꿈을비는마음 스토어

꿈을비는마음

개인인증

팔로워0 팔로우

소개

등록된 소개글이 없습니다.

전문분야 등록된 전문분야가 없습니다.

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

6개
전체 판매량

17개
최근 3개월 판매량

0개
자료후기 점수

평균D
자료문의 응답률

-

전체자료 6개

Genotyping(PCR, Gel electrophoresis) A+ report 평가D별로예요

Mouse 조직에서 Genomic DNA 검출 및 PCR & DNA gel electrophoresis 이화여자대학교 1. Introduction -Objective 실험 대상 mouse의 유전적 정보를 확인하기 위해 수행된 실험으로, 해당 mouse의 유전적 배경을 파악하는 것을 목적으로 진행되었다. 이를 위해 유전체 DNA를 추출하여 특정 유전자나 유전적 마커를 분석함으로써 실험 대상 mouse의 유전적 특성을 확인하고자 하였다. 이러한 실험 접근법은 실험 동물의 유전적 배경을 이해하고 실험결과를 해석하는 데에 중요한 역할을 한다. 또한, 이 실험은 특정 유전자나 유전적 변이를 발견하고자 할 때도 사용할 수 있다. 특정 유전자의 존재 여부나 특정 변이의 유무를 확인하고자 할 때, 해당 유전자의 유전체 DNA를 추출하고 PCR을 통해 증폭하여 분석 가능하다. 이는 유전적 변화를 연구하거나 질병 관련 유전자를 탐색하는 등의 목적으로 유용하게 활용될 수 있다. -Principle 및 Theory 가. Genotyping Genotyping은 유전형질을 분석하는 방식이다. 두 가지 인상의 시료로부터 유전체의 DNA를 얻고, 이들이 염기서열이나 유전체 구조상으로 어떻게 다른가를 확인하여 genotype으로 구별하고자 하는 실험법이다. Genotyping의 3 steps는 일반적으로, 1.DNA추출, 2.target DNA증폭, 3.Run agarose gel(Genotyping분석) 단계로 진행된다. DNA를 sample에서 추출하고, PCR를 이용하여 특정 DNA를 amplification시킨다. 그 후, 주로 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 조사하여 genotyping 분석을 한다. 나. Genomic DNA Genomic DNA(gDNA)는 긴 이중사슬로서, 핵 내에 존재하는 유기체 내의 chromosomal DNA이다. gDNA는 A, T, G, C의 염기쌍들이 유전정보를 저장하며 사람의 경우에는 32억 개 이상의 염기쌍을hanesulfonic acid)): 양쪽 이온성 유기화학적 완충제로, pH를 안정화시켜 DNA가 외부환경의 변화에 덜 민감하도록 안정성을 유지시켜주는 역할을 한다. * Proteinase K: Endopeptidase K라고도 하며, Serine 분해효소이다.. DNA, RNA purification동안 DNA, RNA를 분해할 수 있는 핵산분해효소를 불활성화시키며, 단백질을 분해하거나 핵산 정제 시 발생할 수 있는 오염물질을 제거하기 위해 사용된다. 바. Negative vs. positive control의 개념 Negative control: 조작변인에 기인한 종속변인이 발생하지 않을 것이라고 예상되는 대조군. 고로, 실험에서 관심 있는 결과를 얻기 위해 실험 대상이 아닌 샘플을 포함한 대조군이다. 주로 실험조건에 영향을 주지 않는 대조군으로, 실험에서 나타나는 결과가 조건에서 비롯된 것인지, 무작위나 시스템적 오류에서 비롯된 것인지를 확인하는 데에 사용된다. Positive control: 조작변인에 기인한 종속변인이 발생할 것이라고 예상되는 대조군. 