생명과학실험1SDS-PAGE &Coomassie blue StainingIntroductionSDS의 역할 및 원리SDS(sodium dodecyl sulfate)는 계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 한다. 아미노산의 소수성 부분과 hydrophobic interaction을 하며 결합하는데, 아미노산 2개당 1개 정도 binding하여 단백질을 변성한다.그림입니다.원본 그림의 이름: CLP00001dd80663.bmp원본 그림의 크기: 가로 859pixel, 세로 335pixelGel에 들어가는 시료의 역할① Tris-HCl:Stacking gel과 Resolving gel의 pH를 다르게 하여 각 gel에서 Glycine의 charge 다르게 조정해준다. 또한 Cl-를 첨가해주어서 이후 전기영동에서 전기를 걸어줄 때 중요한 역할을 하게끔 해준다.②SDS:아미노산 2개에 하나씩 결합해 비공유 결합을 저해시켜 단백질을 변성시키며, 모든 단백질에 (-) masking을 걸어 전극을 걸었을 때 단백질들이 (+)를 향해 이동할 수 있게 한다.③ APS:acrylamide의 교차연결을 촉매하며, 반응의 Initiator이다. 따라서 라디칼의 개시 물질이기 때문에 실험 사용시 만든다.④ TEMED:APS의 중간체를 안정화시키는 Catalyst이다. free radical을 형성하게 함으로써 gel의 형성을 촉매한다.Resolving, 있도록 한다. glycine 이온은 pl값이 6으로, pH가 6.8인 stacking gel에서 net charge가 0에 가깝다. mobility는 Cl이온, 단백질, glycine순서로 크다. 따라서 protein이 glycine과 Cl이온 사이에 갇혀있게끔 만든다. 이 과정을 통해 시료가 같은 위치에서 전기영동을 시작 할 수 있도록 한다.Resolving gel은 pH가 8.8이다. mobilitysms Cl이온 glycine, 단백질 순서로 크며 Cl이온과 gly사이에 있던 단백질들이 이동할 수 있게된다. 이 때 단백질의 이동은 자신의 분자량에 따라 영향을 받는다. (분자량이 크면 천천히 이동하고 분자량이 작으면 빠르게 이동한다. 따라서 resolving gel은 단백질이 고유의 size에 따라 이동할 수 있게끔 만드는 역할을 한다.Coomassie blue단백질의 염색색소이다. 단백질을 이루는 아미노산 잔기 중 일부와 공유결합을 하여 젤 내의 단백질 밴드를 푸른 색으로 염색한다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250은 폴리아크릴아미드 겔 등을 지지체로 한 각종, 전기영동후 단백질의 위치 검출에 사용하는데, 0.5μg이상 40μg까지인 단백질에는 정량적으로 작용한다. 단백질 밴드의 이동정도를 표준 분자량 마커와 비교하여 단백질의 분자량을 추산할 수 있다.Meterials1차시 SDS- Polyacrylamide gel 만들기DW, 40% Acrylamide-bisphosphate(A/B), 5M Tris-HCl(pH:8.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED, 유리판, 에탄올, pipet, 물기 흡수용 종이2차시 - SDS-PAGE & Coomassie blue Staining① Tris-HCl buffer (1.5 M, pH 8.8 and 1 M, pH 6.8)② 10% SDS (in water)③ Acrylamide and bis-acrylamide (30:0.8)④ TEMED⑤ 10% Ammonium persulfate (freshly p, 0.05% bromophenol blue, 10% SDS)⑦ Running buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 192 mM glycine, 0.1% SDS)⑧ Staining solution (0.1% w/v Coomassie Brilliant