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[2016 ~ 2020] 충북대학교 생명과학부 생화학과 졸업
[2023 ~ ]University of Veterinary Medicine Budapest 재학

전문분야 자연과학

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충북대 일반생물학실험_7_생식세포분열의 관찰

[별첨] 실험보고서 표지실험보고서Experiment Report교과목명일반생물학의 이해 및 실험실험제목생식세포분열의 관찰제출월일2016년5월6일담당교수제 출 자성명:학과:생명과학부학년:1학번:충북대학교 생물학과Department of Biology, Chungbuk National UniversityⅠ. 실험 목적(Purpose of experiment)양파 근단을 이용하여 생식세포분열을 관찰하고, 세포분열의 중요성을 이해한다.Ⅱ. 배경지식(Background knowledge)1. 생식세포분열의 의의생식세포분열그림 1. 생식세포분열.1-1. 생식세포분열1. 대부분의 다세포성 동식물의 생식세포에서 발견되는 특이한 세포분열 양식2. 분열 직전의 생식세포(meiocyte, 2n)는 2회의 연속적인 핵분열 및 세포질 분열을 거쳐 핵상이 n인 배우자(gamete)를 만들며, 암·수배우자는 수정에 의해 핵상이 2n인 새로운 접합자(zygote)를 형성한 후, 접합자의 연속적인 분열에 의해 포자체(sporophyte)를 만든다.3. 유성생식은 세대교번 과정에 생식세포분열 과정이 내재되어 있는 생식 전략이다.1-2. 생식세포분열의 생물학적 중요성1. 생식세포가 생식세포분열에 의해 핵상이 n인 배우자를 만들지 못한다면, 접합자는 매번의 수정마다 핵상이 4n, 8n, 16n 등으로 배가 되는 포자체를 만들어 사멸케 되며, 결국 종족보전에 실패한다.2. 제1 생식세포분열 전기에 각 염색체 당 평균 2-3회의 교차에 의한 유전자재조합(genetic recombination)을 통하여 유전적 다양성이 극대화된 배우자를 만들게 된다.3. 제1분열 중기의 적도판 배열 조합은 2n, 따라서 인간은 1회 감수분열시 부계와 모계에서 각각2 ^{23}=8,388,608가지의 배우자 조합이 가능하다.4. 각기 다른 유전자조합을 갖는 암·수배우자는 또한 무작위적으로 만나 부모와는 유전적으로 상이한 접합자가 된다.5. 접합자의 발생과정에서, 동일한 유전자를 보유한 자손이라 하더라도, 재조합의 결과 또는 환경의 영향으로 인한 유전자 발현 과정 및 그 결과는 자손마다 차이가 나며, 각 자손은 환경에 적응된 이질적인 표현형을 갖는 성체로 발달하게 된다.6. 결국 생식세포분열은 유성생식을 통하여 종족의 보존을 가능케하고, 유전적으로 다양한 자손을 생산토록하여, 생물종 전체의 유전자풀(gene pool)이 다양한 환경 선택압(selection pressure)에 탄력적으로 대처할 수 있도록 유도한다.2. 생식세포분열 과정전기Ⅰ세사기leptonema(1) 염색분체가 가늘게 1줄로 보임(2) 염주알 같은 염색소립이 불규칙한 간격으로 배열; 크기, 수, 위치에 따라 염색체를 특정화하기 때문에 특이 염색체 동정의 기준접합기zygonema(1) 염색체가 1열로 늘어서서 접합(pairing, synapsis)(2) 상동염색체 간 간격은 0.15-0.2μm태사기pachynema(1) 염색체는 완전히 쌍을 이룸(2) 세로로 수축하여 짧고 두꺼워짐(3) 염색체는 4분염색체(tetrad chromosome)로서 수가 반감되나 핵상은 2n(4) 세사기, 접합기는 단 몇 시간이 소요되나, 태사기는 며칠, 몇 주, 몇 년이 지속되기도 한다.복사기diplonema(1) 이중기, 겹섬유기(2) 밀접하게 쌍을 이룬 염색체가 서로 밀어내기(asynapsis)(3) 인접한 염색분체는 염색체 당 1곳 이상 chiasma 형성(4) 교차(crossing over)가 일어나서 분절 교환이동기diakinesis(1) 염색체 수축이 더욱 뚜렷해지고, 핵 안에서 고르게 분산(2) 핵막과 인이 사라짐(3) chiasma가 말단부로 이동(말단화, terminalization); 상동염색체 말단이 서로 붙음전중기Ⅰ(1) 염색체의 응축이 최고(2) 방추체 미세소관은 동원체에 부착(3) Chr. congression(집합), c. orientation(정위치), ch. distribution(분포)중기Ⅰ(1) 염색체의 적도판 배열(2) 염색체의 분리후기Ⅰ상동염색체는 2개의 염색분체 단위로 양극으로 이동말기Ⅰ(1) 양극 도달(2) 응축된 상태를 유지중간기(1) 유사분열 간기와 유사한 짧은 기간(2) 염색체의 복제는 없음(3) 첫 번의 분열 결과로 동물의 웅성은 정모세포Ⅱ로, 자성은 난모세포Ⅱ(Oocyte Ⅱ)와 제 1극체(polar body)를 만듬전기Ⅱ(1) 전기Ⅰ과 달리 매우 짧은 기간(2) 방추사 형성중기Ⅱ(1) 염색체의 적도판 배열(2)각 자매염색분체(sister chromatid)는 분열후기Ⅱ2개의 염색분체는 각각 반대극으로 이동말기Ⅱ각 염색분체는 핵상이 n인 생식세포로 분화Ⅲ. 가설 설정(Setting up hypothesis)꽃봉오리를 현미경으로 관찰하면 생식세포의 분열과정의 각 주기를 관찰 할 수 있을 것이다.Ⅳ. 실험(Experiment)1. 실험 재료(Materials)1-1. 생식세포분열 관찰[1. 꽃봉오리의 생식세포분열 관찰, 2. 영구프레파라트 관찰]▶광학현미경▶슬라이드글라스▶커버글라스▶해부현미경▶스포이드▶핀셋▶페트리접시▶여과지▶비이커▶해부침▶아이스박스▶면도칼▶증류수▶에탄올▶Newcomer’s fixative▶영구프레파라트▶Aceto-carmine2. 실험방법(Methods)2-1. 꽃봉오리의 생식세포분열 관찰생식세포분열(meiosis) 과정의 염색체 관찰에서는 꽃봉오리의 고정 시기가 매우 중요하다. 왜냐하면 식물에서 꽃봉오리가 성숙하여 개화에 이르는 시기가 매우 짧기 때문에 고정 시기가 이르면 생식세포분열 전 단계의 세포만 관찰되며, 시기가 늦으면 화분세포 (pollen)만 관찰되기 때문이다.1. 재료 절취오전 10-12시에 개화 전의 꽃봉오리에서 꽃밥(anther) 일부 또는 전체를 절취하여 Newcomer’s fixative에 담가 냉장고에 보관하면서 재료로 사용한다.2. 처리꽃봉오리를 페트리접시의 70% 에탄올에 담가 해부현미경 하에서 화분낭을 꺼낸다.3. 염색화분낭을 슬라이드글라스에 놓고, 전기 Ⅰ 상태의 화분모세포(pollen mother cell)를 꺼낸 후 Aceto-carmine을 두 방울 떨어뜨려 5분간 염색힌다.4. 압착압착액(45% acetic acid : glycerin = 1:1)을 한 방울 떨어뜨린다(세포 분산에 효과적).해부침을 이용하여 조직 및 세포를 최대한 잘게 찢는다.커버글라스를 덮고 조직을 펴준다(프레파라트 위에 여과지를 덮고 해부침 뒷부분으로 톡톡 쳐서 펴줌).여과지를 덮고 커버글라스가 깨지지 않게 주의하면서 엄지손가락으로 눌러준다.5. 관찰현미경으로 세포분열의 각 주기를 찾아 관찰한다.2-2. 영구프레파라트 관찰1. 영구 프레파라트를 광학현미경에 고정하고 조별로 이동하면서 저배율( × 100)에서 고배율( × 400)로 관찰한다(영구프레파라트와 광학현미경은 이동시키지 않는다).2. 관찰한 결과를 스케치 한다.A: 4(감수분열), 5(민들레 수술 세포분열)Ⅴ. 결과(Results)1. 꽃봉오리의 생식세포분열 관찰꽃봉오리의 생식세포분열 관찰그림 2. 전기Ⅰ 중 세사기 관찰결과.꽃봉오리의 생식세포분열 관찰그림 3. 전기Ⅰ 중 접합기 관찰결과.꽃봉오리의 생식세포분열 관찰그림 4. 중간기 관찰결과.꽃봉오리의 생식세포분열 관찰그림 5. 세포질분열 관찰결과.위에서부터 차례로 세사기, 접합기, 중간기, 세포질분열의 관찰결과이다. 생식세포분열의 주기는 매우 세분화되어있지만 실제 실험에서는 모든 과정을 뚜렷하게 관찰하기는 어려웠다. 우리 조는 세 번의 실험을 반복했지만 이 네 주기를 제외한 다른 주기는 관찰 할 수 없었다.2. 영구프레파라트 관찰영구프레파라트 관찰그림 6. 감수분열 그림 7. 민들레 수술 세포분열Ⅵ. 고찰(Discussion)1. 생식세포분열 관찰과정꽃봉오리의 생식세포분열을 관찰하였다. 감수분열이 일어나는 장소는 생식기관인데, 동물에서는 정소와 난소에서, 식물은 꽃밥과 밑씨에서 각각 생식세포인 난자나 정자, 화분과 난세포가 생성된다. 꽃봉오리에서 채취한 생식세포를 프레파라트로 만들기까지의 과정은 다음과 같다. 우선 어린 꽃봉오리를 준비한다. 꽃이 핀 경우에는 이미 감수분열이 끝나 꽃가루가 형성된 후이기 때문에 실험에 쓰기엔 적절하지 않다. 그 다음에는 꽃봉오리에서 꽃밥을 절취한다. 오전 10~12시가 가장 적당한데, 세포분열이 가장 활발하고, 왕성하게 일어나는 시간 때이기 때문이다. 다음은 에탄올에 꽃밥을 담근다. 세포분열을 하던 상태 그대로 멈추게 하여 관찰을 쉽게 하기 위함이다. 그 다음 꺼낸 화분낭을 아세트산카민 용액으로 염색을 하는데, 이 용액은 핵을 붉게 염색시켜 뚜렷하게 관찰할 수 있도록 한다. 여기서 화분낭이란 종자식물의 꽃밥을 만들고 있는 낭으로 꽃가루주머니라고도 한다. 소포자낭에 해당하며, 4개의 소포자낭의 집합인 것이 보통이다. 화분낭내 화분모세포의 감수분열에 의하여 화분이 생기며, 이 화분은 화분낭이 깨뜨려져 나오게 된다. 그 다음엔 조직 및 세포를 잘게 찢어 세포 분산을 위해 압착액을 떨어뜨린다. 여과지를 덮고 커버글라스 위를 조심히 꾹꾹 눌러주는데, 세포를 한 층으로 얇게 펴서 겹쳐보이지 않게 하려는 것이다. 이 과정들이 다 끝나면 현미경으로 배율을 조정하여 관찰하면 된다.

