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1.생명공학/과학과 학종 목표 고등생을 위한 보고서. 제가 고등학생 때 논문들 읽으며 쓴퀄리티 보고서들입니다. 전 학종으로 이화여대 합격했습니다.
2. 이화 생명과 과제.

전문분야 공학/기술자연과학농/수산학

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이화여자대학교 휴먼기계바이오공학부 재학중

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DNA 합성 기술과 인공 미생물의 활용 / 하이퀄리티 고등학교 보고서

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공학/기술| 2025.04.24| 15페이지| 2,000원| 조회(33)

생명공학, 보고서, 대학생, 고등학생, 오가노이드, DNA 편집기술, 인공 미생물

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생명과학실험1 A+ Ion exchange column chromatography 보고서

학생이름ㄶㅇ 학번: ___ 분반: ___ 제출일자: 2022.04.00 Ion exchange column chromatography 실험 목적 Column chromatography 를 이용하여 E-coli 의 protein mixture 에서Alkaline phosphatase 를 분리한다. Introduction Ⅰ. Column chromatography Column chromatography 는 charge , size , binding affinity 와 같이 protein 마다 다른 properties 를 이용한 protein fractionating method 이다. 종류로는 ion-exchange , size exclusion , affinity chromatography 이 있다. Column chromatography 는 유리나 플라스틱으로 만든 column 안, porous support 위 solid porous matrix 인 stationary phase 와, protein sample 인 mobile phase 로 구성되어 있다. Mobile phase 는 내부 proteins 이 separate 돼 individual 한 ever-expanding band 를 형성하며 stationary phase 를 지난다. Proteins 는 charge , size , binding affinity 등 property 에 따라 solid matrix와 다르게 상호작용하기에, 각 protein bond 가 다른 속도로 migrate 하기 때문이다. 이 방식으로 protein 또는 protein mixture sample 안 protein 을 종류별로 분리할 수 있다. Ⅱ. Ion-exchange chromatography Ion-exchange chromatography 는 특정 pH 에서 proteins 마다 다른 net electric charge 의 sign 과 magnitude 를 이용한 chromatography 이다. Columnn exchanger 로는 DEAE (diethylamino acid) 가 있다. Ion-chromatography 에 protein mixture 을 주입하면, matrix 와 반대 net charge 를 지닌 protein일수록 matrix와 attractive interaction 을 하기에 느리게 spread 된다. 반대로 matrix 와 같은 net charge 를 지닌 protein 일수록 빨리 spread 된다. Matrix 와 반대의 net charge 를 지닌 protein 은 추후 여러 농도의elution buffer 을 주입해 elute 한다. 이때 matrix 와 강한 ionic bond 를 형성한, 즉 강하게 attract된 물질일수록 고농도의 buffer 을 주입했을 때, 즉 느리게 elute 된다. Matrix 와 protein 의 interaction 은 surrounding solution 의 pH 와 completing free salt ion 의 concentration 의 영향을 받기에, mobile phase 의 pH 나 salt concentration 을 변화시켜 separation 에 optimize 시킬 수도 있다. 특히 pH 의 경우 protein 의 net charge 에 영향을 미치기에 그렇다. Ⅲ. Elution Ion-chromatography 에서 NaCl 을 이용한 elution, salting out 은 NaCl 이 proteins 가 inject 된 chromatography column 에 주입될 시, protein 의 표면에 붙어있던 matrix의 functional group 과 protein 보다 더 강하게 attract 해 bond 를 형성하고, 그로 인해 protein 의 solubility가 낮아지는 현상이다. 