고로, 실험의 유효성과 신뢰성을 확인하기 위해 사용되는 대조군이다. 예상되는 결과를 얻을 수 있는 샘플을 포함하며, 실험 조건이나 방법이 올바르게 작동하는지 확인하고 예상된 결과를 얻을 수 있는지를 확인하기 위해 사용된다. Positive control의 결과가 예상대로 나타나면, 실험의 유효성이 확인되고, 실험결과의 신뢰성이 높아진다. 사. WT type/ Knock-out/ Hetero, Homo type의 개념 WT type(Wild type): 자연상태 혹은 일반적인 유전형을 나타낸다. 어떠한 돌연변이도 가지고 있지 않은 원래의 형태를 말한다. Knock-out: 특정 유전자가 완전히 제거되거나 비활성화된 상태를 말한다. 특정 유전자의 기능을 targeting해서 유전자가 무효화되도록 하는 유전자 조작 기술로, knockout한 유전자의 기능을 연구하기 위해 사용된다. Hetero type(Het라고 labelling ⑥ ⑤번 과정에서 꺼낸 tube에 A.W(Autoclave water)를 넣는다 ⑦ 10x buffer와 2mM dNTP가 덜 녹았다면 손으로 녹인다 ⑧ 10x buffer와 2mM dNTP를 tapping해서 섞어준다 ⑨ 10x buffer와 2mM dNTP를 spin down 해준다 PCR buffer를 충분히 만드는 이유? : PCR buffer는 1.pH조절, 2.이온조절, 3.액체부피조절, 4.안정성 강화의 역할을 한다. PCR 반응 용량을 적절히 조절하여 원하는 목표 농도로 반응 조성물을 조절할 수 있다. PCR buffer를 충분히 만드는 이유는 일관된 결과를 얻기 위함이다. 충분한 양의 buffer를 사용하면 pH, 이온농도 등을 정확하게 제어할 수 있으며, PCR 반응의 효율성과 정확성에 큰 영향을 미친다. 또한, 여분의 buffer를 사용하면 실험 중에 용액의 증발이나 오염 등의 문제에 대처할 수 있기 때문이다. 자. Gel electrophoresis의 원리 전기영동은 DNA의 크기, 전하, 구조에 따라 분리하는 방법이다. DNA는 구조상 Backbone의 Phosphate group을 가지고 있어 전기영동에 사용되는 buffer 안에서 음(-)전하를 띄고 있다. 그래서 전기영동 시, (+)극으로 움직이는 원리를 가진다. DNA의 분자량이 클수록, Gel 농도가 높을수록 Agarose나 Polyacrylamide 같은 Gel matrix 사이를 지나는 DNA 분자의 속도는 느려진다. Agarose gel은 해상도는 낮지만, DNA 단편을 200bp~50kb까지 분리할 수 있고, 사용이 간편하며, 다루기가 쉬워 가장 많이 사용되는 전기영동이다. Agarose는 조류 ‘홍조강(Rhodophyceae)’이라는 해초로부터 추출된 복합 다당류로 선형 중합체의 형태를 하고 있다. Agarose gel을 TAE buffer에 녹여 gel이 굳은 후에 사용된다. Gel이 굳는 동안 agarose는 matrix 형태가 되고, 그 밀도구대상이다. PCR 조건 PASKIN 1) PCR Reagents 조건 -Template : 2 μl -Primer①(PASKIN-S-1): 0.5 μl -Primer②(PASKIN-WT-AS-1): 0.5 μl -Primer③(PASKIN-KO-AS-1): 0.5 μl -dNTP : 1 μl -10X buffer : 1 μl -Taq polymerase : 0.2 μl -DW : 4.3 μl -> Total : 10 μl 2) PCR기계 