자연과학| 2024.07.18| 10페이지| 2,500원| 조회(157)

실험보고서, 일반생물학, 충북대, 충북대학교, 일반생물학실험, 생물학실험보고서

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충북대 일반생물학실험_3_탄수화물의 검출 및 소화효소

[별첨] 실험보고서 표지실험보고서Experiment Report교과목명일반생물학의 이해 및 실험실험제목탄수화물의 검출 및 소화효소제출월일2016년3월25일담당교수제 출 자성명:학과:생명과학부학년:1학번:충북대학교 생물학과Department of Biology, Chungbuk National UniversityⅠ. 실험 목적(Purpose of experiment)화학적 반응실험을 통해서 탄수화물을 검정하고, 전분 가수분해 효소인 아밀라아제(amylase)를 이용하여 pH 및 온도에 따른 효소 활성의 변화를 조사한다.Ⅱ. 배경지식(Background knowledge)1. 탄수화물1-1. 탄수화물(carbohydrate)탄수화물은 탄소, 수소 및 산소가 결합된 유기 화합물이다.구 성 원 소C : H : O = 1 : 2 : 1구 조 식Cm(H₂O)n1-2. 탄수화물의 생체 내 기능1. 구조다당류생물체의 구성성분으로 구조를 유지하는 다당류를 구조다당류라고 한다.식물의 세포벽을 만드는 섬유소(cellulose), 곤충의 외피를 만드는 키틴(chitin), 동물의 연골이나 힘줄의 성분인 황산콘드로이틴류(chondroitin sulfate) 등이 포함된다.2. 영양다당류활동의 에너지원으로 생물체 내에 저장된 다당류를 영양다당류라고 한다.식물은 탄소동화작용을 함으로써 이산화탄소와 물로 포도당(glucose)을 합성한 후 녹말 형태로 저장하고, 동물은 다른 생물에서 섭취하여 글리코겐(glycogen) 형태로 간에 저장한다.1-3. 탄수화물의 종류탄수화물을 구성하는 단위당의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분한다.1. 단당류(monosacharide)가수분해에 의해 더 이상 간단한 분자가 될 수 없는 상태의 당질. 단당의 탄소수가 3, 4, 5, 6, 7,…인 것을 각각 트리오스, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스,…라고 한다. 탄소수가 3개 이상인 것은 비대칭탄소원자가 있어 이성체가 존재한다.유도체로서는 데옥시당, 아미노당, 메틸화당, 우론산 등이 있고, 한 분자가 빠져나오는데 이것을 축합(縮合)이라 한다.1. 맥아당(Maltose): 포도당(glucose) + 포도당(glucose)2. 설탕(Sucrose): 포도당 + 과당(fructose)3. 젖당(Lactose): 포도당 + 갈락토오스(galactose)3. 다당류(Polysaccharide)넓은 의미로 가수 분해에 의해 1분자에서 2분자 이상의 단당류가 생기는 탄수화물을 말한다. 다시 말해서 단당류 2분자 이상이 글리코시드 결합에 의해 탈수 축합해서 생기는 탄수화물, 즉 글리칸 전부를 가리키지만 최근에는 좁은 의미로 사용하는 경우가 많다. 좁은 의미로는 넓은 의미의 다당류 중 몇 개까지의 단당류로 이루어진 것을 소당류라고 하여 구별하고, 그 이상의 중합도의 것을 다당류라 한다. 소당류와의 경계는 명확하지 않지만, 다당류는 대부분이 소당류에 비해 분자량이 매우 크고 수만에서 수천만에 이르며, 고분자 물질에 속한다. 또 분자량은 균일하지 않고 다수의 중합 동족체의 혼합물인 것이 많다. 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐 등이 대표적인 것이다.(화, 2011)수없이 많은(일반적으로 n=12이상) 단당류가 글리코시드 결합(glycoside bond)을 이룬 것이며, 가수분해에 의해서 이당류 또는 단당류를 생성한다. 한 종류의 단당류로 구성되는 것을 단순다당류라 하고, 여러 종류의 단당류로 구성되는 것을 복합다당류라고 한다.1. 녹말(starch): 식물성 저장성분2. 글리코겐(glycogen): 동물성 저장성분3. 섬유소(cellulose): 세포벽 구성 성분4. 덱스트린(dextrine)1-4. 글리코시드 결합(Glycoside bond)글리코시드결합은 탄수화물 반응 중에서 가장 중요한 반응으로써 두 개의 단당류가 한쪽 단당류의 히드록시기와 다른 한쪽 단당류의 히드록시기에서 물 분자가 빠져나가는 탈수축합반응을 말하며, 이때 산소를 매개로 한 다리가 만들어져 단당류들 사이의 결합이 이루어진다.글리코시드 결합(Glycoside bond)그림 1. 글리코시드 결합.2.특성1. 온도에 따른 활성화 정도효소는 특정 온도 범위 내에서 활성이 가장 크게 나타나며, 대개 35~45℃에서 활성이 가장 크다. 이것은 온도가 올라가면 화학반응 속도가 일반적으로 커짐에 따라 효소의 촉매작용도 커지지만, 온도가 일정범위를 넘으면 화학반응 속도는 커져도 단백질의 분자구조가 변형을 일으켜 촉매기능이 떨어지기 때문이다.2. pH에 따른 활성화 정도효소의 활성은 단백질을 구성하고 있는 아미노산 곁사슬의 해리성군(COO-와 NH3+)에 따라 결정된다. pH는 효소 해리기의 상태를 변화 시켜, 특정 pH 수치에서 효소의 최대 활성을 보이게 하며, 기질에 해리성군이 있으면 이것도 같은 방식으로 효소 작용에 영향을 미친다. 