이로 인해 protein 은 column 의 아래로 spread 한 후 column 밖으로 elute 된다. NaCl 의 concentration 이 높을수록 matrix 와 강하om E-coli’s periplasm) , 1.5 mL E-tube (10 개) , wash buffer (1 M 기본 Tris-HCl buffer, pH 7.4) , elution buffer (4 types: 30, 100, 150, 200 mM NaCl) , column cap , chromatography column (DEAE-Sepharose with reservoir) , ice storage box , test tube holder , beaker , distilled water , 10% NaCl , 0.2 M ethanol Methods • 실험 이전, 10개의 E-tube 에 naming 을 해 놓는다. (Control: PM , FT / Experimental group: NaCl 30-1, 30-2, 100-1, 100-2, 150-1, 150-2, 200-1, 200-2) • 펜을 이용해 모든 E-tube 의 0.5 mL 부분에 선을 그어 표시해 놓는다. ※ Protein 은 온도에 민감하니 E-tube 의 하단을 만지지 않는다. DEAE-Sepharose 와 reservoir 가 들어있는 bead slurry 1mL 를 column 에 loading 한 후, 그 둘이 1:1의 비율로 layer 을 형성할 때까지 대기한다. ①의 column 에 wash buffer 1mL 씩 5번 bead washing 을 해준다. Wash buffer 은 micropipette 을 이용해 inject 하며, 매washing 이후 추출되는 solution 은 column 아래 beaker 에 받는다. ※ 이때 bead 가 뒤집어질 정도로 강하게 pipetting 한다. ②의 5번째 washing 진행 시, wash buffer inject 후 추출되는 solution 이 거의 다 추출될 즘 column 을 cap으로 막는다. 이후 bead slurry 가 layer 을 형성하면 cap을 column 에서 제거한다. PM (protein mixturewashing 을 진행한다. 매 washing 이후 추출되는 solution 은 column 아래 beaker 에 받는다. 이 과정을 통해 nonspecific bound protein 을 column 에서 제거한다. ※ 이때 bead 가 뒤집어질 정도로 강하게 pipetting 한다. ⑥의 bead slurry 가 layer 을 형성할 때까지 대기한다. ⑦의 column 에 NaCl 30mM elution buffer 1mL 를 micropipette 을 이용해 inject 한다. Injecting 과 동시에 30-1 E-tube 를 column 아래에 고정해 elute 되는 protein solution 0.5 mL 를 받는다. 이어 30-2 E-tube 에도 eluted solution 0.5 mL 를 받는다. ※ Bead packing 이 흐트러지지 않도록 약하게 pipetting 한다. ⑧의 tube 들을 ice storage box 에 보관한다. ⑧, ⑨의 과정을 100, 150, 200 mM NaCl elution buffer 에 대해 반복한다. ※ 이때 저농도에서 고농도의 buffer 순으로 진행한다. Column chromatography 가 끝난 column 에 micropipette 을 이용해 wash buffer 로 backwash 를 해준다. (이 과정에서 bead particle 의 suspended solids 등을 제거할 수 있다.) 10% NaCl 최소 1 mL 을 ⑪의 column 에 pipetting 한다. ※ UV absorbance monitor 을 사용하며 wash 과정을 확인하면 wash 를 더 정확히 할 수 있다. ⑫의 eluted solution 이 다 빠져나오면distilled water 2.5 mL을 column 에 pipetting 해 bead wash 한다. Starting wash buffer 최소 5 mL 을 ⑬의 column 에 강하게 pipetting 한다. ※ UV baseline , eluent praphy 에서 wash buffer 은 protein 의 pi , isoelectric point 에서 1 unit 떨어진 pH 로 설정한다. 이러한 pH 에서 protein 은 ion-exchange matrix 와 잘 bind 될 수 있게 high enough 한 net charge 를 가지면서 너무 highly charged 되어 harsh elution condition 이 요구되지는 않게 하기 때문이다. AP 는 – charge 를 띄는 protein 이기에 4.4-5.8 산성 pi 를 지닌다. 고로 실험에서 사용한 wash buffer , pH7.4 Tris-HCl solution에 protein 을 inject 하면 AP 는 H+ 를 잃은 후 ion-exchange chromatography 에 적합한 – charge 를 띄고 + charged DEAE 와 bonding 한다. 실험 과정 중bead slurry layer 을 형성할 때까지 대기하는 이유는 추후 주입된 PM 내 protein들을 stationary phase 위 동일선상에 위치시키기 위함이다. 이는 protein 의 spread 에 ion-exchange 와 diffusion 제외 다른 변인은 최소화한다. FT 는 flow through 로 DEAE matrix 와 같은 net charge 를 지녀 가장 먼저 spread 후 추출되는 protein 이다. 해당 실험에서 PM sample 은 positive control , FT sample 은 negative control 이다. 추후 이 실험의 sample 에 대해 SDS-PAGE 를 진행 시, PM 에선 positive 반응을 보이고 FT 는 negative 반응을 보이며 특정 concentration 의 elution buffer sample 에서 positive 반응을 보이는 proteins 중 하나가 AP 일 것이다. Reference David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger Princ9.

