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[예방약학실험11] Ames test

1. Experimental purpose: Ames test를 통해 compound K의 유전독성을 시험한다.2. MaterialA. Kit: Muta-ChromoPlate™ Kits (Growth media, 96 well plate, Ziploc bag, etc)B. Apparatus: lyophilized vial, incubator, pipet, tip, 1.5ml tube, tube rack, latex gloveC. Reagenti. Strain: Salmonella (TA 100)ii. Control: NaN₃ (sodium azide)iii. Reaction mix: Davis-Mingoli Salt, D-glucose, Bromocresol purple, D-biotin, Lhistidine (극소량)

의/약학| 2023.06.21| 3페이지| 2,000원| 조회(157)

독성학, 암, ames test, 예방의학, 예방약학, 유전독성

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[예방약학실험10] Migration and invasion assay

1. Experimental purpose: 암 전이가 진행됨에 따른 암세포의 변화를 관찰하기 위해 transwell을 이용하여 migration 및 invasion assay를 수행한다.2. MaterialA. Apparatus: SPLinsert hanging well (24 well size), ice bucket, pipet, tip, incubator, 1.5ml tube, conical tube, tube rack, marker pen, pincet, latex glove, napkin, stopwatch, cotton swab, microscope B. Reagent: PLC-PRF-5 cell, Matrigel stock (9mg/ml), chemical, FBS media (1%, 10%), PBS wash buffer, 4% formaldehyde, 0.5% crystal violet

의/약학| 2023.06.21| 3페이지| 2,000원| 조회(336)

독성학, 항암, 암, 예방의학, migration, 예방약학, invasion, Tr..

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[예방약학실험9] NO assay 평가A+최고예요

1. Experimental purpose: LPS, RAW264.7와 NO 생성의 연관성, Griess reagent 실험 원리를 이해하고 NO assay를 수행하여 extract A의 항염효과를 밝힌다. 2. MaterialA. Reagent: RAW 264.7, LPS, extract A, serum-free media, 1mM NaNO₂, Griess reagentB. Apparatus: pipette, tip, EP tube, 96 well plate, microplate reader, aluminum foil3. MethodA. Cell seeding: Non treated, LPS only treated, LPS + extract A treated cell을 준비한다.

의/약학| 2023.06.21| 3페이지| 2,000원| 조회(526)

독성학, 예방의학, 예방약학, 항염증, RAW264.7, NO assay, Grie..

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[예방약학실험8] Luciferase assay

1. Experimental purpose: Luciferase assay를 통해 염증 반응 조절에 중요한 역할을 하는 유전자 발현 조절에 대해 이해한다. 2. Material A. Reagents: HEK293 cell, 5X cell lysis buffer (-20°C), luciferin (-80°C), luciferase reporter plasmid (NF-κB promoter luciferase reporter), GFP expression plasmid, serum free media, linear polyethylenimine (PEI), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 10nM), extract A, DW

의/약학| 2023.06.21| 3페이지| 2,000원| 조회(324)