대부분의 세포내 효소는 pH5~9 범위에서 최대 활성을 나타내지만, 예외적으로 단백질 소화효소인 펩신의 경우는 pH1~2에서 최대 활성을 나타낸다.효소의 특성그림 3. 효소와 온도.그림 4. 효소와 pH.3. 기질특이성(substrate specificity)효소는 대부분 그 작용을 받는 특정 기질에 대해서만 강한 촉매반응을 나타내는데 그 성질을 말한다. 효소들은 각기 다른 형태의 활성 자리(active site)를 가지고 있다. 그러므로 효소는 자신의 활성 자리에 알맞게 결합하는 특정한 기질하고만 상호 작용할 수 있다. 따라서 효소의 활성 자리의 입체 구조가 기질의 입체 구조와 맞물릴 수 있는 형태일 때에만 결합이 이루어지는 것이다.보통 이러한 현상을 설명하기 위하여 열쇠-자물쇠 모형을 예로 드는데, 이것은 에밀 피셔에 의해 1894년에 제안된 것이다. 이런 모형을 예로 드는 이유는 효소의 기질 특이성은 자물쇠의 구멍에 맞는 모양을 가진 열쇠만 자물쇠를 열 수 있는 원리와 유사하기 때문이다. 이 예에서 자물쇠는 기질에 해당하며 열쇠는 효소에 해당한다.(1) 절대특이성: 단 1가지 특정 기질에만 작용하는 효소(2) 상대특이성: 공통적인 특이구조를 갖는 몇 가지 기질에 작용하면서 그 반응속도가 다른 효소효소의 작용 기작그림 5. 효소의 를 알 수 있을 것이다.(2) 아밀라아제의 최적 온도는 0℃, 37℃, 90℃ 중에서 37℃일 것이다.(3) 아밀라아제의 최적 pH를 알 수 있을 것이다.(4) 아밀라아제의 최적 Ph는 pH4, pH7, pH10중에서 pH7일 것이다.Ⅳ. 실험(Experiment)1. 실험 재료(Materials)1-1. 탄수화물의 검출[1. 베네딕트검사(Benedict’s test), 2. 바포오드검사(Barfoed’s test)]▶1% glucose▶1% sucrose▶1% maltose▶1% starch▶1% fructose▶베네딕트용액▶바포오드용액▶시험관대▶시험관▶중탕기▶눈금스포이드1-2. 소화효소[1. 아밀라아제의 활성과 온도의 효과, 2. 아밀라아제의 활성과 pH의 효과]▶1% starch▶완충용액(pH 4, 7, 10)▶요오드용액▶눈금스포이드▶시험관▶시험관대▶중탕기▶얼음▶온도계▶종이컵▶피펫2. 실험 방법(Methods)※ 실험 전 주의사항1. 2개 조가 한 팀이 되어 실험한다(홀수 조: 2-1.1.,2-2.1.실험, 짝수 조: 2-1.2., 2-2.2.실험 후 결과 공유).2. 실험 전 시험관이 깨끗한지 확인 후 실험을 시작한다.3. 색을 관찰, 비교해야 하므로 결과정리 전에 실험 반응물을 버리는 일이 없도록 주의한다. 결과 정리 후 반응물은 폐액 비이커에 모은 후 노란색 폐액통에 버린다.4. 아밀라아제가 활성화되면 요오드 본래의 색깔이 나타나지만, 활성화되지 않으면 전분과 요오드가 반응하여 보라색을 나타낸다.5. 실험에 사용한 시험관은 솔과 세제를 사용하여 깨끗이 세척한다.2-1. 탄수화물의 검출1. 베네딕트 검사(Benedict’s test)(1) 베네딕트액 2㎖를 5개의 시험관에 넣고, 각각 시료 0.5㎖(10방울정도)를 가한다.(2) 이것을 3분간 끓는 물에 중탕시킨다.(3) 서서히 식히면서 나타난 반응결과(침전물의 색)를 관찰한다(급하게 찬물에 담그는 것은 금지).2. 바포오드 검사(Barfoed’s test)(1) 바포오드액 5㎖를 5개의 시험관에 넣고 환원당이 알칼리성으로 황산구리를 환원시켜 산화구리의 적색, 자주색, 녹색 등 당량에 따른 빛깔의 침전이 생기는 원리를 이용하여 탄수화물을 검정하는 것이다. 알칼리성이 약하며 환원성을 가진 탄수화물에 선택적으로 작용을 한다. 뇨의 glucose 함량을 검사할 때도 쓰인다. 이 실험의 원리는 베네딕트 시약에 함유된 황산구리가 알칼리와 반응하여 수산화구리로 되고, 이것이 환원당에 의해 적갈색의 산화구리로 변한다는 것이다(구리는 이온화되었을 때에는 푸른색을 띠고, 금속으로 환원되면서 붉은 색으로 변함). 즉, 베네딕트 용액과 환원성을 띠는 당을 반응시키면 청록색의 구리2가 이온[Cu2+]이 당의 환원력에 의해 구리1가 이온[Cu+]으로 환원되어 산소와 산화구리(Cu2O) 침전물을 만든다.실험 결과 glucose와 maltose, fructose 시료를 가한 시험관 속의 용액의 색깔이 적색으로 변했음으로 glucose와 maltose, fructose는 환원성을 띠는 당임을 알 수 있다. starch는 베네딕트 용액과 반응시키기 전과 후의 시험관 속의 용액의 색깔 변화가 없기 때문에 환원성을 띠지 않음을 알 수 있다. sucrose는 이당류이지만 베네딕트 검사에서는 반응하지 않았다.탄수화물 검출 결과1. 탄수화물 검출 결과 - Benedict (실험 중)탄수화물 검출 결과2. 탄수화물 검출 결과 - Benedict (실험 후)표 1. 탄수화물 검출 결과TEST단당류이당류다당류1% glucose1% fructose1% maltose1% sucrose1% starch이론결과녹황적색주황변화없음변화없음실험결과적색적색주황변화없음변화없음1-2. 바포오드 검사(Barfoed's test)바포오드가 약한 산성을 가지고 있기 때문에 단당류에서만 반응을 한다. 따라서 이 검사는 단당류와 이당류를 구별할 때 사용하는 것으로 바포오드 용액에 의해 이당류가 구리이온을 Cu₂O로 환원시키지 못하는 원리를 이용하여 단당류와 이당류를 구별한다. 실험결과 바르푀드 용액에 glucose와 fruct