Blue R-250 in 45% v/v DW, 45% v/v methanol and 10% v/v acetic acid)⑨ Destaining solution (80% v/v DW, 10% v/v methanol and 10% v/v acetic acid)⑩ Gel casting stand, Glass plates (1 square and 1 notched), Spacers (2), Comb, Gel running box, Power supply, Pipettes, Heating blockMethod1차시 SDS- Polyacrylamide gel 만들기유리판 안쪽에 에탄올을 뿌리고 kimtech으로 깨끗이 닦는다깨끗하게 닦인 부분을 안쪽으로 가게 두 유리판을 겹치고, 유리판 holder(초록색)에 고정시킨다. 이 때 두 유리판과 holder의 바닥이 일치되게끔 하고, 물을 넣어 새는지 확인한다.caster바닥에 rubber mat를 깔고 유리판이 고정된 holder를 고정시킨다.다음과 같이 gel 용액을 만든다. stacking gel은 APS와 TEMED를 빼고 준비해놓는다.10% resolving gelstacking gelDW3.84 ml1.21ml40% A/B2ml0.25mlTris-HCl(1.5M, pH 8.8) 2ml(0.5M, pH 6.8) 0.5ml10% SDS80l20l10% APS160l40lTEMED4l2lResolving gel용액을 초록색 프레임 선까지 거품이 생기지 않도록 붓고, 그 위에 isopropyl alcohol을 0.5~1l overlay한다.20~30분 후 resolving gel이 굳으면 isopropyl alcohol을 버리고, 3차 증류수로 washin 키친타올에 물을 충분히 뭍혀 감싼 뒤, 지퍼백에 물과 같이 넣은 후 사용전까지 냉장보관한다. (일주일정도 보관가능)2차시 - SDS-PAGE & Coomassie blue Staining준비된 단백질 샘플을 섭씨 90도에서 5분간 가열한다. 짧게 원심분리한 후 vortex하며 섞는다.샘플과 표준분자량 마커를 각 well에 loading한다.전원을 방향에 맞게 연결하고 110V에서 1~2시간 혹은 loading buffer의 푸른색이 gel의 밑부분 근처에 올 때까지 전기영동한다.유리판을 조심스럽게 분리하여 gel을 꺼내어 적당한 크기의 접시에 staining solution을 잠길만큼 넣고 염색한다. (상온에서 1시간~overnight 정도의 시간이 필요)staining solution을 폐액통에 버리고 destaining solution을 2~3회 갈아주며 bond가 background와 뚜렷하게 구별될 때까지 destaining한다.gel의 사진을 찍어 스캔을 하거나, 셀로판지 사이에서 건조시켜 보관한다.Result그림입니다.원본 그림의 이름: CLP00000edc3e3d.bmp원본 그림의 크기: 가로 1440pixel, 세로 1920pixel그림입니다.원본 그림의 이름: image1.jpeg원본 그림의 크기: 가로 711pixel, 세로 435pixel사진 찍은 날짜: 2023년 04월 03일 오후 4:43프로그램 이름 : Adobe Photoshop 23.0 (Windows)Dokdo marker, gel 사진정제하고자 했던 단백질 AP의 band 위치 표시타원입니다.그림입니다.원본 그림의 이름: image1.jpeg원본 그림의 크기: 가로 711pixel, 세로 435pixel사진 찍은 날짜: 2023년 04월 03일 오후 4:43프로그램 이름 : Adobe Photoshop 23.0 (Windows)결과 관찰 내용단백질이 있는 부분은 coomasive blue에 의하여 파랗게 나타난다. 위의 사진에서 가장 진하게 나타는 부분은 주황색 동그라미로 표 가장 정제가 잘되어 AP의 순도가 가장 높았다.Discussion-정제 전보다 정제 후 AP의 순도(전체 단백질 밴드 중 AP band의 intensity 비율)는 높아졌는가? 그렇다면, 어떤 농도의 용액에서 가장 높아졌는가? 