그널을 측정하였다. 각 electrode에서 시그널이 전부 감지된 후 이 값들을 통합하여 A electrode가 부착된 곳의 신경 활성도를 계산하였다.‘(A-G)-(R-G)=A-R’의 식을 사용하여 값을 보정해 주었으며 이는 G에만 존재하는 noise를 없에기 위함이다.Scopotic ERG마우스를 12시간 이산 암적응을 시켜주었고 낮은 빛의 세기에서부터 점차 빛의 양을 늘려가며 전위차(a-wave, b-wave)를 측정하였다. 그 결과 Rod response를 파악하였다.Photopic ERG마우스를 10분 이상 빛에 적응 시켜주었고 낮은 빛의 세기에서부터 점차 빛의 양을 늘려가며 전위차(a-wave, b-wave)를 측정하였다. 그 결과 Cone response를 파악하였고 이 과정에서 Rod cell은 광 적응에 의해 억제되어 파형에 기여하지 않기에 Rod cell을 따로 제거하는 과정을 거치지 않았다.3. 결과 및 고찰3.1. 결과(Result)(a)(b)Figure.2(a)(b)Figure.3ㆍ Figure2.(a) Scopotic A-waveWT에서 전위차가 가장 크게 나타났다. 12M에서는 WT보다는 작은 전위차를 띄지만 Flash 초기강도에선 WT과 비슷한 양상을 나타낸다. Flash 강도가 세질수록 12M에서는 a-wave 전위차가 감소하며 그래프 개형 상 증가하는 양상이 나타났는데 이로 12M의 경우 Rod cell에 기능 이상이 생겼음을 추론할 수 있다. 반면 NRL KO 마우스는 NRL 유전자가 Rod cell을 분화시키지 못해 a-나타났다. Cone cell은 빛에 대한 적응이 Rod cell에 비해 빠르며 광순응 조건에서 고도로 예리하게 색을 구분하는 기능을 하는데, NRL KO조건에서 Cone photoreceptor로 많이 분화되기에 그만큼 빛자극에 대한 반응성이 높아진다. 이후 WT, 12M 순으로 response 증감이 크게 나타났다. 이 경우에도 노화에 따라 Rod cell 뿐만 아니라 Cone cell 기능 또한 저하되어 나타난 결과로 추론된다.(b) Photopic B-wavePhotopic 조건에서의 B-wave response 양상도 a-wave 측정시와 같은 이유로 그래프와 같은 결과가 도출되었다. Cone cell의 response 증가에 따라 NRL KO 마우스의 response가 크게 증가하는 양상을 띄었고, 반면 노화로 인해 Cone cell의 기능이 저하된 12M 마우스에서는 response의 증가폭이 미미한 것을 측정하였다.3.2. Discussionㆍ 12M 마우스에서 WT과 다른 결과가 나타난 이유노화에 따른 시력 감소의 원인에 크게 수정체의 변성과 망막신경의 손상이 있다. 전자의 경우 수정체가 변성되고 나이가 들면서 혼탁한 정도가 심해져 빛 통과가 점점 어려워 지고 이에 따라 시력이 저하되는 현상이 나타난다. 이러한 현상이 심해져 눈 전체가 뿌옇게 되는 병을 ‘백내장’이라 부르고 이는 노화가 대표적인 원인인 질병이다. 후자의 경우 노화가 진행되면서 망막 주변부의 신경세포가 감소하는 현상으로 시야가 좁아지는 증상이 나타난다.따라서 수정체 혼탁에 의한 빛 투과 감소와 노화에 따른 시신경세포수의 감소가 이번 실험에서 12M 마우스에서의 결과가 WT마우스 보다 더 작은 response 반응 폭이 나타나는 이유이다.ㆍ NRL KO 마우스에서 WT과 다른 결과가 나타난 이유마우스에서 NRL을 제거할 경우 Rod cell의 분화가 일어나지 않고, Cone cells 중 S cone에 의해 매개되는 Rod 기능과 supernormal cone function기능이 화 할 수 있다.시력상실, 이중시력, 흐릿한 시야, 색각 등의 문제 등이 발생했을 때 VEP검사를 시행한다. 이러한 증상들은 너무 미약하게 나타나 일반적인 임상검사에서 쉽게 감지되지 않고, 이에 VEP 검사를 이용해 시스템이 빛에 어떻게 반응하는지 파악하여 시신경 상의 문제를 쉽게 발견해낸다. 