자연과학| 2024.07.18| 16페이지| 2,500원| 조회(249)

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충북대 일반생물학실험_2_동물세포 및 식물세포의 관찰

[별첨] 실험보고서 표지실험보고서Experiment Report교과목명일반생물학의 이해 및 실험실험제목동물세포 및 식물세포의 관찰제출월일2016년3월18일담당교수제 출 자성명:학과:생명과학부학년:1학번:충북대학교 생물학과Department of Biology, Chungbuk National UniversityⅠ. 실험 목적(Purpose of experiment)동물 구강상피세포, 식물 양파표피세포의 슬라이드를 제작하고 관찰한다.Ⅱ. 배경지식(Background knowledge)세포는 너무 작기 때문에 17세기에 현미경이 발명되기 전까지 발견되지 못하였다. 훅(Robert Hooke)은 1668년에 처음 세포를 관찰하고 이를 라틴어로 “작은 방”이라는 의미를 가진 cellulae라고 명명하였고, 이후 cell(세포)이라는 용어로 정착되었다. 또 다른 현미경학자인 레벤후크(Anton Van Leeuwenhoek) 역시 세포를 처음 관찰하고 작은 동물이라는 의미를 가진 “animalcules”라고 명명하였다. 이러한 최초의 발견 이후 거의 한 세기 반이 지나서야 생물학자들은 세포이 중요성을 제대로 이해하기 시작하였다. 1838년 식물학자인 슐라이덴(Matthias Schleiden)은 모든 식물은 “각각 독립적이고 개별적이며 분리된 존재, 즉 세포라는 것들의 집합체”라고 언급하였다. 1839년 슈반(Theoder Schwann)은 모든 동물의 조직은 개별적인 세포들로 구성되어 있다고 보고하였으며, 이를 통해 세포설이 탄생되었다.세포설은 생물이 세포로 이루어져 있다는 관찰을 바탕으로 발전되었다. 비록 간단해 보이지만 세포설은 생명의 조직에 대한 매우 심오한 기술이라 볼 수 있다. 현대적 관점으로 보면 세포설(cell theory)은 다음과 같은 세 가지 원리를 포함하고 있다.1. 모든 생물은 하나 또는 그 이상의 세포들로 구성되어 있으며, 대사 및 유전의 생명과정은 이들 세포 내에서 이루어진다.2. 세포는 가장 작은 형태의 생명이며, 모든 생물의 기본 단위이다., 미토콘드리아 등의 세포기관으로 분화하지 않는다. 이와 같은 세포로 이루어진 생물을 원핵생물이라고 하며, 모든 세균과 남조식물이 이에 포함된다.1-2. 진핵세포(eukaryotic cell)유사분열을 하며, 핵에서는 DNA가 히스톤 등의 단백질과 함께 염색체의 구조를 만들고, 핵 속에는 인을 볼 수 있다. 세포질 속에는 막계가 발달하여 소포체, 골지체, 미토콘드리아, 엽록체, 리소좀 등의 세포소기관이 존재하며, 각각 특이 기능을 담당한다.가. 핵(nucleus)대체로 구형의 형태를 가지고 있으며 동물세포에서는 전형적으로 세포의 중앙에 위치한다. 핵은 살아있는 진핵생물의 거의 모든 단백질의 합성을 담당하는 유전정보의 저장소 역할을 한다. 즉 생명활동의 중심이며 유전자(DNA, RNA)를 지닌다. 대부분의 진핵세포의 경우 하나의 핵을 가지지만, 곰팡이세포 또는 다른 종류의 경우 몇 개 이상의 핵을 가지기도 한다. 포유류 적혈구세포의 경우 성숙과정에서 핵을 잃어버리기도 한다.1. 핵막(unclear envelope)인지질 2중층으로 되어 있고, 여러 개의 핵공(unclear pore)이 있어 RNA를 포함한 커다란 과립성 물질이 이들을 통해 핵으로부터 세포질 속으로 이동하게 된다. 핵막의 바깥쪽 부분은 소포체라 불리는 세포질 내부 막계와 연결되어 있다.2. 인(uncleolus)핵 속에 1개 또는 여러 개가 존재하며, 가느다란 섬유와 전자밀도가 다소 낮은 과립으로 구성되어 있다. rRNA(ribosomal RNA) 핵산의 합성에 관여한다. 인은 염색체가 풀렸을 때 광학현미경으로도 볼 수 있다.3. 염색질(chromatin)여러 분자의 DNA와 여러 종류의 히스톤단백질로 이루어진 유전정보의 본체이다. 염색질은 대체로 핵 안에서 길게 늘어난 형태를 하고 있지만, 아직도 우리는 그 구조를 완벽하게 이해하지 못하고 있다. 세포가 분열할 때, 염색질은 더욱 단단히 다져져서 광학현미경으로 관찰할 수 있는 X자 모양의 염색체를 형성하는 고도로 응축된 상태가 되어야 한다.나. 받아들인다.② 백색체(leucoplast): 전분 저장 구조체로 대부분의 식물세포에 존재한다.③ 잡색체(chromoplast): 오렌지색의 카로틴, 노란색의 크산토필, 붉은색의 여러 색소를 포함한다.(4) 리보솜(ribosome)RNA와 단백질로 구성된 소형 복합체로서 단백질이 합성되는 곳이다. 아미노산을 조립하여 단백질을 합성한다.(5) 골지체(Golgi-body)세포에서 만들어지는 물질들을 모으고, 포장하고 배분하는 기관으로 분비에 활발하게 관여하는 세포에 특히 발달되어 있다. 리소좀을 만들어 내기도 한다.(6) 리소좀(lysosome)세포 내 고분자 또는 노화된 세포소기관을 분해, 소화하고 배설하는 기관이다. 가수분해 효소를 비롯하여 40여종의 효소가 있다.(7) 액포(vacuole)정상적인 동물세포에서는 보기 어려우나 식물세포에서는 흔히 볼 수 있다. 