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생식생물학실험 만점 (A+) 실험 보고서(레포트) 2. mouse IVF (생쥐의 난자와 정자 채취 및 체외 수정)

생식생물학실험 REPORT제목: 생쥐의 난자와 정자 채취 및 체외 수정(IVF)날짜: 25.05.20학과/학번/이름/조: 바이오헬스융합학과/202311****/홍**/B조서론 - 실험 원리(배경)임신은 수정란이 자궁 내막에 착상하여, 배아 또는 태아가 자궁 내에서 성장하는 생리적 상태를 의미하며, 임신을 위해서는 배란 수정 착상의 과정이 필요하다.배란 (Ovulation)은 성숙한 난포에서 성숙 난자가 난소에서 난관으로 배출되는 현상을 의미하며, LH호르몬에 의해 조절되어, 제2감수분열 상태의 단일 난자가 배출된다. 수정 (Fertilization)은 난관의 팽대부에서 이루어지며, 정자가 난관에 도달하여, Capacitation을 통해 수정 능력을 획득하고, 정자가 난자의 zona pellucida을 뚫는 첨체반응 (Acrosome reaction)이 일어나, 정자와 난자가 접합되어 수정란을 형성하는 과정이다. 착상(Implantation)은 수정란(포배기 상태)이 난관에서 자궁으로 이동하여, 자궁 내막 상피에 부착되는 과정이다. 이때, 융모막 세포로의 분화가 일어나며, 자궁내막을 파고들며 태반 형성이 시작된다. 황체에서 분비되는 프로게스테론이 자궁내막을 착상 친화적으로 유지한다. 착상이 성공하면 rophoblast 세포는 hCG 호르몬을 분비하여 황체를 유지한다.난임은 부부가 자녀를 원하여 피임을 하지 않고 정상적인 부부관계를 하여도 1년 이상 임신이 되지 않는 상태이다. 미국 생식의학회(ASRM)에서는 35세 이상에서 6개월, 35세 미만에서는 1년 이상의 피임하지 않은 상태의 정기적인 성관계에도 임신이 되지 않는 것을 난임으로 정의한다. 난임은 흔하게 발생하는 문제로 전체 인구의 10~15%가 경험하는 것으로 알려져 있다. 난임의 여성 요인으로는 다낭성난소증후군, 무배란 등의 배란장애와 나팔관 문제, 자궁 이상, 고령(35세 이상) 등이 존재한다. 남성 요인으로는 무정자증 등의 정자 수, 운동성의 저하와, 고환 기능 문제, 정액 배출 장애 등이 존재하며,IUI), 체외수정 (In vitro fertilizationand embryo transfer, IVF-ET), 세포질내 정자주입술 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 등이 존재한다.체외수정(IVF-ET)은 자연 임신 과정에서, 착상 이전의 단계를 In vitro에서 수행하는 것으로, 배란 직전 상태의 난자를 체외로 회수하여, 체외에서 수정 시키고, 수정란을 Invitro culture를 통해 배양하여 할구 또는 포배기 상태가 되었을 때 다시 자궁 안으로 배아 이식하는 방법이다. 첫 단계로, Gonadotropins을 투여하여 많은 성숙 난자를 회수하기 위해 과배란을 유도한다. 두번째 단계로, 과배란 유도 후 난포가 충분히 성숙되었다고 판단되면, 난자의 성숙을 위하여 hCG를 주사하고, 배란 직전에 일어나는 LH surge을 인위적으로 생성하여, 생식세포의 제1감수분열을 재개시 시킨다. hCG 투여 34-36시간 후 성숙 난자를 채취한다. 마지막으로, 회수한 성숙 난자와 정자로 체외 수정을 진행하여 배아를 배양하고, 배아가 든 카테터를 자궁경부를 통해 자궁 내막강으로 이동시켜 이식한다.자궁 내 인공수정(IUI)은 배란 시기에 맞추어 정제된 정액을 자궁강 내에 직접 주입하여, 정자가 난자와 수정될 가능성을 높이는 방법이다.세포질 내 정자주입술 (ICSI) 은 단일 정자를 난자의 세포질 내에 직접 미세주입 (microinjection) 하여 수정시키는 방법으로, 정자 수 또는 기능이 매우 낮은 경우에도 수정을 가능하게 하는 보조 생식술이다. 즉, ICSI은 성숙한 난자를 확보하고, 단일 정자를 미세주사기로 흡입하여 난자의 투명대와 세포막을 뚫고, 세포질 안으로 정자를 주입하는 방법이다.실험 목적생쥐의 성숙한 난자와 정자를 각각 채취하여, 체외에서 수정을 유도하여, 정자와 난자의 움직임을 관찰한다.실험 재료샘플Male mouse, female mouse시약PMSG 호르몬 주사, hCG 호르몬 주사, KSOM, 70% ethanuse실험 도구dissecting microscope실험 방법mouse 과배란 유도PMSG 호르몬 주사를 복강 내에 주사한다.PMSG 호르몬 주사 후 44~48시간 뒤, hCG 호르몬 주사를 복강 내에 주사한다.hCG 호르몬 주사 후 12시간 후, 난모 세포를 실험에 사용한다.경추탈골법엄지 손가락과 집게손가락을 두개골 저부에 있는 목의 양쪽에 놓는다.반대손으로 mouse의 꼬리를 잡고, mouse를 잡아당기면, 두개골로부터 첫번째 경추를 분리시켜 안락사 시킨다.Mouse 해부배쪽 외부 생식기 윗 부분을 가위로 절단한 후, 가죽을 머리와 꼬리 쪽으로 잡아 당겨 배부위와 흉부를 감싸고 있는 근육이 드러나게 한다.내장의 원형을 유지하면서, 내장을 감싸는 근육층을 절개하여 체강 내 기관계를 드러낸다.소화기관계를 체강 밖 한 쪽으로 몰아 놓는다.