이를 이용한 검사는 또한 시력 차트를 읽을 수 없는 어린이와 성인의 시력을 확인하는데 사용될 수 있다.Visual evoked potential 측정법은 시각 자극이 눈에서 후두피질까지 이동하는 데 걸리는 시간을 측정하는 것으로 신경경로에 문제가 생겼을 경우 바로 파악할 수 있다. 예를 들어 다발성 경화증의 경우 뇌의 미엘린 수초 파괴에 의해 신경 전달이 느리게 나타나는데 VEP를 통해 지연된 시간을 파악하고 가능한 문제 상황을 생각할 수 있다.ERG가 시각세포에서 발생하는 전파를 기록하여 전파의 변화 양상을 통해 직접적으로 기능 이상을 파악할 수 있다면, VEP는 전파의 도달 시간을 기록하여 비교함으로써 간접적으로 신경전도상의 문제를 유추할 수 있다.3. 참고문헌(Reference)1. Relationships between the electroretinogram a-wave, b-wave and oscillatory potentials and their application to clinical diagnosis - PubMed (nih.gov)2. Stockton RA, Slaughter MM. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J Gen Physiol. 1989 Jan3. The Electroretinogram: ERG by Ido Perlman – Webvision (utah.edu)4. Jiang, X., Mahroo, O.A. Negative electroretinograms: genetic and acquired causes, diagnostic approas
FACS를 이용한 Cell Apoptosis 및 Cell Cycle 분석Apoptosis 진행 단계에 따른 비교 및 Cell cycle assay 결과 분석1. 서론1.1. Abstract1965년 John Kerr의 necrosis 연구로 세포사멸에 관한 연구가 시작되었고 1972년 Kerr 에 의해 apoptosis기전이 밝혀졌으며 이를 기점으로 세포사멸에 관한 많은 연구가 진행되고 있다.최근에는 Etoposide가 DNA손상을 유발하여 apoptosis까지 유도한다는 연구결과가 밝혀졌고 Cell population 단위에서의 뚜렷한 변화를 확인하기위해 이번 연구를 진행하였다. 본 보고서는 apoptosis 분야에 있어 인용도가 급격히 상승하는 연구에 대한 기초 지식과 함께 미래 연구기술로 자리잡기 위한 기법으로 ‘FACS’기법을 도입하였다. 우리는 이 실험법에 대한 설명도 제공할 것이다. 또한 Etoposide로 인해 활성화되는 p53경로에 의한 cell cycle arrest도 FACS기법을 이용해 파악할 것이다.1.2. Introduction1) Cell apoptosis· Apoptosis는 다세포 생물에서 일어나는 세포사멸의 한 형태이다. 생화학적으로 발생한 사건에 의해 발생하며 apoptosis 과정에는 세포 수축, 염색질 응축, DNA 조각화, mRNA의 붕괴가 포함된다.· Apoptosis의 원인은 유발인자의 위치에 따라 세포 안, 밖 두가지 경우로 나뉜다. 전자의 경우 중 하나는 미토콘드리아의 Cytc에 의한 것으로 이는 대개 바이러스에 의해 유발된다. 헬리코박터균의 독소 vacA는 미토콘드리아 막의 투과성을 높이고 이는 cytc의 세포질로의 유출을 야기한다. 그러면 세포질의 DNA 분해효소가 활성화되고 apoptosis가 시작된다.· Cell apoptosis는 한번 시작되면 비가역적으로 진행되기에 엄격하게 규제된다. 대표적으로 두가지 메커니즘 중 하나를 통해 시작된다.Intrinsic pathway의 경우 세포가 cell stress를 가 reactive oxygen species(ROS)와 많은 관련이 있다고 보고되고 있다. ROS는 세포 대사 과정에서 생성되고 즉시 불활성화 되지만, 그렇지 못할 경우 세포손상을 초래한다. ROS는 스트레스가 없는 상황에서는 세포 내 신호전달에 중요한 역할을 하지만, 과다하게 생성될 경우 산화적 스트레스를 일으켜 DNA손상, 노화와 apoptosis를 일으키게 된다.