자연과학| 2025.06.24| 4페이지| 5,000원| 조회(60)

리포트, 이온 크로마토그래피, 생명과학실험1

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생명과학실험1 A+ Protein electro transfer 와 Western blot 을 이용한 단백질 분석 보고서

학생이름ㄶㅇ 학번: ___ 분반: ___ 제출일자: 2022.04.26 Protein electro transfer 와 Western blot 을 이용한 단백질 분석 Introduction Western blot 은 biological sample 을 gel 에서 membrane 으로 옮겨 membrane 표면에서 검출하는 단백질 분석 방법이다. Western blot 은 다음과 같은 순서로 진행된다. (1) Protein mixture 을 SDS-PAGE 를 이용해 크기대로 분리한다. (2) 단백질을 nitrocellulose 또는 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane 에 옮긴다. (3) Membrane 표면에 antibody 의 unwanted binding 을 방지하기 위해 blocking 과정을 거친다. 이때 주로 skim milk in TBST 나 BSA(bovine serum albumin) solution 을 이용해 blocking 한다. (4) Membrane 의 특정 단백질과 결합하는 antibody 를 반응시킨다. (5) 이때 antibody 에는 enzyme 이 결합되어 있기에 antigen-antibody 반응 이후 substrate 를 넣어주면 enzyme 이 있는 곳에서만 enzyme-substrate 반응이 일어난다. (6) 색을 발하거나 형광을 발하는 침전물을 membrane 표면에 침전 시켜 해당 substrate 반응을 검출한다. 대표적으로 활용되는 것은 chemiluminescent substrate 이 내는 빛을 film, CCD camera, phosphor imager 로 검출하는 방법이다. Western blot 의 검출 방법은 크게 indirect detection 과 direct detection 이 있다. Direct detection 은antigen 을 인식할 수 있는 primary antibody 에 검출에 사용되는 enzyme 이나 fluorescence dye 를 달아 인식ng stand, kimtex, gel assembly, running tank, power supply, transfer cassette, transfer tank, shaker, orbital shaker Ⅱ. Method ⅰ. SDS-PAGE 단백질 sample 을 준비한다. (Sample: Protein mixture, Flow through, 30-1, 30-2, 100-1, 100-2, 150-1, 150-2, 200-1, 200-2) 각각의 sample 24 μL 와 5x sample buffer 6 μL 를 vertexing 하고, 90 도에서 5 분간 cook 한다. Heating 이후 다시 vertex , centrifuge. Acrylamide gel, Electrode assembly 와 Buffer tank 를 준비한 후 Electrode assembly 에 gel 장착한다. 이후 1x SDS running 을 안과 밖에 채워준다. 준비한 marker 와 sample 를 pipette 을 이용해 well 에 loading 한다. Electrode assembly 를 power supply 에 연결하고 (-): 검은색, (+): 빨간색을 잘 확인하고 뚜껑을 닫는다. Supply 를 20V 으로 run 을 시작하고 약 20분 후 marker 가 분리되면 120 V로 loading buffer 의 dye 가 gel 의 바닥에 도달할 때까지 전기 영동을 진행한다. ⅱ. Protein electro transfer Transfer cassette (-): 검은색, (+): 흰색을 확인한다. Tray 에 transfer buffer 를 붓고, cassette 의 흰 판을 밑으로 놓는다. Cassette안의 spongy 를 buffer 에 충분히 적시고, 흰 판 위에 올린다. Gel Releaser 를 이용해서 3M paper 를 transfer buffer 에 충분히 적시고, spongy 위에 올린다. Membrane 을 싸고 있는 파란색 종이 한 들어있는 skim milk 를 버리고, 1% TBST 를 4ml 넣어서 shaker 에서 5 분 씩 3번 wash 한다. Wash 가 끝나면 Luminol 성분을 포함한 A solution 과 hydrogen peroxide를 포함하는 B solution 을 1:1 의 비율로 섞어 ECL 을 만든다. Membrane 에 ECL solution 을 고르게 뿌려준다. Film 에 membrane 을 올리고 밀착시킨 후 ChemiDoc 을 이용해서 detection 한다. Marker 사진과 단백질 발광사진을 촬영한다. Result 두 detection 공통적으로, elution buffer 의 농도 100mM 까지는 농도가 올라갈수록 detect 되는 protein 의 양이 많아지고, 그 이후부터 