암컷 Mouse에서는oviduct(난관)을 적출하고, 수컷 Mouse에서는 Cauda epididymis(부고환 꼬리)를 적출한다.수컷 Mouse암컷 Mouse체외 수정(IVF)수컷 Mouse에서 적출한 Cauda epididymis를 KSOM 배양액이 담긴 dish에 옮긴다.Oil과 KSOM 배양액이 담긴 dish로 Cauda epididymis를 옮긴 후, 해부현미경 하에서 핀셋과 insulin syringe을 이용하여, Cauda epididymis에서 sperm을 추출한다.Cauda epididymis조직을 dish에서 제거하고, sperm이 담긴 dish를 incubator에서 incubation 한다.암컷 Mouse에서 적출한 oviduct 를 KSOM 배양액이 담긴 dish에 옮긴다.Oil과 KSOM 배양액이 담긴 dish로 oviduct를 옮긴 후, 해부현미경 하에서 과배란된 oocyte를 확인한다.해부현미경 하에서 핀셋과 insulin syringe을 이용하여, oviduct 중 ampulla에서 cumulus-oocyte complex(COC)를 추출한다.Oviduct 조직을 dish에서 제거하고, COC만 d실험 결과mouse의 성숙한 COC를 Oviduct 에서, 성숙한 Sperm를 Cauda epididymis에서 각각 채취하고, 체외에서 수정을 유도하여, 정자와 난자의 움직임을 관찰하는 실험을 진행했다.Cauda epididymis에서 채취한 Sperm을 해부현미경 20X로 관찰했다. 어둡고 덩어리지게 보이는 부분은 Sperm이 고밀도로 응집된 상태로 판단된다. Sperm의 밀도가 낮은 부분에서는 매우 작은 실처럼 보이는 정자들이 매우 활발하게 움직이고 있는 것으로 관찰된다.PMSG 호르몬 주사, hCG 호르몬 주사를 통해서 과배란을 유도한 mouse의 Oviduct를 해부현미경 20X로 관찰했다. 과배란을 유도한 mouse의 Oviduct에서는 과배란이 유도되지 않은 Oviduct에는 존재하지 않았던 반투명하고 크게 부풀어오른 ampulla을 관찰할 수 있었다.과배란이 유도된 mouse의 Oviduct 중 ampulla을 핀셋과 insulin syringe을 통해 찢어서, COC를 추출하고 해부현미경 100X로 관찰했다. 반투명하고, 비교적 연한 회색으로 관찰되는 세포들이 뭉쳐있는 모습이 보이는데, 이는 cumulus cells로 판단된다. cumulus cells 덩어리 사이 중간 중간 진하고 둥근 구조가 관찰되며, 이는 뚜렷한 핵은 보이지 않지만 oocyte로 판단된다. cumulus cells과 oocyte을 통해 성숙에 가까운 COC인 것으로 보인다.sperm을 COC 위에 분주하여 IVF을 유도한 직후를 해부현미경 60X로 관찰했다. COC 위에 분주한 sperm과 COC와 비교적 먼 곳에 분주된 sperm, 모두 COC 방향으로 움직이는 모습을 관찰할 수 있었다. 또한, COC 막 근처에서 sperm이 부딪히는 모습도 관찰되었다.dissecting microscope (NIKON SMZ645)Sperm (20X)Oviduct (20X)COC (100X)IVF (60X)고찰이번 실험에서 oocyte를 과배란 시키기 위해서, PMSG 호르몬 주사와 Serum Gonadotropin) 호르몬을 주사하여 많은 수의 난포의 성장을 유도하고, 이후 황체 형성과 배란을 유도하는 LH와 동일한 역할을 수행하는 hCG (human Chorionic Gonadotropin) 호르몬을 주사해, 자연상태 보다 많은 수의 성숙한 난자를 얻었다. PMSG는 구조적으로 FSH와 유사한 α-β 이중 글라이코단백질 구조를 지니며, FSH 수용체에 결합하여 난포 성장을 자극하여 FSH호르몬을 대체하여 IVF 실험에 사용할 수 있다. 또한, hCG는 구조적으로 LH와 거의 동일한 α-소단위체를 공유하고, β-소단위체는 유사한 기능 영역을 지니기 때문에, LH 수용체에 결합하여 배란을 유도할 수 있다,IVF 실험에서 FSH대신 PMSG를 쓰는 이유는, mouse 실험에서 FSH보다 PMSG의 반감기가 더 길고, 1회 투여만으로 난포 성장 유도가 가능하다는 장점을 지니고 있기 때문에 사용한다. hCG도 반감기가 약 24~36시가 이상으로 LH 호르몬보다 훨씬 길어서 1회 투여만으로 배란 유도가 가능해 이번 실험에서 사용하였다.이번 실험에서 IVF 과정을 KSOM 배양액에서 진행했다. KSOM(Potassium simplex optimized medium)으로 SOM 배지에서 나트륨(Na⁺) 대신 칼륨(K⁺) 농도를 높여 더 배아 발달에 최적화되게 설계되었다. 이온 농도가 생체 내 난관 환경과 유사하게 형성되어 있으며, 포도당, 젖당 등의 영양분과 안정적인 pH와 삼투압을 유지하는 배양약이다. IVF 실험에서 mouse의 수정을 안정적으로 하기 위해 KSOM 배양액을 이용했다.또한, KSOM 배양액 위에 oil을 덮어서 실험을 진행했다. Oil은 KSOM 배양액의 수분 증발을 차단하고, 기체 접촉을 차단하여 pH를 안정적으로 유지하는데 도움을 준다. 또한 외부 먼지, 세균 등의 기계적인 오염을 차단하는 역할도 oil이 수행하기 때문에, oil을 사용해 실험을 진행한다.참고 문헌이성호, “발생학 실험서”, 국내서 단행본, 서울: 바이오사이언-11.