· apoptosis의 이상에 의한 질환-암: p53 돌연변이성 암종, 소포림프종-자가면역질환: 전신홍반성낭창(SLE)-후천성면역결핍증(AIDS)-골수형성 이상 증후군2) EtoposideEtoposide는 고환암, 폐암, 림프종, 백혈병, 신경아세포종, 난소암 등 다양한 종류의 암 치료에 사용되는 화학요법제이다. 구강 또는 정맥주사로 주입된다. Etoposide는 DNA와 Topoisomerase Ⅱ enzyme의 3차 복합체를 형성하고, 이를 통해 DNA 가닥이 끊어지는 것을 방지한다. 또한 Topoisomerase Ⅱ enzyme가 다른 곳에서 tension을 완화시키는 것을 막는다. 이것은 세포에 해로운 영향을 미칠 수 있는 DNA 이중가닥의 파괴와 추가적으로 이용가능한 Topoisomerase Ⅱ enzyme의 고갈을 초래한다. 암세포는 더 빨리 분열되기 때문에 건강한 세포보다 이 효소에 더 많이 의존하며, 결과적으로 Epotoside는 DNA 합성 오류를 일으켜 암세포의 apoptosis를 촉진한다.3) Flow cytometry(유세포 분석)유세포 측정법(FC)은 세포나 입자의 물리적, 화학적 특성을 감지하고 측정하는데 사용되는 기술이다. 레이저를 기초로 한 전기적 탐지기술로 흐르는 세포들을 중지하거나 보내는 것을 통하여 세포를 세고 분류하는 생물물리학의 기술이다. 유세포 분석기는 하나의 세포가 갖는 면역상태를 파악하고 이에 따른 여러 면역질환에 대한 연구분야에 이용된다. 또한 세포 혹은 핵 내부 DNA의 양을 분석해 악성종양의 성격을 파악한 후 진단이나 치료의 과정을 설정하고, 경속할 것이다.- DNA 손상이 회복될 수 없는 경우 cell apoptosis를 일으킨다.또한, P53은 DNA 손상, oxidative stress, osmotic shock 등 많은 스트레스 요인에 반응하여 활성화되는데, 이는 두 가지 주요 과정으로 표시된다.첫 번째는 p53 protein의 half-life가 급격히 증가하여 세포에 p53이 빠르게 축적되는 것이고, 두 번째는 conformational change가 p53이 세포에서 transcription regulator로 활성 되도록 강제하는 것이다. P53의 활성화로 N-terminal domain은 인산화되고, 이 영역은 다량의 인산화 부위를 포함하고 있어 protein kinases transducing stress signal의 주요 대상으로 간주된다.(a) (b)Figure.1(a) FC기술과 Droplet 기술을 이용한 cell sorting(b) Cell cycle의 모식도. 외부 고리: I=Interphase, M=mitosis, 내부 고리: M=mitosis, G1=Gap 1, G2=Gap2, S=synthesis, G0=Gap0/Resting2. 본론2.1. 재료 및 방법 (Materials & Methods)1) Cell apoptosis 측정실험실험 재료 및 시약본 실험에서는 1xbinding buffer을 사용하며 일부 Ca2+를 추가해 주었다. PI단백질과 Annexin V-FITC을 이용해 분류하였으며 Pipette, Tip, 1.5ml tube를 이용하였다.세포배양대조군으로 사용할 세포는 DMEM배지를 사용하여 5% CO2 37℃에서 배양하였다. 실험군 세포 배양시 Etoposide는 DMSO에 용해시켜 세포증식 분석을 위해 희석하였고 세포를 분주한 후 etoposide 농도를 0.2-10μM로 3일간 배양하였다.Propidium iodide(PI)/Annexin-FITC의 염색 및 형광 현미경 관찰Cell을 1x binding buffer 100ul을 이용해 resusesult)(Figure2.