조건 ① 94℃, 2min ② 94℃, 30sec ③ 60℃, 30sec ④ 72℃, 1min X 30cycles (②,③,④) ⑤ 72℃, 5min ⑥ 4℃, ∞ * Primers Sequence -PASKIN-S-1 : CCT AGC AAG TGA CCT GTG AC -PASKIN-WT-AS-1 : GTC TGA GAG GAT GTT GTC CC -PASKIN-KO-AS-1 : GTC CTC CAG TCT CCT CCA C * PASKIN은 PAS domain serine-threonine kinase으로, c-AMP와 관련된 신호전달 경로와 관련이 있다. PASKIN은 c-AMP 신호를 감지하고 이에 반응하여 세포 생존, 성장, 분화 등의 과정에 관여한다. 2% Agarose gel preparation (2개 만들기: SIRT1, PASK) ① 삼각 플라스크에 0.5X TAE buffer 100ml 넣고, agarose gel powder를 2g을 혼합해준다. ② 삼각 플라스크의 입구를 랩으로 덮은 뒤에 Microwave에 30초 동안 녹여준다. (3번 반복) ③ 혼합물이 다 녹았는지 확인한 후, 데워진 열기를 약 5min간 식혀준 뒤에 20000x StaySafe Nucleic Acid Gel Stain 5µl을 혼합해준다. * EtBr은 발암물질이라 위의 staining dye를 사용하는데, 열에 약하기 때문에 식힌 후에 넣는다. ④ gel틀에 혼합한 agarose gel을 부어준다. ⑤ 샘플 개수에 맞게 17 c일반적으로 ready-to-use상태여서 사용하기에 편리하다는 점을 가지고 있다. 또한 Marker DNA ladder에는 확인하려는 sample을 비교하는 데 사용할 수 있는 알려진 분자량의 band가 있기에, gel의 첫 번째 well에 넣어야 한다. PASK의 전기영동 실험에서 sample buffer를 sample과 5:1비율에 맞게 원래는 2µl 넣어줘야 하는데, 실수로 sample buffer 4μl를 넣게 되었다. 그래서 그런지, 결과사진에서 PASK의 band가 SIRT1의 band에 비해 더 얇고 옅게 나와있음을 볼 수 있다. 하지만 육안으로 band가 어느 위치에 있는지 구분할 수 있는 정도여서 다행히 결과분석에 큰 영향을 미치진 않았다. 그리고 band가 일정하게 일렬로 내려가지 않은 것은 sample loading 과정에서 깔끔하게 주입되지 않아 sample이 주변의 well로 흘러 들어갔거나, gel이 균일하게 제조되지 않았거나, 전기영동을 했을 때 전기장의 분포, 전압, 전류, 온도 등의 요인이 일정하고 균일하지 않아서 라고 본다. Positive control은 실험에서 기대되는 결과를 보장하기 위해 사용되는 샘플이며, 전기영동 실험에서 실험의 정확성과 신뢰성을 확인하는 데 중요한 역할을 한다. 결과사진에서 SIRT1과 PASK에서 positive control band가 나타났으므로 실험이 올바르게 수행되었음을 알 수 있다. 결과의 band들을 분석해보면, SIRT1의 경우 WT가 500bp이고 KO는 800~900bp이다. 그리고 PASK의 경우 WT는 414bp, KO는 290bp이다. Hetero type의 경우 band가 두 개 이상 나와야 하기 때문에 band가 1개인 경우는 WT나 KO 중 하나이다. 먼저 SIRT1의 band를 분석하면, 2개의 band가 나온 4~6번 sample은 hetero type이며, 900bp와 그 밑의 500bp band들로 이루어져 있음을 유추해볼 수 있다. 이로써 1~3번 sample은 90

