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PCR 예비레포트

PCR32****66생명과학과 김**1. 목적 : 한 학기동안 진행될 유전자 클로닝을 위해 이전에 선정한 특정 유전 자를 제작한 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한다.2. 재료 및 방법1) 재료- 실험기구 : PCR 기계, PCR용 튜브, 파이펫(20, 200, 1000 μl 용), 팁(200, 1000 μl용), PCR용 튜브 랙(rack), 네임펜, 원심분리기-실험시약 : 10x 버퍼, dNTP (ATP, TTP, GTP, CTP) 혼합물(mixture), 증류수-시료 및 준비물 : Taq 중합효소(Taq Pol), 주형(template) DNA, Forward 프라이머, Reverse 프라이머, 폴리글러브(poly-glove)2) 방법(1) PCR 용 튜브 랙에 필요한 개수의 PCR 용 튜브를 꽂는다.(2) 네임펜을 이용하여 튜브 벽면 및 뚜껑에 적당한 이름을 적는다.(3) 파이펫 및 팁을 이용하여 각 튜브에 아래의 내용물을 잘 넣고 섞는 다(그림 5). 섞을 때 내용물이 튜브 안쪽 벽면에 튀지 않게 주의하고, 섞은 후 원심분리기로 내용물을 튜브 아래쪽으로 침전시킨다. 이 때 마지막 볼륨 50 μl는 주형 DNA와 Taq 중합효소를 넣고 증류 수로 맞춘다.(4) 튜브를 PCR 기계에 넣고 프로그램을 아래처럼 셋팅한다. 사이클 수 는 필요에 따라 2번 단계에서 결정한다. 프라이머와 주형 DNA 결합 을 위한 온도는 2번 단계의 Annealing에서 결정한다.

자연과학| 2023.11.06| 1페이지| 1,000원| 조회(200)

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PCR purification 예비레포트

PCR purification32****66생명과학과 김**1. 목적 : 작은 DNA 조각을 정제하는 원리를 이해하고, 작은 DNA 조각을 정제하는 방법들을 숙지한다. 그리고 Column을 이용한 DNA 정제 방법을 사용하여 PCR product를 정제한다.2. 재료 및 방법1) 재료- PCR product 정제 kit(본 실험계획은 ㈜바이오팩트의 ‘Gel & PCR purification system for PCR purification’을 기초로 구성되었으나 다른 공급자의 kit 을 사용할 경우 해당 제조사의 protocol을 활용해야 함) Kit의 구성품인 buffer (UB, WB, EB)와 spin column, collection tube- ethanol (100%, 80%, 70%)- Tabletop centrifuge2) 방법(1) 정제할 DNA를 포함한 Gel 부분을 잘라낸다. Gel Block을 1.5㎛ micro tube로 옮기고 무게를 측정(2) Gel Block의 3배 volume UB 첨가. Gel이 완전히 녹은 후 Gel Block volume의 Isopropanol 혼합.(3) Spin column을 2㎛ Collection tube에 장착. Step 2의 Solution을 Spin column에 첨가 -> cfg(7000 rpm, 30 sec) 내려간 Solution은 버리고 Spin column 다시 장착(4) Spin column에 WB(80% Ethanol) 750㎛ 첨가 -> cfg(13000 rpm, 30 sec) 내려간 Solution 제거 -> Spin column 다시 장착 -> 동일한 방법으로 한번 더 Washing(5) cfg(13000 rpm, 3 min ? 공회전) -> Collection tube 제거. Spin column을 새로운 1.5㎛에 장착

자연과학| 2023.11.06| 1페이지| 1,000원| 조회(283)

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Ligation & Transformation 예비레포트

Ligation & Transformation32****66생명과학과 김**1-1. 목적 : 유전자 클로닝과정 중 재조합 DNA를 만들기 위한 실험으로, 원하는 유 전자 (insert DNA)를 vector DNA에 삽입하기 위한 실험 방법으로, DNA ligase 효소를 이용하여 insert DNA와 vector DNA를 연결하여 재조합 DNA를 확보하고자 한다.1-2. 재료 및 방법1) 재료- DNA 말단이 제한효소로 처리된 insert DNA, vector DNA, DNA ligase, DNA ligase buffer, D.W, 37℃ 항온기 혹은 항온수조, 피펫, tip, 1.5ml microtube, Vortex, centrifuge2) 방법(1) 정해진 공식을 통해 50ng의 vector DNA를 사용 할 때 1:1의 비율 이 되는 insert DNA의 양 (ng)을 구한다.(2) Vector DNA : Insert DNA의 비율을 1:5, 1:10 등으로 한정된 DNA 양을 이용해 가능한 비율을 정한다.(3) 1.5ml microtube에 Vector DNA. insert DNA, DNA ligase, DNA ligase buffer를 넣어 준 뒤 D.W를 이용해 최종 10ul volume으로 맞춘다.(4) Tapping 혹은 vortexing으로 잘 섞어 준 뒤 spin down 한다.(5) 37℃ 항온기에서 1시간동안 ligation을 한다.(6) 반응이 끝난 tube는 ice 혹은 4℃에서 보관한다.2-1. 목적 : 재조합 DNA 혹은 특정 유전자를 안정적으로 보관하기 위해 대장균에 형질전환하여 원하는 유전자를 보유하고 있는 대장균주를 만들기 위한 실험 방법으로 실험 원리와 방법을 알아보고자 함.2-2. 재료 및 방법1) 재료- 1-1 실험을 통해 확보한 ligation된 DNA, 제한효소 처리되지 않은 vector plasmid DNA, CP cell, 42℃ dry bath, 37℃ shaking incubator, 37℃ 항온기, 스프레더, LB 배지, Agar plate (vector DNA가 보유하고 있는 항생제 저항성 유전자에 대한 항생제를 함유한 agar plate), 알코올 램프, Centrifuge2) 방법(1) Ligation된 DNA, uncut vector plasmid DNA 10ng (양성대조군)을 CP cell에 넣어 준 뒤 가볍게 tapping 하여 섞어 준 뒤 ice에서 30분 간 반응한다. 음성 대조군으로 CP cell에 DNA 대신 D.W를 넣어 준다.(2) DNA와 반응시킨 CP cell을 42℃ dry bath에서 90초간 열충격을 가 한다.(3) Ice에서 2분간 열을 식혀 준 뒤 LB 배지 1ml을 첨가한다.(4) 37℃ shaking incubator에서 shaking 한다. (Ampicillin 저항성 유전자 : 30분 / Kanamycin 저항성 유전자 : 1시간)(5) 13000rpm으로 1분간 centrifuge하여 CP cell을 down하여 pellet 형태로 만든 후 약 100~200ul LB 배지만 남겨두고 상층액을 제거한다.