만약 정제 후 순도가 높아지지 않았다면 무엇이 문제일 수 있는가?정제 전의 PM band를 보면 많은 종류의 band가 있는 것을 알 수 있다. 정제한 다른 부분에는 특정 부분에 band가 많이 형성된 것을 볼 수있다. 이를 통해 특정 부분에 해당하는 단백질이 많이 남아 있다는 것을 알 수 있고 band가 나타나지 않은 부분에는 단백질이 많이 남아 있지 않다는 것 또한 알 수 있다. 따라서 정제 전보다 정제 후 AP의 순도가 높아졌다고 할 수 있다.만약 정제 후 순도가 높아지지 않았다면, 다음과 같은 이유를 셍각해 볼 수 있다.loading된 sample의 양이 너무 많거나 적을 경우 순도가 높아지지 않을 수 있다. 양이 너무 많다면 많은 단백질들이 발현되어 진하게 나타날 것이고, 양이 너무 작으면 애초에 정제하려는 단백질의 양도 적어서 흐리게 나타나서 정제된 것인지 알아보기 힘들 수 있다.sample이 다른 well로 넘어가서 시료끼리 섞이느 경우, 순도가 높아지지 않을 수 있다.이번 실험을 하면서, 처음에 gel을 만드는 부분에 있어서 시행착오가 많았다. 일단 gel이 잘 굳지 않아서 여러 번 만들었고, 이후엔 다시 만들어서 굳었으나 양이 부족하여 각 분획 사이의 벽이 높이 세워지지 않았다. 이렇게 되면 단백질 시료가 들어갈 수 있는 자리가 많이 없어서 시료를 적게 넣어야하고, loading중 시료가 섞일 수 있다.실제로 양이 모자라서 sample을 적게 넣었고, loading 중 well이 무너져 서로 섞이기도 하였다. 이런 과정을 겪음을 통해 다음과 같은 결과를 생각하게 되었다.- 정제 하고자 하는 단백질 외의 band가 존재하는 이유는?친화도 크로마토그래피로 분리하여 용출 된 sample를 loading하여 밴드를 관찰 하였을미한다.
..FILE:mimetypeapplication/hwp+zip..FILE:version.xml..FILE:Contents/header.xml^1.^2.^3)^4)(^5)(^6)^7^8^1.^2.^3)^4)(^5)(^6)^7^8^1.^2.^3)^4)(^5)(^6)^7^8..FILE:Chart/chart1.xml'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$J$4mean value'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$I$5:$I$11General10.80.60.40.20.10'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$J$5:$J$11General-4.0000000000000001E-30.226500000000000010.11450.417999999999999980.613999999999999990.683000000000000050.78249999999999997catalase(unit)OD(570nm)..FILE:BinData/ole9.ole..FILE:Chart/chart2.xml'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$K$4b-m'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$I$5:$I$11General10.80.60.40.20.10'[생명과학실험 현동훈 교수님.xlsx]Sheet1'!$K$5:$K$11General0.786499999999999980.555999999999999940.667999999999999930.364499999999999990.168499999999999989.9499999999999922E-20blank- mean vall그림absorbance 원리2) 형광(fluorescence)물질이 빛의 자극에 의하여 에너지 준위가 올라갔다가 다시 고유의 에너지 상태로 돌아가기 위해 빛을 발산하는 현상을 말한다. 형광은 그 자체로 빛을 발하는 것이 아니라, 광선이 비춰지면 그 광선을 고유한 빛의 광선으로 다시 방사하는데 이때 보여지는 빛을 형광이라 한다.