자연과학| 2024.07.02| 17페이지| 3,500원| 조회(175)

PCR, 전기영동, Genomic DNA, DNA extraction, geno..

미리보기

닫기
이화여자대학교 생과실3 A+ report

항체 생성 반응(Antibody production)유도와 항체 확인 및 정량분석 이화여자대학교 1. Introduction -Objective 이 실험은 면역 반응 중 B cell의 Antibody 생성을 통해 이루어지는 체액성 면역 반응에 대해 다룬다.이 실험의 목적은 Stimulator 조건에서 WEHI cell(mouse B cell)에 TD antigen과 TI antigen을 넣고 B세포를 활성화시킨 후, sandwich ELISA technology로 B세포에서 분비된 항체의 농도를 standard curve를 통해 측정하는 것이다. -Principle 및 Theory 가. B lymphocyte activation의 과정 체액성 면역반응은 비장, 림프절 등에서 특이적 항원과 만나 결합한 B cell이 그 항원에 대한 항체를 생성하여 분비하면 그 항체가 체내를 돌아다니는 방식으로 진행된다. 이를 통해 T cell을 비롯한 각종 선천 및 후천 면역반응의 면역세포가 활성화된다. 체액성 면역반응에는 크게 T cell과 B cell이 관여한다. B cell은 Bone marrow(BM)에서 생성되고 성숙하는 반면, T cell은 BM에서 생성되어 Thymus에서 성숙한다. 활성화된 B cell은 class switching과 친화력 성숙과정을 거쳐 plasma cell과 memory cell로 분화한다. Plasma cell이 직접적으로 antibody를 분비하고, memory cell은 antibody를 세포표면에 부착시킨 채로 존재하여 다음에 같은 항원이 재차 침입했을 때 빠르게 반응할 수 있는 면역적 기억을 형성한다. B세포는 활성화되면서 증식하게 되는데, 결과적으로 클론확장과 분화가 일어나며, 항체를 생산하는 plasma cell과 memory B cell이 생성된다. 항원은 naïve 성숙 B cell의 IgM, D와 결합하여 B cell을 활성화시킨다. B cell의 activation은 Antigen specific cell의 증식과 분화를 이끌고, memory B cell과 Antibody 분비 plasma cell이 되도록 만든다. Naïve B cell은 특이적 항원과 결합한 후 활성화되고 항체를 생성, 분비한다. 항체의 구조를 살펴보면, light chain과 heavy chain으로 이루어져 있으며 각각의 chain들은 공유결합인 이황화결합으로 서로 연결되어 있다. Heavy chain과 light chain은 각각 V(Variable), C(Constant) 영역으로 나뉘어져 있으며, IgM 등 복합체를 이루어 존재하는 항체는 J chain을 통해 각각의 단량체들이 연결되어 있다. B lymphocyte가 생성하는 항체의 종류에는 IgM, IgG, IgA, IgD, IgE가 있고, 이 중 IgM과 IgA는 복합체로 존재하며 나머지는 단량체로 존재하여 항체의 종류마다 크기가 다르다. 생산되는 항체의 양과 종류는 면역반응을 유도하는 항원의 종류, T cell의 관여 여부, 이전에 항원에 노출되었던 이력과 활성화가 일어난 해부학적 부위에 따라 달라질 수 있다. Naïve B cell이 항원과 만날 때, 항원의 종류에 따라 TH cell의 도움을 받는 것에 대한 여부가 다른데, Thymus-dependent(TD) 항원과 만나게 되면 B세포는 우선 세포의 표면에 위치하던 IgM을 통해 그 항원을 인식하여 세포 내부로 신호를 보낸다. 이후 동일한 항원을 MHC2를 통하여 helper T cell에 인식시켜 TH cell이 활성화된다. TH cell 의 CD40L과 B cell의 CD40이 결합함으로써 secondary signal이 B세포 내부로 전해진다. 