자연과학| 2026.03.12| 9페이지| 2,500원| 조회(15)

체외수정, PMSG, IVF, oviduct, coc, IVF-ET, KSOM, Ca..

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생식생물학실험 만점 (A+) 실험 보고서(레포트) 1. 2-cell embryo collection

생식생물학실험 REPORT제목: 2-cell embryo collection(레)날짜: 25.05.20학과/학번/이름/조: 바이오헬스융합학과/202311****/홍**/B조서론 – 실험 원리 (배경)수정 (Fertilization)은 접합자(zygote)를 형성하기 위해 반수체(haploid)의 두 배우자(gamete)가 융합되는 현상이다. 즉, 난자와 정자가 융합하여 개체의 발생이 시작되는 과정이다. 수정은 난관의 팽대부에서 이루어지며, 정자가 난관에 도달하여, Capacitation을 통해 수정 능력을 획득하고, 정자가 난자의 zona pellucida을 뚫는 첨체반응 (Acrosome reaction)이 일어나, 정자와 난자가 접합되어 수정란을 형성하는 과정이다.순서대로 수정 과정을 정리하면, 난소에서 성숙한 난자가 난관으로 배란되고, 사정된 정자가 난자에서 분비되는 수용성 물질에 의해 화학적으로 유인되어, 자궁경관, 자궁을 통해서 난관의 팽대부로 이동한다. 정자는 난관의 팽대부로 이동하는 과정 중에 Capacitation을 통해 운동성과 ZP3 수용체 민감도 증가 등의 수정 능력을 획득한다. 수정 능력을 획득한 정자가 난자의 zona pellucida의 ZP3 glycoprotein를 인식하여 결합하고, 정자의 첨체에서 Acrosin 등의 효소를 분비하여 투명대를 녹이고 통과할 수 있는 능력을 획득하는 첨체반응이 일어난다. 이때, ZP3 glycoprotein는 정자와 난자의 최초 인식 및 결합을 유도하여, 첨체 반응을 유도하는 투명대의 당단백질이다. 정자가 투명대를 물리적으로 침투하고, 정자의 머리가 난자의 세포막과 융합하여, 정자 핵이 난자 안으로 들어간다. 난자는 정자 진입 직후, 난자 세포질의 피질 과립이 외부로 분비되어 투명대를 화학적으로 변화시켜, 다른 정자의 추가 진입을 방지하여, 다수정을 억제한다. 이후 난자와 정자의 핵이 각각 존재하다가, 융합하여 zygote을 형성한다.투명대(zona pellucida)는 포유류 난자를 둘러싸고 있는 3를 연결해주는 역할과, 구조 안정화 역할을 담당하고, ZP2는 정자와 결합 후, 수정이 일어날때까지 정자의 결합을 유지한다. ZP3는 정자의 초기 결합 수용체로, 첨체 반응을 유도하는 역할을 수행한다. 또한 수정 후 ZP2 단백질 구조가 변화되어 다른 정자의 결합을 차단하고, 이를 통해 다수정 방지 기능을 수행한다.Mouse의 평균 임신기간은 약 19~21일로 vaginal plug 확인일을 0.5일, 수정일로 기준하여 임신 단계를 계산한다. 이에 따르면, 수정은 0.5일에 잔행되고, 초기분열기는 1.5~3.5일로 2-cell → morula → blastocyst 를 형성한다. 4.5일에는 자궁내막에 착상을 시작하고, 5.5~7.5일에는 내배엽, 외배엽 구분이 시작되는 초기 배아 형성이 시작된다. 이후 기관형성기, 태아 성장기를 거쳐서 19~20.5일에 출산이 된다.실험 목적과배란을 유도한 암컷 mouse와 수컷 mouse를 자연 교미시켜 체내 수정 후, 2-cell embryo를 채취하여 관찰한다.실험 재료샘플Male mouse, female mouse시약PMSG 호르몬 주사, hCG 호르몬 주사, KSOM, 70% ethanol, oil기구dish, center well dish, dissecting microscope(NIKON SMZ645), dissecting tools (핀셋, 가위), insulin syringe, gloves, 호일, 네임펜, mouth Pipettes, Pipette tips, Pasteur pipetteFemale mouse실험 도구dissecting microscope실험 방법mouse 과배란 유도PMSG 호르몬 주사를 복강 내에 주사한다.PMSG 호르몬 주사 후 44~48시간 뒤, hCG 호르몬 주사를 복강 내에 주사한다.자연 교미 유도hCG 호르몬 주사 후 약 12시간 뒤 (야간에), 암컷과 수컷이 자연 교미하여 체내 수정할 수 있도록 합사를 진행한다.암컷과 수컷 mouse의 합사 다음날 아침, 암컷 mouse의 va양쪽에 놓는다.반대손으로 mouse의 꼬리를 잡고, mouse를 잡아당기면, 두개골로부터 첫번째 경추를 분리시켜 안락사 시킨다.Mouse 해부배쪽 외부 생식기 윗 부분을 가위로 절단한 후, 가죽을 머리와 꼬리 쪽으로 잡아 당겨 배부위와 흉부를 감싸고 있는 근육이 드러나게 한다.내장의 원형을 유지하면서, 내장을 감싸는 근육층을 절개하여 체강 내 기관계를 드러낸다.소화기관계를 체강 밖 한 쪽으로 몰아 놓는다.암컷 Mouse에서 oviduct(난관)을 적출한다.(2-cell embryo를 채취하기 위해서는, oviduct를 매우 깔끔하게 적출 해야 한다.)암컷 Mouse의 oviduct2-cell embryo flushing암컷 Mouse에서 적출한 oviduct를 KSOM 배양액이 담긴 center well dish로 옮긴다.insulin syringe에 KSOM 배양액을 채운다.