어린 식물세포는 액포가 작지만 늙은 세포일수록 점차 커진다. 액포 속에는 당, 무기염류, 색소 등이 있고, 영양분과 노폐물을 저장하는 기능을 한다.(8) 중심체(centrosome)세포분열의 중심적 역할을 수행하는 세포기관이다. 동물, 식물의 세포질 내에 있고, 그 중심부에 중심립(centriole)이 있다. 중심립은 미세소관의 복잡한 조립체로 쌍으로 존재한다. 휴지핵 속에는 1개의 중심체가 있지만 핵분열이 시작되면 2개로 분열하여 각각은 양극으로 이동한다. 중심체 주위에는 성상체가 발달하고, 두 중심체 사이에 방추체(spindle)가 형성되며 염색체는 방추사(spindle fiber)와 결합하여 양극에 있는 중심체 쪽으로 이동한다.(9) 세포골격(cytoskeleton)모든 진핵세포의 세포질은 세 가지 종류의 단백질 섬유들 네트워크가 교차되어 있으며, 이를 통해 세포의 형태가 만들어지고 각 세포소기관들이 정해진 장소에 위치할 수 있게 된다. 세포골격이라 불리는 이들 네트워크는 매우 역동적인 시스템으로 항상 조립되거나 해체되고 있다. 개개의 섬유들은 똑같은 단백질 단위들이 서로 끌어당기고 자발적으로 조립되 전자현미경으로 절단면을 확인해보면 원형질막은 두 개의 짙은 선이 밝은 부분 양쪽으로 분리되어 존재한다. 이는 소수성 분자, 친수서 분자(포도당)와 이온(Na+, K+, Cl-)을 투과한다.2. 세포벽(cell wall)섬유소(cellulose)로 구성되어 있는 전투성막으로, 세포를 기계적 손상으로부터 보호하고, 식물체를 구조적으로 지탱해준다.2. 동물세포와 식물세포1-1. 동물세포의 구조그림 1. 동물세포1-2. 식물세포의 구조그림 2. 식물세포Ⅲ. 가설 설정(Setting up hypothesis)3-1. 동물세포의 관찰 : 구강상피세포 슬라이드제작 및 관찰(1) 메틸렌블루로 염색을 하면 핵이 염색되어 염색을 하지 않은 세포보다 관찰이 더욱 용이할 것이다.(2) 동물세포에는 세포벽이 없으므로 세포의 형체가 뚜렷하지 않을 것이다.(3) 광학현미경으로 저배율에서 고배율로 갈수록 더 자세한 세포소기관들을 볼 수 있을 것이다.3-2. 식물세포의 관찰 : 양파표피세포 슬라이드제작 및 관찰(1) 요오드 용액으로 염색을 하면 핵이 염색되어 염색을 하지 않은 세포보다 관찰이 더욱 용이할 것이다.(2) 식물세포에는 세포벽이 있으므로 세포의 형체가 뚜렷할 것이다.(3) 광학현미경으로 저배율에서 고배율로 갈수록 더 자세한 세포소기관들을 볼 수 있을 것이다.Ⅳ. 실험(Experiment)1. 실험 재료(Materials)1-1. 동물세포의 관찰: 구강상피세포 슬라이드제작 및 관찰▶0.9%생리식염수(25ml/조)▶0.5%메틸렌블루(25ml/조)▶핀셋(1개/조)▶면봉(3개/조)▶슬라이드글라스(2box/반)▶커버글라스(1box/반)▶여과지(4개/조)▶스포이드▶삼각플라스크(시약종이)▶광학현미경(2대/조)1-2. 식물세포의 관찰: 양파표피세포 슬라이드제작 및 관찰▶양파(1조각/조)▶광학현미경(2대/조)▶면도칼(1개/조)▶1%요오드용액(25ml/두 조)▶글리세린수(25ml/두 조)▶여과지(4장/조)▶페트리접시▶슬라이드글라스(2box/반)▶커버글라스(1box/반)▶핀셋(1개/조)2. 실험 용액으로 2분간 염색한 후 여과지를 사용하여 남은 요오드 용액을 제거한다.(4) 양쪽 구역에 각각 글리세린수를 한 방울 떨어뜨린 뒤 커버글라스를 덮고 여과지로 여분의 물기를 제거한다.(5) 광학현미경을 사용하여 저배율에서 고배율의 순서로 관찰한다(프레파라트가 대물렌즈에 닿지 않도록 주의).(6) 염색 전·후의 차이점을 관찰한다.(7) 연필로 스케치한다.Ⅴ. 결과(Results)5-1. 동물세포의 관찰 [1. 구강상피세포 슬라이드제작 및 관찰]처음에는 구강상피세포의 관찰이 매우 어려울 것으로 예상했다. 동물세포는 세포벽이 없기 때문에 형체를 뚜렷하게 관찰하기가 힘들 것이라고 생각했기 때문이다. 예상대로 저배율 일 때에는 세포의 존재자체를 확인하기가 쉽지 않았지만, 고배율로 갈수록 세포의 형체가 보이고, 나아가 세포소기관까지도 희미하게 보였다. 메틸렌블루로 염색을 한 구강상피세포는 더욱 관찰이 용이했다. 염색을 시켜놨기 때문에 저배율 일 때에도 세포를 찾기가 쉬웠고, 고배율로 관찰했을 때에는 핵이 염색되어 더욱 선명한 세포의 내부를 관찰 할 수 있었다.하지만 모든 세포소기관을 관찰하기에는 배율이 많이 낮았다. 이론적으로 배웠던 여러 소기관들 중에서 핵 정도는 관찰이 가능했지만, 그 외에 다른 많은 소기관들은 관찰하기가 힘들었다.5-2. 식물세포의 관찰 [2. 양파표피세포 슬라이드 제작 및 관찰]양파표피세포를 관찰하는 실험은 예상보다 시간이 오래 걸렸다. 양파의 표피를 너무 두껍게 채취한 바람에 광학현미경으로 세포를 관찰했을 때 구조가 계속 겹쳤기 때문이다. 그래서 실험을 3번을 반복한 다음에야 정확한 결과를 얻을 수 있었다. 다행히도 식물세포에는 세포벽이 있었기 때문에, 염색을 하지 않은 세포를 관찰 할 때에도 세포의 존재는 명확히 확인 할 수 있었다. 그러나 400배율로 관찰하기 전 까지는 핵조차 관찰하기 어려웠다. 하지만 요오드 용액으로 염색을 한 후 관찰 했을 때에는 비교적 저배율이었던 40배율 일 때부터 핵을 관찰 할 수 있었고, 고배율로 갈수록 점점 선명색된다.