자연과학| 2023.11.06| 2페이지| 1,000원| 조회(147)

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CP cell 예비레포트

Competent Cell32****66생명과학과 김**1. 목적 : DNA가 자발적으로 대장균 내로 들어가는 것은 그 효율이 매우 낮다. 따라서 높은 효율로 DNA를 대장균 내로 투입시키려면 여러 가지 인위 적인 조작이 필요하다. 이번 단원은 외부에서 조작된 DNA를 대장균 내 로 주입시키는 효율을 높이기 위한 방법 중의 하나로 대장균을 전처리 하는 과정을 숙지하는 것을 목적으로 하는 실험이다.2. 재료 및 방법1) 실험 기구 및 시약(1) 실험 기구:삼각 플라스크, 피펫 (1mL, 5mL, 10ml, 25 mL), 피펫 에이드, Bench-top 원심분리기, 초고속 원심분리기, Ice Bucket, 37℃ 세균 배 양기, Polypropylene tubes, Sovall GSA rotor(2) 시약들 :CaCl2·2H2O (1M): 이 보관 용액을 사용 직전에 10 배 희석하여 사용하 고, 0.45 μm pore size를 갖는 membrane filter로 여과하여 사용할 것MgCl2-CaCl2 용액(ice-cold; 80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2)LB 배지2) 방법(1) 실험 하루 전 날: Agar plate에 있는 대장균 콜로니를 이쑤시개로 pick-up하여 15mL Falcone tube에 5 mL의 LB 액체 배지에 접종하여 3 7℃ 에서 진탕하며 overnight 배양을 한다.(2) 실험 시작 2시간 전: 멸균된 100 mL LB 배지가 담긴 1 L 삼각플라 스크에 1 mL overnight 배양액을 넣고 강한 진탕 상태로 2시간 배양한 다. 그 후 흡광도를 측정하여 OD600 값이 0.4~0.6이 되면 배양을 멈추 고, 배양액을 50 mL 씩 Falcon tube에 동량씩 분액한 후, 얼음에 담아 10분간 보관한다.(3) 그 후 배양액이 담긴 Falcon tube를 미리 4 ℃온도로 냉각시켜 놓 은 초고속 원심분리기에서 2700 g (Sovall GSA rotor 에서 4100 rpm) 로 10분간 회전한다.(4) Tube를 원심분리기에서 꺼낸 후 상등액인 배지를 버리고 paper towel에 tube를 거꾸로 세워 1분간 방치하여 잔류하는 배지를 전부 제 거 시킨다.단국대학교 분자생물학과 - 79(5) Tube에 남아있는 세포를 30 mL의 얼음에 냉각된 MgCl2-CaCl2 용액 으로 부드럽게 vortexing하여 분산시킨다. (이 때 너무 강하게 vortexing 하면 세포가 파괴되기 때문에 주의를 요함)

자연과학| 2023.11.06| 2페이지| 1,000원| 조회(89)

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아가로스겔 예비레포트

Agarose Gel 전기영동32****66생명과학과 김**1. 목적 : Restriction digestion 및 uncut plasmid를 통해 cloning 되었는지 확인하는 단계로서 band shift 및 insert 유무를 agarose gel을 통해 서 확인한다.2. 재료 및 방법1) 재료- 실험기구 : 전기영동장치, 전자레인지, 삼각플라스크, 메스실린더, 유산지, pipette, 저울, gel cast set, comb.- 시약들 : Agarose, 1X TAE, 6X BPB dye.2) 방법(1) 1X TAE buffer를 메스실린더 이용하여 25ml~40ml을 측정한 뒤, 삼 각플라스크에 옮긴다.(2) Agarose를 필요한 저울을 통해 무게를 측정한다.(3) Agarose를 1X TAE 가 들어있는 buffer에 부어서 잘 섞어준다.(4) 1~2분정도 전자레인지에 돌린다.(만약 덜 녹았을 시 집게로 천천 히 돌려주고 10초정도 더 돌린다.)(5) Pipette을 이용하여, EtBr을 tip 끝에 살짝 묻힌 뒤, Agarose gel 에 살짝 찍어준다.(6) Agarose gel을 틀에 천천히 따라주고, 30분 이상 굳힌다.(7) 다 굳은 gel의 comb을 제거한 뒤, 1X TAE buffer가 차있는 gel tank에 gel cast를 담근다.(8) parafilm위에 Mini-prep DNA 및 Restriction digestion 이 끝난 DNA sample을 5㎕와 6X BPB dye 1㎕를 섞어주어 6㎕를 각 well에 걸어 준다.(8) Sample loading을 마치면, 110V로 electrophoresis를 수행한다.

자연과학| 2023.11.06| 2페이지| 1,000원| 조회(168)

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