해부현미경 하에서 핀셋과 insulin syringe을 이용하여, oviduct의 infundibulum을 찾는다.핀셋으로 고정하고, infundibulum에 insulin syringe를 끼운다.insulin syringe를 통해 KSOM 배양액을 서서히 주입하여 난관 안의 2-cell embryo를 밀어낸다.Oviduct에서 빠져나온 2-cell embryo를 mouth Pipettes에 Pipette tips과 Pasteur pipette를 결합한 도구로 선별하여, Oil과 KSOM 배양액이 담긴 dish로 옮긴 후, 현미경으로 관찰한다.실험 과정 ‘4’실험 과정 ‘5’실험 과정 ‘6’실험 결과과배란을 유도한 암컷 mouse와 수컷 mouse를 자연 교미시켜 체내 수정 후, 암컷 Mouse에서 적출한 oviduct에서 2-cell embryo를 채취하여 현미경으로 관찰하는 실험을 진행했다.PMSG 호르몬 주사, hCG 호르몬 주사를 통해서 과배란을 유도하고, 수컷 mouse와 체내에서 수정되어, 2-cell embryo이 존재하는 oviduct를 해부현미경 20X로 관찰했다. Oviinge를 통해 KSOM 배양액을 서서히 주입하여, 난관 안의 2-cell embryo을 flushing한 후, 2-cell embryo를 선별하여 현미경100X로 관찰했다. 약 4개 정도의 2-cell embryo와 약 2개 정도의 Zygote 가 관찰되었다. 관찰된 2-cell embryo들은 투명한 원형의 투명대 안에 검정색에 가까운 진한색의 2개의 원형 핵이 삽입되어 있는 형태로 관찰되었다.dissecting microscope (NIKON SMZ645)Oviduct (20X)Flushing 직후2-cell embryo (80X)2-cell embryo선별 후 (100X)2-cell embryo선별 후 (확대)고찰이번 실험에서는 oviduct에서 2-cell embryo를 flushing하기 위해, PMSG 호르몬 주사 후 44~48시간 뒤, hCG 호르몬을 주사하고, hCG 호르몬 주사 후 약 48시간, 수정 후 약 1.5일째에 암컷 mouse에서 oviduct를 채취했다.배란 주기를 판독하지 않은 자연 상태의 5~6마리의 암컷mouse와 성적으로 성숙된 수컷을 합사하였을 경우, mouse가 임신할 확률은 약 10% 정도로 매우 낮은 확률이다. (배란 주기가 약 5일이고, 교미 기회가 12~16시간일 경우이다.) 따라서, 자연 배란 주기에 따라 배란되는 난자로 실험을 진행하기에 어려움이 존재하기 때문에 PMSG 호르몬 주사와, hCG 호르몬 주사로 과배란을 유도하여 많은 수의 성숙난자를 배란 시킨 후, 자연 교미를 유도하여 실험을 진행했다.Mouse의 평균 임신기간은 약 19~21일로 vaginal plug 확인일을 0.5일, 수정일로 기준하여 임신 단계를 계산한다. 이에 따르면, 수정은 0.5일에 잔행되고, 초기분열기는 1.5~3.5일로 2-cell → morula → blastocyst 를 형성한다. 4.5일에는 자궁내막에 착상을 시작하고, 5.5~7.5일에는 내배엽, 외배엽 구분이 시작되는 초기 배아 형성이 시작된다. 이후 기관형성기, 태아 성장state gland), 응고선(coagulating glands) 등의 분비물로 구성되어 암컷의 vaginal 입구에 일시적인 막처럼 존재한다. vaginal plug는 교미 직후 수시간 내에 형성되며, 보통 12~24시간 이내에 자연적으로 사라진다. . vaginal plug 가 주요한 지표인 이유는 Mouse는 야행성이기 때문에, 교미는 주로 밤에 이루어지고, 이로 인해 실험자가 정확한 수정시간을 직접확인하기에 어려움이 존재한다. 따라서 vaginal plug 관찰을 통해 물리적으로, 간접적으로 교미 시점과 수정 가능성을 예측할 수 있다. vaginal plug를 확인한 날을 0.5일로 설정하고, 다음날인 1.5일에 2-cell embryo를 회수 할 수 있다.적출한 oviduct에 insulin syringe를 통해 KSOM 배양액을 서서히 주입하여, 난관 안의 2-cell embryo을 flushing한 후, 2-cell embryo를 선별하여 관찰한 결과 투명한 원형의 투명대 안에 검정색에 가까운 진한색의 2개의 원형 핵이 있는 것으로 확인되었다. 2-cell embryo 속 검정색에 가까운 어두운 색의 원형 핵들은 apoptosis가 일어난 것으로 보인다. (정상적인 2-cell embryo은 세포질 색이 투명하거나 연한 색으로 관찰된다.)2-cell embryo에서 apoptosis가 일어난 원인은 2-cell embryo 채취 후 온도 변화, pH 변화, 배양액의 삼투압 이상, 산소 과다 노출 등의 이유로 체외 환경으로 부터 많은 스트레스를 받은 것 때문으로 추정된다. 이 외에도, 수정 과정 중에 난자와 정자의 품질 문제, 핵 DNA의 손상이나, flushing 과정 중에 조작 상 부주의로 인한 기계적인 데미지 등도 영향을 미쳤을 수 있다고 판단된다.KSOM 배양액 위에 oil을 덮어 oil drop dish를 이용하여 실험을 진행했다. Oil은 KSOM 배양액의 수분 증발을 차단하고, 기체 접촉을 차단하여 pH를 안정적으로 유지하는데 도움을 193)