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충북대 일반생물학실험_1_현미경의 종류, 구조, 기능 및 세포의 길이 측정

[별첨] 실험보고서 표지실험보고서Experiment Report교과목명일반생물학의 이해 및 실험실험제목현미경의 종류, 구조, 기능 및 세포의 길이 측정제출월일2016년3월11일담당교수제 출 자성명:학과:생명과학부학년:1학번:충북대학교 생물학과Department of Biology, Chungbuk National UniversityⅠ. 실험 목적(Purpose of experiment)현미경에 관한 전반적인 지식 및 사용법을 습득하고, 양파세포를 관찰하고 길이를 측정한다.Ⅱ. 배경지식(Background knowledge)1. 현미경의 종류, 구조와 기능생물체는 매우 미세한 구조로 육안만으로 구별하는 것은 매우 곤란하므로 그 자세한 짜임새를 알기 위해서는 확대를 위한 보조기구를 사용해야 한다. 현미경은 광학렌즈를 이용하여 물체의 구조를 확대시켜 그 해상력을 증대시켜 주는 기구로써 미세구조를 밝히는 데 가장 중요한 기구이다.1-1. 현미경의 종류가. 광원의 위치에 따른 분류1. 정립현미경(Up-light microscope)세워진 형태의 일반적인 현미경.2. 도립현미경(Down-light microscope, inverted microscope)보통 현미경과는 반대로 시료대 상부에 있는 광원에서 하향으로 빛을 조사하여 하부에서 대물렌즈로 상을 포착하고 프리즘에 의해 굴절시켜 앞부분의 접안경에서 관찰할 수 있도록 제작된 현미경. 용기의 저면에 부착되어 증식하고 있는 배양세포 등의 형태나 기능을 산채로 관찰할 수 있다. 위상차장치, 간편위상차장치, 미량주입장치, 현미경영상촬영장치 등과 조립된 많은 종류가 있다.나. 기능에 따른 분류1. 광학현미경(Light microscope = Optic microscope)표본으로부터 빛을 사용하여 대물렌즈에 의해 표본이 확대된 실상을 맺고, 이것을 대안렌즈에 의해서 재 확대하는 장치로, 일반적으로 현미경이라고 할 때는 이것을 가리킨다.2. 입체현미경(Stereoscopic microscope)두 대물렌즈의 배율이 서로 다르며, 시료편에 편광을 통과시켜 그 광학적 성질을 조사하기 위한 특수한 현미경이다. 이 현미경으로 시료의 미소부분을 확대하거나 광물의 결정, 결정형의 판별 등을 조사할 수 있다. 분자구조가 상이한 분자들을 관찰 시 이용한다(ex.암석학).6. 해부현미경(Dissecting microscope)상의 실체(실물)를 보여줌, 배율에 한계가 있다.7. 전자현미경(Electron microscope)전자현미경에서는 광학현미경과는 달리 유리렌즈 대신에 자기렌즈(마그네틱 렌즈)를 이용한다. 광원은 가시광선 대신에 파장이 짧은 전자를 이용해 시료에 주사하고, 시료와 상호작용한 전자를 검출기로 측정하여 형상을 만든다. 따라서 전자현미경에서는 컬러상을 관찰할 수 없고 흑백상을 관찰하게 된다. 전자의 흐름을 이용하여 높은 해상력과 배율을 가진다.(1) TEM(transmission electron microscope, 투과형 전자현미경): 표본에 전자선을 투과시켜 상을 얻는다. 얻어진 상은 평면적이고, 단면의 내부구조를 관찰하기에 용이하다.(2) SEM(scannig electron microscope, 주사형 전자현미경): 전자선을 표본의 표면에 주사하여 상을 얻는다. 얻어진 상은 입체적이고, 표면의 입체구조를 관찰하기에 용이하다.1-2. 현미경의 구조가. 광학적 장치(optical part)1. 대안렌즈(Ocular lens) : 윗부분 끝의 눈렌즈, 아랫부분의 렌즈는 집광렌즈로서 조리개가 렌즈의 수차를 제거하여 시야를 결정한다.2. 대물렌즈(Objective lens) : 경총의 최하단에 있는 대물렌즈 교환기(revolver)에 붙어있는 렌즈로써 물체를 1차적으로 확대시킨다.3. 집광기(Condenser) : 23개의 blue lens를 연합시킨 것으로서 재물대의 중앙의 구멍으로 광선을 모으는 장치이다.4. 조리개(Diaphragm) : 들어오는 빛의 양을 조절(해상력, 초점심도, contrast 조절)한다.5. 여광판(Light Filter) : 광원에서 나오는 광선의 조성을 (Fine adjustment screw) : 정밀한 조준을 맞출 때 사용한다.6. 대물렌즈 교환기(Revolving nose-piece) : 배율이 다른 렌즈를 바꿀 필요가 있을 때 대물렌즈를 손쉽게 바꾸는 장치로 경통의 하단에 달린 것으로서 각기 배율이 다른 대물렌즈를 여러 개 끼워 놓고 필요로 하는 렌즈가 광선과 일치하도록 돌려가며 고정한다.1-3. 현미경의 기능1. 해상력(분해능, resolving power)어느 한계선에 이르기까지 두 개의 작은 물체가 여전히 분리되어 보이는가를 측정하는 능력을 뜻한다. 즉, 접근되어 있는 두 점을 구별할 수 있는 렌즈의 능력을 해상력(解像力: 분해능)이라 한다. 이것은 현미경의 성능을 좌우하는 조건의 하나이지만 대물렌즈의 성능에 의하여 결정된다. 따라서 대물렌즈와 대안렌즈와의 조합에 의하여 아무리 배율을 증가시키더라도 대물렌즈의 성능이 나쁘면 흐릿한 상이 단순히 확대될 뿐으로, 미세한 구조의 식별은 되지 않는다.2. 