이런 일련의 과정을 통해 두 가지의 신호를 받아 최종적으로 B세포가 활성화된다. 반면에 LPS, capsule polysaccharide 등 Thymus independent(TI) antigen이 체내에 침입할 때에는 또 다른 방식으로 B세포가 활성화된다. 이 경우 B세포의 활성화 과정에 TH cell이 관여하지 않는다. LPS와 같은 TI antigen들은 대부분 크기가 상대적으로 크기 때문에 표면의 항원결정기인 epitope 또한 상대적으로 B세포에게 더욱 많이 보일 수 있다. 따라서 TH cell이 따로 개입하지 않아도 두 가지의 신호가 충분히 도달하여 B세포가 활성화될 수 있다. B세포가 특이적 항원을 만나 활성화 된 후 일어나는 class switching 과정에 TH cell이 관여한다. TH cell이 분비하는 cytokine에 의한 것이다. 따라서 TD antigen이 B세포와 반응하는 경우에만 첫 번째로 분비되는 IgM 이외의 IgG, IgA 등 다른 종류의 항체들을 생성한다. 나. ELISA technique의 원리 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)는 T세포 또는 B세포의 활성화에 의해 분비된 항체와 cytokine을 항원-항체 반응과 효소활성을 이용하여 정량화하는 기법이다. 이 실험에서 사용되는 것은 Sandwich ELISA 기법으로, 실험 순서는 1. Coating/Capture 2. Plate blocking 3. Probing/Detection 4. Signal measurement로 진행된다. 실험에 사용되는 항원에 특이적인 1차 항체를 plate에 부착한 후 항원을 넣은 뒤, 그 항원과 결합하며 특정 효소와 결합되어 있는 2차 항체를 다시 넣어주는 방식으로 진행된다. Plate 위에서 항원을 사이에 두고 두 가지의 항체가 각각 붙기 때문에 Sandwich ELISA라 불린다. 두 번째로 넣어주는 항체와 conjugated 된 효소로는 alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase 등이 사용된다. 이 효소들을 통해 반응이 끝나고 나타나는 color 또는 absorbance를 통해 항체의 유무와 농도를 알아낼 수 있다. 특히 standard curve를 통해 실험에서 사용된 효소가 반응한 농도와 이미 알고 있는 항체의 정량 값을 비교하여 분비된 항체의 농도를 측정할 수 있다. 또한 ELISA는 streptavidin과 biotin의 친화력을 통해 신호를 증폭할 수 있다. biotin을 항체의 heavy chain의 Fc region에 붙인 후 streptavidin을 효소에 결합시키면 streptavidin과 biotin의 친화력에 의해 항체에 효소가 붙는 것을 이용하는 것이다. 다. Standard curves with known concentrations of antibody (Standard curve 이론) Plate reader를 통해 항원-항체 반응 및 효소의 활성을 통한 색 변화를 감지할 수 있고, SoftMax software를 통해 standard curve를 생성한 후 실험결과 항체의 농도를 계산하고 비교하여 분비된 항체의 농도를 측정할 수 있다. x축은 평균 흡광도, y축은 표준농도로 standard curve 그래프를 만든다. 일반적으로 표준 곡선은 표준희석농도가 높을수록 흡광도가 정점에 도달하는 sigmoidal 모양을 갖는다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 선의 방정식(y=mx + b)과 값을 생성한다. 값은 데이터가 추세선과 얼마나 밀접하게 일치하는지 나타내는데, 값이 1에 가까울수록 Standard 신뢰도가 높다. 일반적으로 좋은 standard curve는 1. 0.95≤값≤1, 2. Blank의 값