buffer 농도 200mM 까지는 양은 줄어드나 target protein 의 intensity 가 증가한 것을 볼 수 있다. Discussion Ⅰ. Membrane ⅰ. Nitrocellulose membrane Nitrocellulose membrane 은 binding capacity 가 80-100 µg of protein/cm2 으로, protein 과 주로 hydrophobic interaction 에 의해 binding 한다. Nitrocellulose membrane 을 이용해 transfer 를 진행할 때, transfer buffer 은 high salt 와 low methanol concentrations solution 으로 이루어져 있는데, 이들은 electrophoretic transfer 동안 protein immobilization to the membrane 을 증진시킨다. Nitrocellulose membrane 은 PVDF 에 비해 fragile 하고 binding capacity 가 낮지만 생성될 수 있는 background 가 상대적으로 낮다. 주로 100kDa 이하의 low molecular weight protein 을 d protect 한다. Sandwich 에 (-) charge 를 걸면 gel의 negatively charged protein이 (+) charge 쪽의 membrane 으로 이동해 immobilized 된다. 이와 같은 electrophoretic transfer 은 semi-dry 또는 wet conditions 에서 이루어진다. Wet conditions dl gel 을 dry out 시키지 않기 때문에 주로 더 prefer 되며, larger protein의 transfer 에 사용된다. Gel 과 membrane 이 밀착될수록 clear image 를 보인다. Ⅱ. Transfer buffer Transfer buffer 은 Tris-base, glycine, 20% methanol 로 이루어져 있다. Trans buffer 안의 methanol 은 gel swelling 을 예방하고, protein 을 SDS 로부터 stripping 하는 것을 aid 해 membrane 의 protein binding 을 증진시킨다. 하지만 methanol 은 gel pore size reduction 이나 protein precipitation 을 일으키기에 high molecular protein transfer 엔 disadvantageous 할 수 있다. 고로 recommended methanol concentration 은10~20% 우로 제한되어 있다. Ⅲ. Blocking : BSA, Skim milk BSA , bovine serum albumin , skim milk 는 fat 성분이 제거된 non-fat milk 이며 둘 다 western blot 에서 blocking material 로 이용된다. BSA 는 60 kDa 의 한종류의 protein 으로 이루어져 있다. 반면 skim milk 는 다양한 크기의 다양한 proteins 으로 이루어져, skim milk 가 BSA 에 비해 background banding 을 더욱 줄여준다. 하지만 수 있는 molecule 이기에 cancer , rheumatic heart disease , arthritis 에 활용이 주목되고 있다. Trastuzumab 등 최근 successful 한 monoclonal antibody 의 demand 와 supply 가 boost 되고 있다. 이러한 therapeutic antibodies 는 해당 병들의 치료의 cost 를 reduce 하고 있기에 cost-sensitive 한 healthcare market 에 침투가 늘고 있다. 하지만 antibody market 의 restraint 는 research 와 clinical screening test 에 영향을 미치는 inadequate reproductive result 이다. 또한 large bioreactor 와 filtration system 이 antibody production 에 필요하다는 점도 impede 요소이다. Reference David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry 6th Edition, New York: W. H Freeman and Company, 2016, pp. 175, 176 Cell signaling technology, “Milk or BSA? Choosing blocking protein for Western Blot” , 2018.06.25., Hyperlink "https://blog.cellsignal.com/tech-tips-video-milk-or-bsa-choosing-a-blocking-protein-for-western-blot" https://blog.cellsignal.com/tech-tips-video-milk-or-bsa-choosing-a-blocking-protein-for-western-blot , 접속일 2022.04.24. Gbiosciences, “A Discussion of Protein Research: .