그림입니다.원본 그림의 이름: mem000025ac0004.png원본 그림의 크기: 가로 480pixel, 세로 327pixel그림fluorescence 원리3) 발광 (luminescence)발광은 열에 의하지 않은 물질로부터의 모든 빛의 방출이다. 두 전자 상태 사이의 복사 전이에 기인하는데, 높은 에너지의 전자상태로 들뜬 물질이 에너지가 더 낮은 (보통은 바닥 상태) 상태로 내려오며 에너지가 빛으로 방출되는 현상이다. 이때 높은 에너지를 가지는 방법은 빛, 열, 전기 등의 매우 다양한 방법이 있다. 자연에서 반딧불이가 빛을 띄는 원리도 이 발광이다. 이러한 생물발광에는 luciferase라는 효소의 도움을 받아 화학 반응이 일어난다.발광과 형광 모두 에너지의 차에 의해 빛이 나온다는 점에서 유사하지만, 형광은 외부적 자극으로 인해 에너지가 높아진 것이고 발광은 외부 자극 없이 스스로 에너지를 높인, 즉 어떤 물질 자체가 빛을 발하는 경우 방출된 것이라는 점에서 차이가 있다.4. 표준 검정 곡선법 (standard calibration curve methods)표준 검정 곡선법이란 표준용액을 만들어 흡광도를 측정하여 검정 곡선을 만든 후 미지시료의 흡광도를 읽어 검정곡선에서 해당하는 농도를 결정하는 방식이다. 예를 들어, 우리가 농도를 아는 효소를 넣고 반응을 시켜서 흡광도를 측정하여 그를 그래프로 나타낸다. 이렇게 만들어진 그래프의 추세선을 얻어 함수를 얻어내고 이 함수에 농도를 모르는 미지 시료의 흡광도를 넣은 뒤 농도가 얼마였는지 예측한다. 일반적으로 반응은 선형으로 나타낸다.그리고 검정곡선에 대한 solution을 만들 때 여개에 1unit부터 0.1unit까지{1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1} labeling하고 1000U/mL catalase를 농도별로 희석한다. 1000U/mL catalse 75μL와 D.W. 425μL를 섞어 150U/mL 500μL를 만든다. 희석하는 비율은 다음 표와 같다.표unit별 catalase + D.W. 양unitμLcatalaseD.W남는 양1catalse 75μL425μL180μL0.81Unit 320μL80μL225μL0.60.8Unit 75μL25μL100μL0.40.8Unit 100μL100μL100μL0.20.4Unit 100μL100μL100μL0.10.2Unit 100μL100μL200μL이 때, DW를 먼저 넣고 catalase를 넣는다. 또한 catalase를 넣은 다음 pipetting으로 섞어준다. 또한, catalase를 넣고 난 후 keep on ice한다.4. 1.5mL microtube 9개에 labeling을 해준다. { 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1, 0, S1, S2 }각 microtube에 2번에서 만든 H2O2 160μL, 0.01M PPB 200μL, 3번에서 만든 catalase를 각 labeling한 튜브에 40μL씩 넣고 상온에서 5분간 반응시킨다. (이때 catalase를 가장 마지막에 넣는다.)5. 5분 후 4번에서 만든 각 microtube에 1번에서 만든 D/A 800μL씩 넣는다.6. tube를 닫고 37도 water bath에서 10분간 반응시킨다.7. 10분 후 water bath에서 꺼낸 뒤, microtube의 뚜껑을 열고 상온에서 5분간 cooling한다.그림입니다.원본 그림의 이름: mem00002e8c4f07.png원본 그림의 크기: 가로 453pixel, 세로 303pixel사각형입니다.사각형입니다.그림입니다.원본 그림의 이름: CLP00002e8c4f0d.bmp원본 그림의 크기: 가로 4032pixel, 세로 2268pixel그림상단 3줄 .8unit애 1unit용액을 넣었다면, 예상한 catalase양보다 많거나 적게 들어갈 수 있다. 