구획력(definiting power)윤곽이 뚜렷한 상을 맺게 하는 능력으로 대물렌즈의 능력을 말한다.3. 배율(magnification)현미경의 확대능력, 즉 총배율(선배율)은 대물렌즈 배율과 대안렌즈 배율의 곱으로 주어진다.(예) 10×10=100배, 10×40=400배, 10×100=1,000배1-4. 대물렌즈의 규격표시대물렌즈에는 숫자들이 새겨져 있다. 예를 들어, 10배의 대물렌즈에는 위로부터 ×10, 0.30, 7.00 등의 숫자가 표시되어 있는데, 여기서 ×10은 배율, 0.30은 개구수, 7.0은 작동 거리를 나타낸 것이다. 개구수는 클수록 분해능이 높으며, 작동 거리의 7.00은 프레파라트와 대물 렌즈간의 거리가 7mm란 뜻이다.[개구수와 해상력과의 관계]대안렌즈 단독배율의 선택은 일반적으로 현미경의 총 배율이 대물렌즈의 개구수(대물렌즈로 들어오는 빛의 퍼진 각과 렌즈와 시료간의 매질에 의하여 결정되는 수치로서 NA로 표기하며 대물렌즈 통에 그 값이 기록된다)의 500~1,000배가 되도처음에는 저배율로 검경한 다음, 보고자 하는 부위를 고배율로 검경한다.7. 함부로 분해하지 않는다.8. 사용 후에는 대물렌즈는 최저 배율로 돌려놓고, 재물대는 가장 낮게 위치한다.2. 세포의 길이 측정시야의 중앙에 있는 세포의 길이를 측정할 때에는 대안마이크로미터(ocular micrometer)와 대물마이크로미터(objective micrometer)를 사용하여 잰다.2-1. 마이크로미터를 사용한 측정정확한 측정을 위하여 우선 대안마이크로미터를 준비한다. 이것은 작은 원형 유리판에 일정한 간격으로 눈금을 새겨 넣은 것이다. 이것을 현미경의 대안렌즈 통에 넣는다. 물체가 현미경에 보이면 이 마이크로미터는 자가 되며 그 물체에 겹쳐 놓아 길이를 잰다. 하지만 대안마이크로미터 한 눈금의 길이는 고정된 값이 아니라 사용하는 대물렌즈의 배율에 따라 달라진다. 따라서 물체의 길이를 측정하기 위해서는 먼저 대물마이크로미터를 이용하여 대안마이크로미터 한 눈금의 길이를 정해야 한다.실제의 길이를 알기 위해 대물마이크로미터를 사용하는데 이것은 일정한 길이를 일정한 간격으로 눈금을 새겨 넣은 특수 받침유리이다. 대물마이크로미터 한 눈금의 길이는 10μm(마이크로미터)라는 고정된 값을 가진다. 따라서 대물마이크로미터 한 눈금이 대안마이크로미터의 몇 눈금에 해당하는지를 알아내면 접안마이크로미터 한 눈금의 길이를 정할 수 있다. 대안마이크로미터를 설치한 후 재물대 위에 대물마이크로미터를 놓고 관찰한다. 이때 정확히 겹치는 두 눈금을 찾고, 그 사이에 들어가는 눈금 수를 센다. 대물 쪽의 눈금 수가 a, 접안 쪽의 눈금 수가 b라고 하면 접안마이크로미터의 한 눈금의 길이는 a/b×10μm가 된다.그림 1. 마이크로미터를 이용한 길이의 측정.사용법1. 접안렌즈의 뚜껑을 열고 대안마이크로미터를 넣는다.2. 재물대 위에 대물마이크로미터를 놓는다.3. 사용하고자 하는 대물렌즈의 배율을 선택한 후 초점을 맞춘다.4. 대물마이크로미터와 대안마이크로미터를 왼쪽을 기준으로 하여 평행하게 맞춘다.5. 수 있을 것이다.Ⅳ. 실험(Experiment)1. 실험 재료(Materials)1-1. 현미경의 종류, 구조와 기능[1.광학현미경, 2.해부현미경]▶광학현미경(2대/조)▶해부현미경(1대/조)▶슬라이드글라스(2box/반)▶커버글라스(1box/반)▶삼각플라스크(시약용기)▶스포이드(1개/조)▶핀셋(1개/조)▶가위(1개/조)▶신문지(1장/조)▶물(25ml/조)1-2. 세포의 길이측정▶광학현미경(2대/조)▶양파표피 슬라이드▶대안마이크로미터(7개/반)▶대물마이크로미터(노랑 1~7번 현미경 대안렌즈에 들어 있음)2. 실험 방법(Method)2-1. 현미경의 종류, 구조와 기능1. 광학현미경(1) 헌 신문지의 글자 하나를 잘라 슬라이드 글라스 위에 놓고 물을 한 방울 떨어뜨린다.(2) 기포가 생기지 않도록 커버글라스를 비스듬히 세워서 천천히 눕혀서 덮는다.(3) 준비된 프레파라트를 재물대 위에 올려놓고, 프레파라트가 대물렌즈에 거의 닿을 때까지(닿지는 않도록) 옆에서 보며 조동나사로 재물대를 천천히 올린다.(4) 대안렌즈로 들여다보며 재물대를 서서히 내려 상이 나타나도록 한다.(5) 미동나사로 상이 더욱 또렷하게 보이도록 초점을 조절한다. 단, 쌍안현미경의 경우 diopter 조절 링을 회전시켜 두 눈의 diopter를 맞춘다.(6) 대물렌즈 회전 장치를 돌려서 고배율로 관찰한다. 이때 집광기(condenser)를 회전시켜 최적의 상태로 관찰한다.(7) 나타난 상은 왼쪽 눈으로 관찰하고, 오른쪽 눈을 이용하여 스케치한다.(8) 현미경 사용 후의 처리① 현미경의 사용이 끝나면 슬라이드 글라스를 빼고 재물대에 묻어있는 물기나 먼지를 닦아낸다.② 대물렌즈 회전판을 돌려서 저배율의 대물렌즈가 경통 직하에 오도록 한다.③ 대물렌즈의 하단이 재물대로부터 최대한 멀리 위치하도록 조절한다.④ 광원을 끄고 코드를 뽑은 후 전선을 잘 감아서 보관 장소로 이동시킨다.2. 해부현미경(1) 준비한 재료를 재물대 위에 올려놓는다.(2) 조동나사를 조절해 대물렌즈를 재물대에 최대한 가깝도록 위치시다.