자연과학| 2025.06.24| 7페이지| 5,000원| 조회(56)

리포트, Western blot, 생명과학실험1

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생명과학실험1 A+ Enzyme Fluorescence Assay 보고서

생명과학실험1: __분반 Week 9.10 Enzyme Fluorescence Assay To determine Catalase concentration in unknown sample 이름: ㄶㅇ 학번: 학과: 제출일: 2022-5-17 Introduction Enzyme 은 biological system 에서 extraordinary catalytic power 을 제공하는 highly specialized protein 또는 RNA 으로, substrate 와 반응해 product 를 생산한다. Enzyme-substrate reaction 은 substrate 의 농도에 주로 영향을 받고, substrate 의 농도가 충분하면 enzyme 의 농도에 dependent 하다. 이때 substrate 농도와 reaction rate, 또는 reaction 속도의 관계는 quantitatively 하게 표현된다. 이러한 enzyme kinetics 를 통해 enzyme mechanism 을 이해 또는 활용할 수 있으며 미지의 sample 이나 효소에 대해 알아낼 수 있다. Enzyme 의 존재여부나 양은 inheritable genetic 과 그 외 여러 질병의 원인이기에, blood plasma, tissue samples 등에서 enzyme activities 의 측정은diagnosis에서 중요하다. 또한 많은 치료제들은 enzymes 과의 interaction 을 통해 작동하며, 그 외에도 enzyme , enzyme kinetics 는 amplification 이 가능한 biosensor (enzyme biosensor) 에 활용되거나, chemical engineering , food technology 에 활용될 수 있다. 이와 같이 biotechnology industry 에서 매우 핵심인 enzyme reaction 과 enzyme kinetics 를 실제로 이용해 미지의 sample 의 특성을 알아내는 것이 이번 실험을 하는 이유이다. 이번bstrate 인 H2O2 와 반응해 H2O 와 O2 를 product 로 내놓는다. 이번 실험에선 이 reaction의 product 가 아닌, reaction 후 remain 하는 H2O2 를 non-fluorescent probe 인 Amplex red 와 catalysis 인 HRP 와 반응시켜 생성되는 fluorescent 물질인Resorufin 발광 정도, 즉 양 에 따라 sample 의 catalase 농도를 추정하는 indirect assay 를 진행한다. ( Figure(1) 참조 ) Sample 의 catalase 농도가 높을수록 detect 되는 Resorufin 의 양이 적을 것이다. Resorufin 의 생성 량 detect 에 사용하는 Fluorescence enzyme assay 는 enzyme 을 측정하기 위해 substrate 과 product 의 fluorescence 차이를 측정하는 assay 방식이다. Fluorescence 는 molecule 이 특정한 파장의 파동을 absorb 해 transition 이후, decay 하며 특정한 다른 파장을 emit 하는 물질의 성질이다. 이 실험에선 Resorufin detect 에 Ex/Em 540/590 nm 의 파동을 이용한다. Figure (1) Materials Micropipette, pipette tips , 1.5 mL microtubes (Week 9: 12 tubes, Week 10: 16 tubes) , 1.5 mL light blocking microtubes (Week 9, 10: 3 tubes each) , 96 well plate , 20 mM Tris buffer (pH 7.5) , 1000 U/mL Catalase , Hydrogen peroxide , 100 U/mL horseradish peroxides (HRP) , 10mM Amplex Red , Plate reader (SpectraMax i3x) , Sample A, B Methods H2O2 standard 용액을 만들고, sample 2~ 6 tube 에는 Tris buffer 400 μL 를 주입 해 놓는다. Sample 1의 catalase 농도는 2 U/mL이다. Standard 용액에서 400 μL 를 pipette 로 추출 후 a. 상태의 sample 2 에 pipetting 해, catalase 농도가 1 U/mL 이 되게 한다. Sample 1 에서 400 μL 를 pipette 로 추출 후 a. 상태의 sample 3 에 pipetting 해, catalase 농도가 0.5 U/mL 이 되게 한다. Sample 5 까지 b. 