자연과학| 2026.03.12| 9페이지| 2,500원| 조회(14)

PMSG, hCG, oviduct, Embryo collection, 2-cel..

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생화학실험 만점(A+) 실험 보고서(레포트) 9. 단백질 정량

생화학실험 REPORT제목: 단백질 정량날짜: 24.11.18실험 목적단백질의 양을 정량하기 위해서 단백질 뿐만 아니라 시료 안에 포함되어 있는 다른 성분들의 본질, 정량 분석의 신속도 및 정밀도 등에 따라서 적절한 방법을 선택하여야 한다.단백질 정량법들에 대해 학습하고 각각의 장단점을 숙지한 후, 단백질의 종류와 특성에 따라 적합한 방법을 선택하여 실험한다.실험 재료 및 기구ELISA 기기, e-tube, RIPA buffer, BSA standard, BCA protein assay reagent (A, B), 96-well plate, Micropipette & Tip, 10주차에 분리한 단백질 샘플 (LNCaP에서 분리)BSA standardBCA protein assay reagentELISA 기기방법BCA kit를 준비한다.BCA solution (standard curve)용 e-tube를 5개 (1000, 500, 250, 125, 0) 준비한다.BSA standard (2mg/ml) 용액을 ‘1000, 500, 250, 125, 0’ (mg/µl)으로 RIPA buffer로 희석한 뒤, 각각 e-tube에 30µl씩 넣는다.BCA protein assay reagent A:B=50:1을 계산한다.(12개의 well에 200µl씩 mixture를 넣을 것이므로, 총 2400µl의 mixture가 필요하다. 여분을 생각하여, A 2500µl + B 50µl으로 mixture를 제작한다.)계산한대로 A 2500µl와 B 50µl를 혼합하여, A, B mixture를 만든다.96-well plate에 단백질 샘플을 포함해 각 샘플 당 10µl씩 duplicate loading한다. (총 12개의 well)A, B mixture를 각 well에 200µl씩 넣는다.상온에서 호일을 감싸 5분 둔다.480 filter에서 흡광도를 측정한다.실험 과정 - 3실험 과정 - 5실험 과정 - 7실험 결과96-well plate에 단백질 샘플과 BSA standard 용액들을 10µl씩 duplicate loading하고, A, B mixture를 각 well에 200µl씩 넣은 후 480 filter에서 흡광도를 측정하는 실험을 진행했다.실험 결과 480 filter에서 측정한 평균 흡광도는 BSA 1000에서 1.113, 500에서 0.781, 250에서 0.5955, 125에서 0.4675, 0에서 0.394, 단백질 샘플의 평균 흡광도는 1.7535로 측정되었다.측정한 흡광도 값을 토대로 그린 분산형 그래프의 식은 ‘y=0.0007x+0.3977’이며, ‘R2=0.9962’로 나타났다.123456789101112O.D1.1221.1040.7790.7830.5940.5970.4940.4410.3940.3941.781.727O.D 측정 결과BSA O.D 그래프실험 원리(배경) 및 실험 고찰실험 원리(배경)단백질 정량(Protein quantification)은 시료 내에 함유된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정으로, 크게 Colormetric(비색법)법과 Electrophoresis(전기영동)법으로 분류된다. Colormetric법은 색 시약을 통해 빛의 특정 파장의 흡광도를 측정하여 화학 화합물, 용액의 농도를 정량하는데 사용되며, 대부분의 단백질 정량에서 사용되는 방법이다.대표적인 단백질 정량법으로 BCA (Bicinchoninic acid), Biuret법, Lowry법 (Folin Ciocalteau), Bradford 법, 자외선 분광광도법 등 총 5가지 방법이 존재한다.BCA (Bicinchoninic acid) 정량법은 샘플에 존재하는 단백질 농도에 비례하여 흡광도가 결정되는 비색법으로, 두 단계의 반응으로 20-2000 ug/ml 범위에서 사용된다. 단백질 구리 이온 복합체를 형성하며, 562nm 에서 흡수하는 강렬한 보라색 을 띠는 Cu BCA 킬레이트를 형성한다. 민감하고 정확한 분석번이라는 장점이 있으나, 색상은 시간이 지나면 안정적이지 못하기 때문에, 분석과 흡광도 측정 사이의 시간을 주의 깊게 조절해야 한다는 단점 등이 존재한다.브래드포드 또는 쿠마시 블루 정량법은 농도 범위 20-2000 ug/ml에서 사용하는 정량법으로, 음전하를 띤 쿠마지 블루 염색은 양전하를 띤 단백질을 결합한다. 