이 논리에 따르면 1유닛에서 catalase를 적게 따와 0.8유닛을 만든 것이고 이 0.8 유닛에서는 또 catalase가 많은 부분을 따서 0.6유닛을 만들었어야 이러한 결과가 나왔다고 볼 수 있다.허나 필자가 생각하기에는 우연히 0.8을 만들 때는 1유닛에서 catalase가 적은 부분을 땄는데 그 적은 와중에서도 catalse가 뭉쳐있는 부분을 또 따서 0.6을 만들었다는 우연성이 생길 확률이 그리 크지 않다고 생각한다. 또한 0.8유닛은 이미 catalase가 적은 상황인데 그 이후 0.6에서는 0.8보다 많다는 결과에 따라 단순 pipeting의 실수라고 보기엔 어렵다.만약 0.8의 값만 작거나, 0.8 이후의 값이 모두 가파르게 작다면 pipeting 과정에서 오류가 있었다고 볼 수 있지만 그림 5의 결과는 이렇다고 보기 어렵다.3) 표5 를 보았을 때, 0.8 유닛에 catalase가 적게 반응하고 (흡광이 덜 되었으므로), 0.6유닛에는 많이 반응한 것을 알 수 있다. 이를 통해서 실험 과정 중 효소의 활성을 방해한 점은 무엇이 있을지 생각해보았다. catalase는 효소이고 단백질이기에 열과 ph에 따라서 변성된다, pipeting을 하는 과정중 catalase tube를 손으로 잡아 그 열로 인해 heating되어 0.8 unit안에 있는 catalase가 변성되어 많이 반응하지 못했을 수 있다.그렇다면 손의 온도로 catalase 변성이 크게 일어나는지 알아야 하는데, 옥수수를 이용한 catalase 활성 온도에 대해 연구한 논문을 참고하면 섭씨 55도에서 완전히 변형이 일어난다고 나온다. 그림 15를 참고하면 catalase가 37도 근처에서 가장 activate한 것을 알 수 있다. 또한 그림 14를 참고하면 체온 근처의 약 섭씨 40도에서는 오히려 activity가 증가하므로 손의 온도로 과연 변성이 일어나 catalase가 반응을 적750μL를 섞어 총 1000μL를 만든 뒤 그 중 800μL를 사용하도록 하였다. H2O2 : PPB : catalase = 4: 5: 1 이 되도록 400μL안에서 나누면 각각 160μL, 200μL, 40μL 가 된다.Calculate the volume of H2O2 for loading 8μmoles of H2O2 in each well위의 계산에서 희석된 H2O2가 160μL 필요하다는 사실을 알게 된다. 이로부터 8.8M H2O2를 얼마나 어떻게 희석할지 보아야 한다. 일단 주어진 조건에서 각 well에 8μmoles이 있어야하고, 이 실험을 총 6번 반복한다고 가정하였으니 총 48μmoles이 필요하다. 48μmoles/160μL= 0.3M이므로 희석된 H2O2용액의 몰농도는 0.3M이다. 또한 각 9개의 tube에 160μL씩 들어가야 하므로 160μL× 9 = 1440μL, 최소 1440μL이 필요하다. 8.8M H2O2에서 따와야 하는 양을 x라고 놓으면 8.8 M × x μL = 0.3M × 1440 μL 으로 두는 것이 정확한 값을 얻을 수 있으나, 계산의 용이성 등을 고려하여 1440이상의 수 중 22의 배수인 2200으로 상정하고 계산하도록 한다. 그렇게 식을 다시 세우면 다음과 같다.8.8 M × x μL = 0.3M × 2.2 mLx = 75μL따라서 8.8M H2O2는 75μL 필요하다.Calculate the volume of Catalase and D.W. for making standardcatalase+ D.W.한 용액이 최소 40μL씩은 필요하다. 따라서 40μL이상이고, 1unit으로부터 희석할 수 있게끔 했을 때 계산을 하면 다음과 표1과 같고 그림으로 나타내면 그림17과 같다.그림입니다.원본 그림의 이름: mem000025ac0005.tmp원본 그림의 크기: 가로 1029pixel, 세로 394pixel그림이해를 돕기 위한 희석 모식도.우리 실험에서는 1유닛으로 0.8, 0.6유닛을 만들었다는 점에서 그림과 다르다
생명과학실험1 SDS-PAGE & Coomassie blue Staining