독성학, 예방의학, 예방약학, luciferase, 항염증

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[예방약학실험4] Anatomizing mouse

Pre-reportDES가 female reproductive system에 어떠한 영향을 미치며, 이러한 영향이 발생하는 분자기전은 무엇인가?DES를 복용한 임산부에서 태어난 2세대 자손은 in utero 노출을 통해서 생식독성이 나타나는 것으로 알려졌다. 특히 여아의 경우 질선암, 자궁경부암 등 adenocarcinoma의 발생 증가, 자궁경부, 자궁, 나팔관 등의 기형, 불임, 조기폐경 등이 나타났다.DES의 독성 기전은 estrogen receptor α와 β에 대한 결합 친화성이 estradiol보다 더 높은 강력한 estrogen agonist으로 내분비 교란을 유도하는 것이다. 그 결과 여성 생식기관, 유선, 시상하부, pituitary hormone binding globulin(SHBG)과 혈장 단백질 합성이 증가되고, 시상하부에서의 follicle-stimulating hormone(FSH) release를 억제한다. DES은 progestin과 함께 시상하부-뇌하수체 system을 억제하여 gonadotropin-releasing hormone(GnRH)의 분비를 억제한다. 또한, 세포사멸 기전에 영향을 주어 발암성을 나타낸다. 예를 들어 p63 발현을 억제하여 샘선의 발달을 촉진해 샘암종을 유발한다. Birc1 family의 발현을 유도하여 자궁 상피세포의 세포사멸을 억제하고 type I endometrial cancer 위험을 높인다. Msx2와 같이 상피세포 분열에 관여하는 인자의 발현을 비정상적으로 유도 또는 억제하고 자궁암을 유도한다. 정자나 난자를 손상시켜 불임을 유발하기도 한다.한편 DES는 지용성이 높아 태반을 쉽게 통과하여 태아의 발달에 영향을 줄 수 있고, 체내 잘 축적되는 특징이 있어 오랜 기간 잔류하여 자손까지 생식기능 장애가 발생하여 다세대 독성이 이어진다.ReferenceMa, L. (2009). Endocrine disruptors in female reproductive tract development and carcinogenesis. Trends in Endocrinology & Metabolism, 20(7), 357-363.Title: Anatomizing the mouse and observing the organs of the mouseDate: 실험한 날짜 2023.04.05, 제출 날짜 2023.04.06Name: 학과 학번 이름Purpose: DES가 female mouse의 reproductive organs에 어떤 변화를 주는지 관찰한다.Materials: 해부용 가위, 메스, 핀셋 등 해부용 도구, 장갑, 고정용 주사침, 호일, 저울, 페트리접시, PBS, 70% 에탄올, 킴테크 휴지, 3M paperMethods1. 경추탈골법으로 mouse를 sacrifice시키고 복부가 위로 향하게 하여 주사침으로 고정한다.2. 복부에 에탄올을 분무해 털이 날리지 않도록 한다.3. 배꼽 부분을 핀셋으로 들어 가위로 구멍을 뚫고 직선으로 잘라준다.4. 피부를 사방으로 자르고 피부 밑 피막을 조심스럽게 장기가 상하지 않도록 자른 후 갈비뼈도 자른다.5. Organ(심장, 간, 콩팥, 비장, 위, 자궁, 난소)를 적출하고 지방을 trimming 한 뒤 마르지 않도록 PBS에 담근다.6. 저울에 각각의 장기의 물기 및 피를 제거하여 무게를 측정하고 작은 3M paper에 적은 뒤에 사진 찍는다.7. 장기 및 마우스 시체, 주사침, 케이지 안의 깔짚을 분리하여 정리한다. 알루미늄 호일을 벗기고 피 묻은 것들은 70% 알코올로 소독한다.그림1. treat 장기 무게그림2. control 장기 무게Results심장간콩팥(2개)비장위자궁난소control0.12861.72260.36010.10770.21860.14140.0189treat0.1791.9290.4240.1400.5960.1510.032표1. control과 treat 장기 무게 (단위: g) 단, 난소는 control 1개, treat 2개 기준Discussion일주일간 DES를 주입한 실험군 mouse와 corn oil을 주입한 대조군 mouse의 체중을 측정한 뒤 장기를 적출하여 무게를 비교하였다.해부용 핀셋 중 끝이 뾰족한 것을 사용할 때에는 특히 복막을 제거하는 과정에서 장기 훼손에 주의해야 했다. 간은 3개엽으로 나눠져 있어 한 번에 적출하기 어려웠다. 완전한 모양으로 적출하는 게 아니라 무게를 재는 것이 목적이므로 모양이 다소 훼손되더라도 모든 간을 적출하는 것에 초점을 두었다. 자궁 양끝에 위치한 난소는 지방조직과 색 구분이 어려우므로 trimming 시 주의했다.저번주에 진행한 mouse 체중 측정 실험과 이번주에 진행한 organ 무게 측정 실험 결과, 난소를 제외하고 mouse 체중 및 장기 무게는 treat군이 control군보다 더 무겁게 측정되었다. 난소는 control 군에서 1개만 적출에 성공했는데, 찾지 못한 나머지 난소 1개도 무게가 동일하다고 가정하면, 난소는 control군이 treat군보다 무겁다.DES는 estrogen receptor에 강하게 결합하는 estrogen agonist이다. Estrogen receptor 중 α form은 자궁 등 생식기관에 주로 발현하는 반면 β form은 심혈관계, 소화기계, 면역계, 폐, 신장 등 다양한 조직에서 발현된다. 종양 유발은 estrogen receptor α의 증가와 estrogen receptor β의 감소와 연관이 있다고 알려져 있다. DES 처리 시 estrogen receptor α를 주로 발현하는 난소와 자궁에선 세포증식이 유발되어 무게가 무거울 것이고, estrogen receptor β가 주로 발현되는 다른 장기에서는 세포증식이 억제되어 무게가 가벼울 것으로 추론되는 것이다. 즉, 이론상으로는 DES 영향으로 treat군에서 난소, 자궁은 무겁게, 심장, 신장, 위, 간, 비장은 가벼울 것으로 예측된다. 그러나 실제 실험결과는 자궁만 이론에 부합하고 나머지 장기는 이론과 상반된다. 오차 원인을 생각해보면, 각 장기별 estrogen receptor 발현량 차이로 DES 독성 정도도 다르게 나타날 것이며, 두 mouse 개체 간 차이, trimming과 물기 및 피 제거 정도와 같은 실험 과정상의 차이로 인한 것으로 보인다. 실험결과를 개선하기 위해서 mouse의 estrogen receptor 발현량 정보를 사전에 수집하고, 실험대상 mouse 세트를 늘리고, 보다 완벽한 trimming, 식이환경 등의 변수 통제가 필요하다.

의/약학| 2023.06.21| 3페이지| 2,000원| 조회(135)

독성학, des, 해부, 마우스, 예방의학, 예방약학, 생식독성

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