아르기닌, 트립토판, 티로신, 히스티딘, 페닐알라닌 잔류물에 결합하여, 용액 속에서 염색하면 빨간색으로 변하고 465nm에서 흡수하는 반면, 단백질의 염기성 아미노산과 결합하면 파란색으로 변하고 595nm에서 흡수한다는 특징이 있다. 흡광도 측정값을 표준 곡선 값과 비교하여 샘플의 단백질 농도를 결정하게 된다. 빠르고 간단하다는 장점이 존재하며, SDS나 Triton X 100과 같은 세제와는 호환되지 않는다는 단점이 있다. 또한 웨스턴 블롯 실험 시, BCA법과 더불어 가장 많이 사용되는 단백질 정량법이다.Lowry법은 농도 범위 10-1000 ug/ml에서 단백질을 정량하는 방법으로, Cu N 복합체 형성 단계와 티로신과 트립토판 복합체는 폴린-시오칼토 시약과 반응하여 650-750nm를 흡수하는 청록색을 생성하는 단계, 총 2단계로 나뉘어 진행된다. 매우 민감하고 정확한 분석법이나, 트리스, EDTA, DDT, 2-머캅토에탄올, 탄수화물 등 일반적으로 사용되는 특정 화학 시약과는 호환되지 않는다는 단점이 있어 자주 사용되지 않는다.Biuret법은 농도범위 0.373-80 g/L에서 사용되는 단백질 분석법으로, 염기성 매질에서 펩타이드 결합의 Cu2+와 NH 그룹 사이에 착색된 복합체가 형성된다는 점을 이용하는 방법이다. 생선된 흡광도는 540nm에서 확인하며, 반응의 민감도가 매우 낮아 혈청과 같은 고농도의 단백질을 정량화할 때만 사용된다는 단점이 있다. 또한, 빠른 시간 내에 단백질 정량이 가능하며, 단백질을 분석하는 가장 간단한 방법이다.자외선 분광광도법 (ULTRAVIOLET (UV) ABSORPTION)은 농도범위 0.1 100ug/ml에서 흡광도 280nm에서 트립토판과 티로신의 특성 흡수도를 측정하여 샘플에 존재하는 단백질의 양을 정량하는 방법이다. 빠르고 비교적 민감한 반응이라는 장점이 있으나, 세제나 변성제를 사용하는 단백질 추출 방법과 동시에 사용할 수 없고, 단백질에 대한 특정적인 방법이 아니라는 단점이 존재한다.실험 고찰96-well plate에 단백질 샘플과 BSA standard 용액들을 10µl씩 duplicate loading하고, A, B mixture를 각 well에 200µl씩 넣은 후 480 filter에서 흡광도를 측정하는 실험을 진행했다.측정한 흡광도 값을 토대로 그린 분산형 그래프의 식은 ‘y=0.0007x=0.3977’으로 나타났다. 도출된, ‘y=0.0007x+0.3977’을 통해서 단백질 샘플의 흑광도 값을 가지고, 단백질 양을 구할 수 있다. 위 식에서 y는 흡광도를 의미하고, x는 단백질의 농도를 나타낸다. 측정한 단백질 샘플의 평균 흡광도는 1.7535이므로, ‘1.7535-0.3977=0.0007x’ 가 성립하므로, 계산하면 ‘함유된 단백질 양’=x=1936.857 임을 알 수 있다. 즉, 단백질 샘플 속에는 1936.857µg/ml = 1.9369 µg/µl의 단백질이 함유되어 있다.웨스턴 블롯팅 등의 추후 실험 진행을 위해서는 30µg의 단백질을 함유하는 용액의 µl를 구할 수 있어야한다. 비례식을 사용하면, ‘1.936:1=30:x’ 식이 성립하므로, 30µg의 단백질을 함유하는 샘플 단백질의 µl는 15.4887µl 임을 알 수 있다.측정한 흡광도 값을 토대로 그린 분산형 그래프에서, R2값은 ‘0.9962’로 나타났다. R2값은 1에 수렵하는 값으로, R2이 0.99 이상이 되어야, 실험 결과를 신뢰할 수 있다. 이번 실험에서 R2값이 0.9962로 0.99 이상의 값으로 도출되었기 때문에, 측정한 값들이 신뢰 가능하다는 것을 알 수 있다.이번 실험에서 여러 단계에 RIPA buffer를 사용했는데, 이는 실험에 사용한 단백질 샘플을 지난 실험에서 추출할 때 RIPA buffer를 사용했기 때문이다. 실험을 원활하고, 동등한 조건에서 진행하기 위해, 모두 동일한 조건인 RIPA buffer를 사용한 조건으로 세팅해서 실험을 진행한 것이다.6조(우리 조)를 제외한 다른 조(5조 등)의 실험 결과를 확인해보면, 단백질 샘플 흡광도 평균은 3.2775이고, BSA 0의 흡광도 평균은 0.8755임을 알 수 있다. 이는 6조의 결과와 그래프의 추세를 비슷하지만, 5조의 측정값이 6조의 약 2배라는 사실을 확인할 수 있다. 이러한 결과가 나온 원인을 짐작해보자면, 공용으로 준비된 A, B mixture 시약이 소진되어, 6조만 다른 A, B mixture을 사용했을 수 있다. 또한, 피펫팅 오류로 다른 조에 비해 적은 양을 각 well 속에 옮겼기에 나타난 결과일 수도 있다고 생각한다.참고문헌김미리,최보희,김현정,조은비,최현아,and 홍정일. "단백질 정량 발색반응에 미치는 Zinc Protoporphyrin의 영향." 자연과학연구논문집 24.- (2012): 57-64.조영호. "BCA 정색반응을 이용한 새로운 세포독성 분석법 개발과 항암제 탐색을 위한 그 이용." 국내석사학위논문 建國大學校大學院, 1992. 서울 PAGE PAGE - 1 -