는 저작권 문제로 삭제)Figure 2. ApoptosisEtoposide를 농도별로 투여하여 3일간 배양 후 세포 성장을 관찰한 결과 Etoposide의 농도와 시간에 의존적으로 세포 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. Etoposide 처리 후 0,24,48,72시간 후 세포의 형태학적 변화를 관찰하였는데 apoptotic cell이 2.6배,10배,24배로 시간 의존적으로 증가하는 양상을 보였다.(Figure3.은 저작권 문제로 삭제)Figure3. Etoposide에 의해 유도되는 apoptosis 기전을 확인하기 위해 추가적으로 Western blot을 실시하였다. Etoposide positive cell에서 p53 단백질이 증가하는 것이 관찰되었고 이에 따라 p21단백질까지 증가하는 것이 확인되었다.Figure 3. Cell cycle assayEtoposide 처리가 세포의 성장과 분화에 영향을 주는지 알아보기 위해 flow cytometry로 세포주기를 시간별로 분석한 결과, G1기는 시간이 지남에 따라 감소하였고 S기는 48시간 까지 꾸준히 증가하였으며 G2/M기는 감소하다 72시간째에 급격히 증가하였다. 72시간 째에 sub-G1과 G2/M기의 증가는 cell cycle arret 단계를 넘어 apoptosis가 진행된 결과로 파악된다.3.2. 고찰(Discussion)1) Cell apoptosis 측정Etoposide가 apoptosis 유도에 미치는 영향Etoposide는 Topoisomerase inhibitor 계열에 속해 DNA를 손상시키고 이는 p53의 작용으로 이어져 세포분열을 억제한다는 선행연구가 있었다. Cell population 단위에서 apoptosis까지의 유발정도를 확인하기 위해 이를 FACS로 확인해 보았다.FACS를 통해 Etoposide- cell 과 Etoposide+ cell을 비교한 결과 Etoposide negative cell 보다 Etoposide positive c유발함을 입증하였다.FACS 분석을 위한 Alcohol fixation 기법의 효능cell cycle arrest 관찰을 위한 Etoposide를 처리하기에 앞서 fixation과정을 거쳤다. Alcohol fixation기법을 택했는데, 이는 세포막의 지질성분을 제거하며 Aldehyde 처리시 보다 세포내부의 단백질을 손상시키는 경향이 있다. 그러나 dye가 세포내로 들어가기 위한 추가적인 permeabilization 과정을 필요로 하지 않으며 DNA는 손상시키지 않는다는 장점이 있다. Cell cycle 측정 시에는 FACS 결과 중 DNA에 의한 것만 파악할 것이기에 이번 실험의 효율을 높이기 위해 Alcohol fixation을 선택하였다.FACS 기법이용 시 RNase 첨가 의의DNA를 표지하는 형광단백질로 PI를 사용하였는데 이는 점성이 높아 cell을 pipetting하는 과정에서 cell이 뭉치도록 유도할 수 있기에 PBS로 wash하는 과정을 거쳤다. PI는 모든 nucleotide를 염색하는 단백질로 RNA로 인해 나타날 오차 값을 줄이기 위해 추가적으로 RNase를 실험과정에서 첨가해 주었다.Cell apoptosis 실험과 Cell cycle 측정 실험에서의 차이점Apoptosis 진행 실험에서는 FSC와 SSC에 따라 FACS 결과를 분석한 결과 Dead cell들이 측정되었다. 하지만 cell cycle 측정시에는 Dead cell이 나타나지 않았는데 이는 두 실험과정 중 fixation의 유무차이로 인한 것으로 추정하였다. Cell cycle 측정 실험에서는 Alcohol fixation을 해주었기에 그 과정에서 Dead cell은 전부 터지거나 쪼개져 Debris의 상태가 된다. 따라서 Debris 구역의 cell이 증가한 상태로 그래프에 나타난다.4. 참고문헌 (Reference)1. Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis" https://en.wikipedia.org/wiki42/