와 같은 활동 (serial dilution) 을 반복하고, sample 6 은 catalase 농도가 0 이 되게 한다. b, c 에서 각 sample 이 잘 섞이도록 여러 번 pipetting 한다. Light blocking microtube 에 1 mM H2O2 65 μL 을 Tris buffer 935 μL 와 함께 pipetting 하여 H2O2 를 65 μM 로 희석한다. 96 well plate 에 sample 1~ 6 25 μL 를 ② 의 H2O2 25 μL 와 함께 two replicate loading 한다. (총 12 개의 well 사용) Room Temperature 에서 30 분 동안 ③ 을 activation 한다. ③ 의 activation 완료 10분 전, 10 mM Amplex Red 9.8 μL , 100 U/mL HRP 4.9 μL , Tris buffer 700 μL 를 함께 light blocking tube 에 pipetting 해 probe + HRP solution 을 제조한다. ③ 의 activation 이 완료되면 well 에 담긴 각 sample 에 ⑤ 의 solution 50 μL 씩 loading 한 후 well 을 Room Temperature 에서 10 분 간 activation 한다. Ex/Em 540/590 으로 SpectraMax i3x 으로 반응L , 100 U/mL HRP 6.3 μL , Tris buffer 900 μL 를 함께 light blocking tube 에 pipetting 해 probe + HRP solution 을 제조한다. ③ 의 activation 이 완료되면 well 에 담긴 각 sample 에 ⑤ 의 solution 50 μL 씩 loading 한 후 well 을 Room Temperature 에서 10 분 간 activation 한다. Ex/Em 540/590 으로 SpectraMax i3x 으로 반응값을 측정한다. Result 한 sample two replicate 의 평균을 기준으로, week 9 의 sample 2 를 제외하고선, week 9 과 week 10 둘 다 catalase 의 농도가 낮은 sample일수록 fluorescence intensity 가 크게 도출되었다. Sample 6, 5, 4, 3, 2, 1 의 순서대로 결과값이 크다. ( Chart (1), (2) 참고 ) Catalase 농도에 대한 sample 1~6 의 sample 6으로부터의 편차는 week 9, week 10 의 결과 모두 exponential 함수 모양의 plot 을 이룬다. ( Figure (2), (3) 참고 ) Week (3) 의 Catalase 농도에 대한 sample 1~6 intensity 의 sample 6으로부터의 편차 plot 을 에서 linear 한 추세선으로 나타낸 결과, 가 도출됐다. ( Figure (3) 참고 ) Two replicate 의 평균값을 결과값으로, week 10 Sample A, B 각각 intensity 의 sample 6으로부터의 편차를 위 식에 대입하면, sample A 내 catalase 의 농도는 3.4153604 U/mL , sample B 의 catalase 농도는 2.0976266 로 추정할 수 있다. Discussion Michaelis-Menten equation 에 의해 Sample solution 내 H2O2 농도가 이고, 같은 시간동안 상대적으로 낮은 Resorufin, fluorescence assay 의 target, 을 생성하기 때문에 catalase 농도가 높을수록 낮은 intensity 가 도출될 거라 가정했다. 실제로 가설과 유사하게 위와 같은 결과가 도출됐다. 하지만 각 replicate 내에서 week 9 replicate 2 sample 5 와 같이, 또는 평균값을 기준으로 하여도 week 9 의 sample 2 와 같이 가설을 따르지 않는 결과가 몇 있는데, 이는 sample 제조 과정 중 pipetting 만으로 sample 내부가 완벽히 uniform한 농도가 되지 않았기 때문일 가능성이 크다. 또한 동일 week 동일 sample 내 replicate 의 다른 결과의 경우 SpectraMax i3x 의 dynamic range 에 포함될 경우 예상된 차이일 것이다. Figure (2), (3) 과 같이 해당 실험에서 catalase concentration 에 대한 fluorescence intensity 는 exponential 함수 형태로 도출됐다. 하지만 이론적으로 excitation E 의 2 % 미만이 absorb 된 경우 이 둘은 식 (If: fluorescence intensity, k: instrument 의 constant, Io: incident light intensity, fluorescence quantum yield, ε: molar absorptivity, b: path length, c: substance 의 concentration ) 의 linearly proportional 한 관계를 가진다. 고로, 위에서 exponential 형태가 나타난 이유는 data 수가 극히 적기 때문이며, data 수가 많을 경우 linear 한 형태를 띌 것이다. 또한 plot 이 더 linear 한 form 에 가까운 week 10의 sample 에 대한 analysis 가 week 9 에 비해 더 잘 이루어졌다고 할 수 있다. C이다.