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킬레이트, Lowry, 단백질 정량, ELISA, BCA, Bradford, RIP..

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생화학실험 만점(A+) 실험 보고서(레포트) 4. LB 배지 만들기

생화학실험 REPORT제목: LB 배지 만들기날짜: 24.10.07실험 목적: 대장균의 형질 전환을 위한 배지를 준비한다.실험 재료 및 기구: LB broth, Bacto agar, 250mL 비커, D.W(500ml), Autoclave, 멸균테이프, 호일, 전자저울, 네임펜, peri dish, 약 숟가락, Ampicillin전자저울, LB broth, 비커Autoclave방법LB 배지 만들기 (100mL)Autoclave 돌릴 때, 넘칠 것을 방지해서, 250mL 비커를 준비한다.비커에 D.W 100mL와 LB를 2.5g (100mL 기준) 넣어준다.비커 입구를 호일로 막고, labeling을 한 뒤 멸균 테이프를 붙인다.Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균한다.(121°C까지 Autoclave 온도가 상승하기 위해서는 약 1시간 30분 정도의 시간이 소요된다.)LB plate 만들기 (500mL)과정 ‘가’ 방법으로 액체 LB 배지를 제조한다.Agar를 1.5%가 되게, 7.5g (500ml 기준) 넣는다.삼각 플라스크 입구를 호일로 막고, labeling을 한 뒤 멸균 테이프를 붙인다.Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균한다.(121°C까지 Autoclave 온도가 상승하기 위해서는 약 1시간 30분 정도의 시간이 소요된다.)Labeling한 petri dish에 autoclave 돌린 LB media를 agar가 굳지 않을 정도로 식힌 후 (약65°C ~ 70°C) 50 ug/ml Ampicillin을 넣고 섞는다.과정 eq oac(○,4) 용액 500mL에 Ampicillin을 농도 50 ug/ml가 되도록 넣어야 한다.X : 500mL=50ug : 1mLX = 2500ugX = 25mg 이다.실험에 사용한 Ampicillin 농도는 10mg/mL 이므로, 25mg을 첨가하기 위해선 Ampicillin 10mg/mL를 2.5mL 넣어야 한다.과정 eq oac(○,5)의 용액을 petri dish 3분의 2만큼 붓는다.굳힌 plate는 뒤집어 랩을 씌운 후 4℃ 냉장고에 보관한다.실험 과정 ‘가 eq oac(○,2)’실험 과정 ‘가 eq oac(○,3)’실험 과정 ‘나 eq oac(○,5)’실험 결과LB 배지 (100mL)와 LB plate를 제조하는 실험을 진행했다.LB 배지 (100mL)를 만들기 위해 D.W 100mL와 LB를 2.5g 넣고 Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균 결과, 투명한 노란색의 액체 배지가 만들어졌다.LB plate를 제조하기 위해 액체 LB 배지와 Agar 7.5g를 섞어, Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균하고, Ampicillin 10mg/mL를 2.5mL을 첨가한 결과 투명하고 붉은 갈색 용액이 제조되었다. 제조된 용액을 petri dish 3분의 2만큼 붓고, 굳혔더니 젤리 같은 질감으로 굳은 것으로 관찰되었다.LB 배지LB plate실험 원리(배경) 및 실험 고찰실험 원리(배경)배지는 미생물이 생장하기 위해 필요한 각종 영양소를 공급해지는 물질로, 미생물의 종류, 생리적 조건 및 실험 목적에 따라 미생물의 영양요구성에 맞는 적절한 배지를 선택해야 한다. 종류로는 미생물의 대량 배양, 생화학적 연구, 대사산물 연구에 주로 사용되는 액체 배지와, 액체 배지에 한천(agar), 젤라틴 등을 넣어 응고시킨 고체 배지가 존재한다. 고체 배지는 주로 대부분의 미생물이 대사 과정에서 사용하지 못하는 한천을 이용하는 방법이 가장 이상적이며, 미생물 보존 배양, 순수 분리 등에 사용된다.LB 배지 (Luria-Bertani broth)는 박테리아 성장에 주로 사용되며, 효모로부터 추출되어 미생물이 생장하는데 필요한 여러 가지 영양물질이 함유된 효모 추출물, 우유단백질인 카세인을 분해하여 단백질 공급원이 되는 Tryptone, 배양할 세포가 삼투에 의하여 터지지 않도록 해주는 염화 나트륨을 첨가하여 만들어진다. 액체 LB 배지에 한천을 첨가하면, 고체 배지로도 사용할 수 있다.대표적인 배지 구성 성분들로는 물, Tryptone, 효모추출물 (Yeast Extract), 염화나트륨 (Nacl), 한천(Agar) 등이 있다. 물은 배지성분의 95% 정도이며 증류수나 탈 염수를 사용한다. Tryptone은 박테리아가 성장하는데 필수적인 아미노산을 공급하는 질소 공급원이다. 효모 추출물 (Yeast Extract)은 효모에서 추출시킨 물질로서, 박테리아가 생장하는데 필요한 각종 영양소 탄소원, 질소원, 비타민 등이 들어있다. 염화나트륨(Nacl)은 배지의 내의 삼투압을 맞추기 위해 첨가하며, 특정 박테리아 균주 및 원하는 배양 조건에 따라 삼투 조건이 달라지며 삼투압이 맞지 않을 경우에는 박테리아균이 변형되는 상황이 발생하기도 한다. 또한 세균의 신호전달 체계에 필요한 이온을 공급하는 목적으로도 첨가한다. 한천(Agar)은 고체배지를 만들기 위해 넣어주는 물질로서, 액체 상태의 배지에 넣게 되면 배지를 젤리처럼 굳혀지게 한다. Agarose 전단계로 홍조 해초에서 얻어지며 포도당주 성분으로, 0.4~0.8% 에서 액체 배지를 반고체로 만들어 배양체의 지지력을 제공한다.실험 고찰이번 LB 배지 (100mL)와 LB plate를 제조하는 실험을 진행할 때, 고체 LB 배지인 LB plate를 제조할 때 ampicillin 항생제를 첨가했다. Ampicillin은 베타락탐 항생제의 페니실린 그룹에 속하고, 아미노페니실린 계통의 물질로, 박테리아의 세포막 합성을 저해하는 메커니즘으로 살균 한다. 이런 Ampicillin을 고체 배지를 제작할 때 첨가하여 박테리아나 효모 등에 의한 오염을 사전 예방하는 목적으로 사용했다. 다음 실험 시간에 배양할 대장균은 항Ampicillin 성분이 포함되어 있기에, 오염되지 않고 실험할 박테리아만 특이적으로 배양할 수 있다. Ampicillin 항생제를 배지에 첨가할 때, 배지가 충분이 식은 상태일 때 첨가하여, Ampicillin이 열에 의해 데미지를 얻지 않도록 해야 한다. 또한, Ampicillin과 같은 항생제를 첨가하여 배지를 제작하면, 항생제 비첨가 배지보다 보관기간이 짧아지기 때문에, 위 사실을 인지하고 실험 방법을 결정해야 한다.액체 LB 배지 (100mL)를 섞고, Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균하기 전에 비커에 멸균 테이프를 붙였다. 멸균은 화학물질 혹은 열에 대해 저항성이 높은 내생 포자를 포함한 미생물을 제거하거나 사멸시키는 과정으로, 미생물 실험에서 가장 기본적이고 중요한 과정이다. 이번에 사용한 멸균 방법은 습윤 멸균법으로 온도, 압력 및 시간 조절이 가능한 Autoclave (고압 증기 멸균기)를 사용하여 고압 포화 수증기를 이용해 멸균하는 방법이다. Autoclave를 사용하여 멸균할 때, 멸균 상태 확인을 위해서, 멸균 정후의 색상 변화를 나타내는 멸균 테이프를 사용했다. 멸균이 제대로 되었다면, 흰색이었던 멸균 테이프가 검정색으로 변하게 된다.참고문헌이종호 “의생명과학 실험서. 상권”, 국내서 단행본, 서울 : 라이프사이언스, 2021 (p.4-7)신경옥 “(이해하기 쉬운)생화학 실험”, 국내서 단행본, 서울: 파워북, 2014 (p.126-133)

자연과학| 2025.02.28| 5페이지| 2,500원| 조회(274)

ampicillin, agar, LB plate, LB 배지, autoclave, LB broth

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생화학실험 만점(A+) 실험 보고서(레포트) 5. 박테리아 형질전환