자연과학| 2024.07.02| 13페이지| 3,000원| 조회(223)

antibody, 생명과학실험, ELISA, standard curve, B c..

미리보기

닫기
MTT assay A+ report

세포 증식능 분석 – MTT assay이화여자대학교1. Introduction-ObjectiveHematocytometer를 이용하여 세포 수를 측정하고 계산한다.MTT assay 실험 원리를 바탕으로 세포 생존 및 증식을 측정하는 방법을 이해한다.-Principle 및 TheoryCell counting 시 사용되는 Trypan blue의 입자는 세포막을 확산의 방법으로 통과하여 세포 내부로 유입된다. 살아있는 세포는 ATP 에너지를 이용한 exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 방출하지만, 에너지를 생산할 수 없는 죽은 세포는 exocytosis를 할 수 없어 청색으로 염색된다.MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막을 통과하여 대사적으로 활성을 갖는 세포에 의해 Formazan 결정으로 환원되고, 이는 자주색을 띄는 비수용성의 분자이다. 따라서 DMSO(Dimethyl sulfoxide)와 같은 유기용매에 의해 용해된 Formazan의 흡광도를 통해 세포의 증식과 생존율 및 미토콘드리아의 대사활성을 측정한다.가. MTT assay의 원리와 장단점, 응용 가능한 분야에 대하여 조사하시오.MTT assay는 세포대사 활성을 색 변화로 측정하는 실험으로 세포 독성 실험이라고도 한다. Tetrazolium salt인 MTT를 살아 있는 세포에 처리하면, 미토콘드리아 안의 oxidoreductase enzyme(NADPH)에 의해 환원되어 보라색을 띠는 formazan 결정체를 형성한다. 죽은 세포의 경우, 미토콘드리아가 터져 없으므로 formazan이 형성되지 않고, 색을 띠지 않는다. 이렇게 생성된 formazan은 비수용성으로, 유기용매 또는 계면활성제 등에 녹여 570nm에서 흡광도(세포의 탈수소효소 환원능력)를 측정한다. 이 때, 흡광도는 살아 있는 세포에 비례하여 증가하게 된다.MTT assay의 장점은 세포가 부in은 세포와 배양 플라스크 사이의 부착 단백질을 분해하여 세포를 부유 상태로 만든다. 이를 통해 세포를 수집하고 균일하게 분주하도록 도와준다.유기용매(Ethanol, DMSO): Formazan 결정은 세포 내에서 형성되기 때문에 직접 측정할 수 없는데, ethanol과 DMSO는 세포막을 투과할 수 있는 용매로, 이러한 formazan 결정을 용해하여 균일한 용액으로 만들어주어 formazan 양(흡광도)을 정확하게 측정할 수 있게 해준다.MTT 시약: MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 염색 시약은 세포 내의 활성 효소(미토콘드리아의 탈수소효소)에 의해 환원되어 불용성 formazan 결정을 형성한다. 살아있는 세포는 대사활성이 높아 MTT를 환원시킬 수 있지만, 죽은 세포는 불가능하다. 따라서 이 과정은 세포 대사활성을 반영하므로, MTT 시약은 세포 생존율 지표를 제공해주는 역할을 한다.2. Materials & Methods-Materials: HCT116 cell, Hematocytometer, 1x PBS, Trypsin-EDTA solution, Medium, 15ml conical tube, pipette, tip, trypan blue, 1.5ml microcentrifuge tube, optical microscope, centrifuge, 96well plate, MTT reagent(5mg/ml), incubator, DMSO, Ethanol, aluminum foil, microplate reader-간단한 methods(DAY 별로)[Day1] Hematocytometer를 이용하여 HCT116 cell수를 측정하고, 96well plate의 각 well 당 1x cells를 seeding한다. (in Triplicate)[Day2] 48h 배양 후, MTT assay를 진행하여 세포의 증식을 확인한다.-Cell counting: Cell countiin triplicate)② 세포를 37℃의 incubator에서 48h동안 배양한다.③ 대조군을 포함한 각 well에 MTT 시약(5mg/ml)을 10μl 첨가한다. (최종농도 0.5mg/ml)④ 호일로 감싸 빛을 차단하고, 1h동안 37℃의 incubator에서 반응시킨다.⑤ 배지를 완전히 제거하고 유기용매(50% Ethanol+50% DMSO)를 각 well에 100μl씩 첨가하여 용해시킨다.⑥ 전환된 염료가 완전히 녹도록 부드럽게 흔든다.⑦ 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측정한다.-Result1) Cell counting 결과를 바탕으로 cell density와 cell viability를 계산하고, 1x/well을 분주하기 위해 하나의 well에 필요한 세포 현탁액의 volume을 구하시오. (사진, 계산 과정 포함)▶cell density=3.15 x (cells/ml)▶cell viability=88.7%▶volume=3.17μl2) MTT assay 측정값을 바탕으로 그래프를 만들고, 이에 대한 결과를 해석하여 서술하시오. (평균, 표준편차 계산한 표와 그래프 포함)흡광도(570nm)1x10^42x10^41st0.511.0752nd0.540.8683rd0.520.847평균(avg)0.5233330.93표준편차(stdev)0.0152750.1260121 x 10^4 2 x 10^4결과를 보면 평균 흡광도가 1x10^4 cell 수는 약 0.52, 2x10^4 cell 수에세는 0.93으로, 2x10^4 cell 수에서의 흡광도 값이 1x10^4 cell 수에서의 흡광도 값보다 더 높다. 