자연과학| 2025.06.24| 5페이지| 5,000원| 조회(52)

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생명과학실험1 A+ Immunoprecipitation 보고서

생명과학실험1: __분반 Week 11, 12 Immunoprecipitation To detect the target protein 담당 교수명: __ 이름: ㄶㅇ 학번: ___ 학과: ___ 제출일: 2022/06/14 오후 7시 50분 Introduction Immunoprecipitation, 면역침강법은 bead 나 magnetic particle 와 같은 solid support 에 immobilized 된 antibody 를 이용해 specific 한 antigen, 즉 target protein 을 침강해내는 small-scale affinity purification 이다. Solid support 와 antigen complex 를 생성 후 이를 protein mixture 에 투입하고, 형성된 bead-antigen-antibody complex 를 침강시킨다. 이후 western blot 등을 이용해 target protein 의 purification 을 확인하는 단계로 완성될 수 있다. IP 는 매우 다양한 방식으로 응용 가능하고, 실험자가 원하는 정보를 얻을 수 있게 한다. IP를 응용한 방식으로는 (1) Protein mixture 에서 target protein 만을 purification 한 individual protein immunoprecipitation (IP) , (2) Second antibody 등을 이용해 PPI 를 확인하는 protein complex immunoprecipitation (Co-IP) , (3) Protein-DNA interaction 을 확인하는 chromatin immunoprecipitation (ChIP) , (4) Ribonucleoproteins 를 target 으로 하는 RNA immunoprecipitation (RIP) 등이 있다. 또한 target protein 의 antibody 가 없을 땐 , His , Myc , HA , GST , FLAG tag 등을 target proein 을 얻어내기 위해 HEK293 T Cell 을 culture 했다. ( Immortalized ) Human embryonic kidney (HEK293) T cell 은 receptor signaling , protein production 등에서 most widely 하게 사용되는 robust 하고 fast-growing cell line 으로 HEK293 Cell 의 derivative 이다. 해당 cell line 은 single healthy, electively terminated 된 female fetus 에서 기원하며, HEK genome 에 Ad5 , E1A , E1B gene의 추가로 cell cycle control 에 interfere 하고 apoptosis 를 prevent 한 상태이다. 특히 Ad5 의 존재는 high level 의 recombinant protein production , 그 중에서도 cmv promoter 을 지닌 plasmid vector 의 protein production 을 large quantities 로 가능하게 한다. HEK293 T Cell 는 추가로 SV40 large T antigen 을 가지기에 SV40 promotor 을 지닌 plasmid vector protein 의 reproduction , 즉 retroviral production 에 주로 사용된다. 또한 adherent , suspension condition 둘 다에서 culture 될 수 있고, 상대적으로 rapidly (34 to 36 hours) 하게 doubling 된다. HEK293 Cell line 은 transfection 에 highly amenable 하고, 다양한 chemical, physical 방식으로 transfection 가능하다. 주로 lipofectamine 과 같은 chemical protocol 이 사용된다. 이와 같은 특징들은 HEK293 Cell line 을 highly reproducibl residues 를 cleavage 하기에 cultured cell 간 detach 한다. EDTA ( disodium ethylenediaminetetraacetic acid ) 는 Ca2+ , Mg2+ 와 같은 divalent cation 을 chelate 하는 chelator 이며 Trypsin 의 작용을 enhance 하거나 cell 과 dish 의 adhesion 을 제거하는 역할을 한다. ⑥ Cell counting을 준비한다. ⑦ 손으로 dish 벽면을 살짝 치고 cell이 떨어지면 serum 이 들어있는 medium 을 4ml 첨가하여 trypsin 작용을 막는다. ⑧ Cell을 부드럽게 pipetting한 후 15ml tube로 옮긴다. ⑨ Cell 10ul와 trypan blue 10ul를 1.5ml tube에 넣고 pipetting 한다. ⑩ 10ul의 Cell-trypan blue 혼합물을 Hemocytometer에 loading 하고 현미경으로 세포수를 계산한다. ⑪ 60mm dish당 