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충북대 일반생물학실험_9_PCR 결과 확인(전기영동)

[별첨] 실험보고서 표지실험보고서Experiment Report교과목명일반생물학의 이해 및 실험실험제목PCR 결과 확인(전기영동)제출월일2016년5월27일담당교수제 출 자성명:학과:생명과학부학년:1학번:충북대학교 생물학과Department of Biology, Chungbuk National UniversityⅠ. 실험 목적(Purpose of experiment)지난 11주차에 추출한 DNA의 PCR결과를 전기영동을 통해 확인한다.Ⅱ. 배경지식(Background knowledge)1. PCR(Polymerase chain reaction)PCR(polymerase chain reaction)법은 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술이다. 그 원리는 극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 분야까지 그 활용범위를 넓혀가고 있다. PCR증폭효율에 영향을 미치는 요인으로는 ① 각 단계의 반응온도와 시간, ② cycle수, ③ 반응액 조성(주형 DNA, dNTP농도, Mg2+농도 등), ④ primer 설계, ⑤ 사용 DNA polymerase 등이 있다. 또한 몇 가지 반응첨가물(DMSO, 비이온계면활성제, 글리세롤) 등에 따라 반응촉진효과가 나타나는 경우가 있다.PCR(Polymerase chain reaction)은 1980년대 중반에 Kary Mullis에 의해 개발된 것으로 특정염기서열을 증폭함으로써 DNA 염기서열 분석 및 현대 분자생물학의 발전을 가져왔다. PCR 방법에 가장 흔히 사용되는 DNA 중합효소(DNA polymerase)는 Taq 1 polymerase이다. 초기에는 E. coli polymerase를 사용하였으나 열에 불안정하여 각 cycle이 진행 될 때 마다 효소를 첨가해주어야 하는 불편함이 있었다. 그래서 개발된 것이 75℃ 온천에서 분리한 세균 Thermus aquati응의 기질로 이용이 된다. PCR cycle수를 n회라 가정했을 때 최종 합성량은 초기량 대비 (2 x e)n 배 증가하게 된다. 2는 1회 cycle로 증폭되는 양이지만 여기에는 PCR의 효율(e)을 곱해주어야 한다. PCR의 효율은 PCR이 진행되는 buffer 조건, dNTP의 양, primer의 양적 고갈, DNA 중합효소의 활성도 등에 의해 영향을 받으며, 보통은 0.8-0.9 정도이다. 또한 일정한 cycle이 진행된 후에는 더 이상 DNA의 양이 증가하지 않는 단계에 이르게 되는데 이를 saturation stage라고 한다.PCR에 사용하는 중합효소에 따라 extension 시간은 임의로 조절이 가능하다. 일반적인 효소의 경우 1 kbp 증폭에 30-60초 정도의 시간을 주지만 특수하게 조작된 효소의 경우에는 1 초의 extension 시간만으로도 충분히 증폭이 일어날 수 있다. PCR로 증폭하여 합성한 DNA는 agarose 전기영동 후 염색하여 관찰하거나 또는 형광 표지 후 기계적인 방법을 통해 확인할 수도 있다.1-2. PCR의 과정PCR의 과정그림 1. PCR의 과정.1. DNA의 변성(denaturation)PCR의 가장 첫 단계이며, 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어져 두 가닥의 DNA로 분리된다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.2. Primer의 결합(annealing)각각 두 가닥으로 분리된 DNA 분자에 프라이머가 붙는 과정이다. 프라이머는 프라이머와 상보적인 염기가 위치한 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 정확성을 결정짓는 단계이며, 온도는 프라이머의 길이와 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 프라이머가 DNA 분자에 잘 달라붙지 않아 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮으면 프라이머가 다른 염기서열에 붙을 확률이 높아져 정확도가 떨어진다.3. DNA의 신장(extension)프라이머가 결합된 주형 DNA 가닥에 뉴클레오티드가 상보적으로 결합하CR 반응 산물에는 여러 가지 반응 후 잔유물과 부산물이 존재하여 sequencing과정을 방해하기도 한다. 특히 반응 후 여분의 primer는 sequencing 과정에서 사용하는 primer와 혼합되어 sequencing 결과에 나쁜 영향을 미친다. 그러므로 PCR 반응 산물은 sequencing 하기 전에 일반적으로 다음의 세 가지 중 하나와 같은 정제과정을 거친다.1. glass milk에 의한 정제PCR 반응 산물을 모두 agarose gel 에 loading 한 후에 gel 상에 형성된 band를 잘라낸다. 특정 조건에서 DNA를 흡착하는 성질을 갖는 silica를 이용하여 PCR product 만을 정제해 낸다(e. g. GENECLEAN Kit, Bio 101 Inc.). 이 방법은 가장 깨끗하게 PCR product를 정제해 낼 수 있는 방법이지만, phylogenetic study 와 같이 sample의 수가 많은 실험에 있어서는 실용적이지 못하다. 주로 PCR product의 cloning 같은 sequencing 이외의 목적의 정제에 많이 쓰인다.2. column membrane 방식특정 조건하에서 double strand DNA 만을 부착시키는 성질을 갖는 membrane에 DNA를 붙인 후 DNA 이외의 물질들을 씻어내 주고, membrane으로부터 DNA를 다시 분리시키는 과정을 거친다(e. g. QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN). 이 방법은 glass milk에 의한 방법보다는 훨씬 간편하고, 또 매우 순수한 DNA를 얻을 수 있기는 하지만 가격이 매우 비싸서 경제적이지 못하다.3. Polyethylene Glycol (PEG)에 의한 방법sequencing을 위하여 가장 간편하고 경제적으로 PCR product를 정제할 수 있는 방법이고 많은 molecular systematics lab에서 일반적으로 사용하는 방법이다(Soltis and Soltis, 1997).1-5. PCR의 응용PCR은 로도 전혀 새로운 기술이 개발될 만큼 중요한 기반기술이며 앞으로의 활용가치가 무궁무진한 핵심기술이라 할 수 있다.2. PCR 결과 확인(전기영동(electrophoresis))PCR 증폭산물의 해석에 우선적으로 실시하는 방법이다. 증폭 DNA의 유무 및 비 특이적 증폭 DNA의 유무를 해석하는 데에 사용한다. DNA 젤 전기영동은 DNA를 50V~100V 정도의 전류 장치에 흘려보내면서 크기에 따라 분리하는 방법이다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있어 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 DNA 분자가 젤 매트릭스를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록, 젤의 밀도가 클수록 느려진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 초나선 구조를 갖는 supercoil DNA는 선형 DNA보다 빠르게 움직인다.Ⅲ. 가설 설정(Setting up hypothesis)(1) 쥐의 근육세포에서 DNA를 추출하여 중합효소 연쇄 반응실험에 이용할 product를 만들 수 있을 것이다.(2) 전기영동을 통해 PCR의 결과를 알 수 있을 것이다.Ⅳ. 실험(Experiment)1. 실험 재료(Materials)1-1. PCR 결과 확인(전기영동)▶PCR product▶DNA 추출액▶삼각 플라스크▶전기영동 장치, gel cast, corn▶tip▶micropipet▶marker(1kb DNA ladder, HindⅢ)▶2㎕ loading dye▶전자레인지▶1.8% gel▶0.8% gel▶일회용 비닐장갑(1×TAE buffer(Red safe 첨가)10ml + agarose 0.18g) (교양생물에서 준비)2. 실험 방법(Methods)2-1. 1.8% gel 만들기(마주보는 2조 당 한 개 만들기)1. 약포지를 저울위에 올려놓은 후 전원을 켜, 0.00g에 맞추고, 0.18g agarose를 잰다.2. 1에서 잰 agarose를 삼각 플라스크에 넣은 후, Red safe가 첨가된 지 않도록 주의하면서 UV lamp로 갖고 나온다.6. gel을 UV lamp위에 올려놓고 뚜껑을 반드시 닫고, 스위치를 켠 후 빠르게 관찰한다(강한 자외선으로 인해 시력저하, 피부암 등이 발생할 수 있으니, 관찰 시에는 반드시 뚜껑을 닫고 관찰할 것, 육안 관찰 시 UV 70%, 사진촬영 시 100%로 맞출 것).7. 관찰이 끝나면 UV lamp의 전원을 끄고, 관찰한 gel은 바로 일회용 비닐장갑에 싸서 버린다.Ⅴ. 결과(Results)5-1. 1.8% gel 만들기(마주보는 2조 당 한 개 만들기)이 실험은 조교님께서 해 주신 실험이다.5-2. 전기영동전기영동그림 2. 전기영동 실험결과.gel의 각각 왼쪽에 형광으로 나타나 있는 것이 대조용액 ladder marker랑 Hind Ⅲ marker이고 우리 조의 경우에는 PCR product와 DNA추출액이 전개되지 않았다. 조교님께서 PCR이 아예 되지 않았다고 하셨다. 이번 실험은 과정이 매우 복잡하고 많았기 때문에 각각의 과정에서 주의해야할 사항들이 많았고 그때 마다 실수가 있었기 때문에 결과가 나오지 않은 것으로 생각된다.Ⅵ. 고찰(Discussion)(1) 이번 실험에서 각각의 용액들을 사용한 이유먼저 쥐 근육세포 DNA 추출에서 쓰인 buffer CL은 분열 pH를 높이는 용도로 사용되었다. 쥐 근육세포에는 DNA뿐만 아니라 다른 물질들이 다량 존재한다. DNA와 다른 물질들을 분리하고 제거해야 순수한 DNA를 얻어낼 수 있다. buffer CL은 pH를 9.5~11.5로 일정하게 유지시켜 주고 단백질은 염기성 용매에 녹기 때문에 buffer CL을 사용했다. RNase A은 리보핵산가수분해효소 A의 약기로 RNA에 작용하여 뉴클레오티드간의 인산에스테르 결합을 끊고, 분자 중합을 해체한다. 인산에스테르결합은 뉴클레오티드를 연결해주는 결합이기 때문에 이 결합이 끊어진다면 분해산물로 모노뉴클레오티드가 생성된다. 근육세포 내의 RNA를 분해하기 위해 RNase A를 사용해준 것이다. proteinase는것이다.

자연과학| 2024.07.18| 10페이지| 2,500원| 조회(470)

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