생화학실험 REPORT제목: 박테리아 형질전환날짜: 24.10.14실험 목적:대장균의 유전형질을 플라스미드를 이용하여 형질전화 시키고, 형질전환 된 대장균을 선택하는 과정을 이해한다.실험 재료 및 기구:Water bath (42℃), incubator(37℃), alcohol spray, paper towels, alcohol lamp, glass spreader, ice, pcDNA 3 plasmid DNA, micro pipette, pipette tip, 3 ㎖liquid LB/ampicillin(50 mg/㎖) in a culture tube, E.coli competent cells 1 tube(50µl), LB/ampicillin platemicro pipette, pipette tip 등E.coli competent cells방법박테리아 (E.coli competent cells)를 얼음에서 천천히 녹인다.1 µl의 DNA를 박테리아에 넣은 후 1-2회 살살 탭핑한다.박테리아를 30-60분 얼음에 넣는다 (Plasmid와 박테리아가 붙을 수 있는 시간을 줌). (이번 실험에서는 생략하고 진행한다.)박테리아를 42°C 에서 45 sec 동안 heat shock을 준 후 얼음에 넣는다 (2분).박테리아에 LB 배지 1 ml 넣은 후 37°C 에서 1시간 배양한다.박테리아 100µl를 LB/ampicillin plate에 깔아준 후 37°C 인큐베이터에서 밤새 배양한다.다음날 LB/ampicillin plate에서 자라난 박테리아를 확인한다.실험 과정 - 4실험 과정 – 5실험 과정 - 6실험 결과E.coli competent cells과 Plasmid을 넣고, heat shock을 준 후에 LB 배지에서 배양하는 실험을 진행했다.1주일 후 LB 배지에서 배양된 박테리아를 관찰했더니, 배지에 골고루 균형적으로 배양된 것으로 보인다. 또한, 투명한 배지 위에, 불투명한 하얀색 작은 원형의 모양으로 박테리아들이 배양되었다.실험 결과실험 원리(배경) 및 실험 고찰실험 원리(배경)형질 전환 (transformation)이란 원래의 세포가 지닌 유전자와 다른 종류의 유전자가 존재하는 DNA 사슬 조각이나 플라스미드가 세포 사이에 침투하여 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합하여, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 형상이다. 형질전환은 세균에서 흔히 관찰되며 인공적으로 유전자 조작을 통해서 발생시킬 수도 있다.세포가 외부의 유전물질인 DNA를 받아들여 형질이 전환되는 과정은 크게 3가지로 구분되는데, 첫번째로 형질전환 (transformation)은 세포가 외부의 DNA를 세포막을 통해 직접 받아들이는 것이고, 두번째로 형질도입 (transduction)은 바이러스에 의해 외부 유전자가 세포 내로 운송되는 과정이며, 마지막으로 접합 (conjugation)은 두 개의 박테리아 사이의 접합 과정에서 접합관을 통해 한 세포에서 다른 세포로 DNA가 옮겨가는 과정이다.플라스미드(plasmid)는 염색체 이외에 많은 박테리아에 존재하는 작은 원형의 DNA로, 세균이 살아가는데 필수적인 유전자 외, 세균 숙주의 생활사나 생장에 중요한 역할을 하는 유전자가 존재한다. 플라스미드 내부에 복제원점(replication origin)이 있어 세균 염색체와는 별도로 복제가 가능하다는 특징이 존재한다. 플라스미드는 유전자 재조합 기술에 널리 활용되고, 세균에서 항생제 내성을 전파시키는 역할을 한다는 점에서 중요하다.실험 고찰E.coli competent cells과 Plasmid을 넣고, heat shock을 준 후에 LB 배지에서 배양하는 실험을 진행했다.이번 실험에서 박테리아로 E.coli competent cells을 이용하여 실험 했는데, competent cells은 E.coli cell이 DNA를 uptake할 수 있는 상태, 즉 competent한 상태로 만든 세포를 의미한다. E.coli competent cells 중 DH5α를 이용하여 실험을 진행했다.이번 실험에서는 pcDNA3 plasmid DNA를 사용하여 진행했다. pcDNA3 plasmid DNA에는 bgh-PolyA와 F1, SV40 같은 ori, Ampicillin과 Neomycin 등의 항생제 등이 존재한다.‘박테리아에 LB 배지 1 ml 넣은 후 37°C 에서 1시간 배양하는 실험 과정’ 중 액체 LB 배지가 담긴 비커와 박테리아가 담긴 e-tube를 열고 닫을 때 알콜 램프 주위에서 진행했다. 액체 LB배지와 박테리아를 오픈하여 이동하는 과정에서 오염에 취약하고, 오염이 발생할 가능성이 존재하기에, 이 오염을 예방하기 위해 알콜 램프 주변에서 소독하며 실험을 하였다. 알콜 램프를 사용하는 방법 외에도 오염을 예방하기 위해서 70% 에탄올 사용 등의 다양한 방법을 사용할 수 있을 것 같다.‘박테리아 100µl를 LB/ampicillin plate에 깔아준 후 37°C 인큐베이터에서 밤새 배양하는 실험 과정’ 중에서 배지에 박테리아를 ‘spread plate technique’ 방식으로 깔았다. 이 때, 박테리아를 깔기 위해서 유리 막대를 알콜 램프를 이용해 따뜻하게 만들고, 핀셋으로 모양을 잡아 꺾어, 삼각형 모양으로 만든 후 박테리아를 LB/ampicillin plate에 얇고 균일하게 깔았다.참고문헌신경옥, ”생화학 실험”, 국내서 단행본, 서울: 파워북, 2014, p.126-133이종호, “의생명과학 실험서. 상권”, 국내서 단행본, 서울 : 라이프사이언스, 2021, p.4-11, 22-24 PAGE PAGE 20

자연과학| 2025.02.28| 4페이지| 2,500원| 조회(100)

플라스미드, E.coli, plasmid, Conjugation, Transfo..

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