total volume 3ml에 배양액에 1 X 106개의 cell을 분주한다. ⑫ 37℃ CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한다. Ⅱ. Week 11 : Transfection Transfection 은 nucleic acids 을 mammalian cell 에 의도적으로 도입하여 세포의 형질을 변환시키는 process 이다. Nucleic acid 는 highly negatively charged 되어 있기에 negative charge 를 띄는 세포막에 들어가기 위해 다양한 방식들을 이용해 transfection 된다. Micro needles 를 이용한 micro-injection , 세포막에 electrical pulse 를 주어 temporary pore 을 형성하는 electroporation , viral vector 을 이용한 viral infection , lipofectin , polycations , dendrimers서 lysis buffer 은 cultured cell 을 lysis 하는 데에 사용된다. 이때 lysis 과정 중 protein 의 denaturation 을 최소화하는 것이 핵심이고, buffer 의 조성도 그와 연관이 돼있다. 위 buffer 에서NP-40 은 non-ionic detergent 로 사용되고, KCl 은 protein 을 soluble 하게 유지하고 buffer 의 ionic strength 를 증가시키는 역할을 한다. 이때 KCl 역시 PPI 에 영향을 미칠 수 있기에 low concentration 을 유지하도록 한다. EGTA 는 protease inhibitor 로, Ca2+ 를 제거해 lysis 과정 중 protein 이 degradation 을 방지한다. 그 외 HEPES 는 사용하는 biomolecules 특성에 맞춰 최적의 pH 를 유지하는 역할을 하고, glycerol 은 proteins 을 더욱 soluble 하게 하기 위한 cosolvent 로서 작용한다. IP buffer inhibitor : PMSF , PepstatinA , Leupeptin , Aprotinin , NaF , Na3VO4 Washing buffer inhibitor : PMSF (2), (3) 에 포함된 물질들도 buffer 사용 과정 중 PPI 의 손상을 막기 위한 protease inhibitor 등이다. ⅱ. Methods Transfection 시킨 dish의 배양액을 제거하고 PBS로 washing 한다. PBS 1 ml을 넣고 scraper로 세포를 긁어 수확한다. 1.5 ml tube에 옮겨 1000 rpm에 3분간 스핀다운 시킨다. 상층의 PBS를 제거하고 다운된 Cell pellet에 1% NP40 IP buffer 300ul를 천천히 넣고 Sonicator를 이용하여 cell을 lysis시켜준다. Lysis 시킨 시료를 13000 rpm에 20분간 스핀다운 시킨다. 상층의 단백질 시료 280ul, protein G bead (54, 5 조의 light , heavy chain blot result 의 marker 가 눈에 띄게 작다. Discussion ∙ A, B, C 세 분반 모두 V5-A antibody 를 positive control 로 사용하였고, 모든 조의 결과에 heavy 및 light chain 이 mark 되어있는 것을 통해 IP 과정 중 bead-V5-A complex 에 V5-A antibody 가 정상적으로 처리된 것을 확인할 수 있다. ∙ A, B 분반 모든 조들의 결과에서 V-5 protein 이 나타난 것을 보아 A, B 분반의 cell culture, V5-A plasmid, transfection 등을 포함한 bead-V5-A complex 생성 과정과 IP 과정 또한 정상적으로 이루어졌다고 추정할 수 있다. ∙ B 분반의 5조는 검출된 antibody 의 양에 비해 V-5 protein 검출양이 눈에 띄게 적다. 이는 5조가 사용한 IP buffer 조성에 오류가 있어 V-5 과 그 antibody 의 PPI 를 약화됐거나 protein degradation 이 원인일 수도 있겠고, 또는 IP 반응 중 상층액 제거 과정에서 bead 를 과하게 제거한 것이 원인이 될 수도 있다 추정한다. ∙ Western blot 에서 blot mark 의 크기는 검출양과 비례한다. A 분반 조들의 heavy, light chain, V-5 protein blotting result mark 의 크기가 B 분반 조들에 비해 전반적으로 크다는 점의 이유 첫째로, Con 의 western blot result 을 미루어 보아 A 분반에 더 많은 양의 antibody 를 처리한 것이라 분석할 수 있다. 둘째로, 만약 A, B 분반에 같은 양의 antibody 를 처리했고 western blot marker 크기 차이가 용인 가능한 무의미한 요소라면, A 분반의 조들이 사용한 lysis buffer 이 B 분반에 비해 실험에 더 적합해 A 분반의 PPI 가 더 잘 유지되었거다.

자연과학| 2025.06.24| 7페이지| 5,000원| 조회(67)

리포트, 생명과학실험, Immunoprecipitation

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