그리고 표준편차는 1x10^4 cell 수가 약 0.0153으로, 흡광도 측정값의 변동성이 적지만, 2x10^4 cell 수에서는 약 0.126으로, 흡광도 측정값의 변동성이 상대적으로 더 큼을 볼 수 있다.MTT assay를 통해 세포 활성을 측정할 때, 세포 수가 많을수록 흡광도 값이 증가한다는 것을 알 수 있다. MTT ass지면, 세포 간의 상호작용이 더 많아지고, 이로 인해 세포의 생리적 상태에 차이가 생길 수 있다.MTT assay 이외에도 세포 생존율, 세포 증식 및 활성을 측정할 수 있는 assay 종류 및 원리를 알고 싶어 더 알아보았다.1. XTT assayXTT(2,3-bis(2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide)는 MTT와 유사한 tetrazolium이다. 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 환원되어 수용성의 오렌지색 formazan 염을 생성하고, 이 formazan 염이 세포 배양액에서 용해되어 직접 흡광도를 측정할 수 있다. 수용성 formazan이기에 용해과정이 필요 없어 측정이 더 간편하다. 따라서 MTT assay에 비해 사용하기 쉽고 균류(곰팡이)연구에 더 적합할 수 있으며, MTT assay보다 민감성이 뛰어나고 다른 tetrazolium salt 기반의 assay들에 비해 사용 가능 범위가 넓은 편이다.2. WST-1 assayWST-1 (Water Soluble Tetrazolium Salt)도 tetrazolium 염으로, 세포 내 다양한 세포 효소(미토콘드리아 효소뿐만 아니라 다른 세포 효소들도)에 의해 환원되어 수용성의 황색 formazan 염을 생성한다. 용해 과정 없이도 흡광도 측정이 가능하여 실험이 간편하고, 비침습적으로 세포를 평가할 수 있어 다양한 연구에 사용된다. WST는 phenazine methosulphate(PMS)가 있는 상태에서 XTT 또는 MTS에 비해 더 안정적으로 유지된다. PMS electron mediator와 결합하는 경우, 세포 밖에서도 환원될 수 있고 MTT, XTT, MTS보다 민감성이 뛰어나다.3. MTS assayMTS(Methyltetrazolium Salt)도 tetrazolium 염의 일종으로, 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 MTS가 환원되어 수용성의 formazan 염을 생성한다. 이 formazan 으로 측정할 수 있다는 점을 이용하여 cell의 proliferation 정도를 측정한다.본 실험에서는 인간 대장암 세포주인 HCT116 cell을 사용하여 MTT assay를 통해 세포 생존력과 증식을 측정하였다. HCT116 cell은 KRAS 및 Tp53 돌연변이를 가지고 있어 대장암 연구에 널리 사용되는 모델이다. MTT assay는 세포의 대사 활성을 평가하는 방법으로, 미토콘드리아 효소에 의해 MTT가 formazan으로 환원되면서 발생하는 색 변화를 측정한다. 살아있는 세포에서만 이 반응이 일어나므로, 생성된 formazan의 양을 통해 세포 생존력과 증식도를 정량적으로 측정할 수 있다. 실험 결과, HCT116 cell의 생존력과 증식 정도를 성공적으로 측정할 수 있었으며, 이를 통해 HCT116 cell과 MTT assay는 대장암 연구에 유용한 도구임을 확인할 수 있었다.-ReferenceKim et al., Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters, Anal Biochem, 2015 Hyperlink "https://ko.wikipedia.org/wiki/MTT_%EC%96%B4%EC%84%B8%EC%9D%B4" https://ko.wikipedia.org/wiki/MTT_%EC%96%B4%EC%84%B8%EC%9D%B4 Hyperlink "https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/cell-proliferation-kit-i-mtt" https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-cs

자연과학| 2024.07.02| 10페이지| 3,000원| 조회(182)

assay, MTT assay, Cell Viability, hematocyt..

미리보기

닫기
actin filament 관찰 A+ report

세포염색 – actin filament 관찰이화여자대학교1. Introduction-ObjectiveFITC-conjugated phalloidin 사용하여 actin filament를 시각화하고, 세포의 모양과 구조를 관찰한다.형광 염색의 원리와 실험방법을 숙지하고, 형광현미경의 원리를 이해한다.-Principle 및 Theory가. 세포 내 actin filament의 기능과 배열 구조에 대해 서술하시오.Actin filament(미세섬유)는 세포 내 가장 풍부한 단백질 중 하나로, 원형질막 아래에서 지지 기능을 하고 세포 모양을 결정하며 세포의 이동을 도와준다.Actin filmament의 구조에 대해서 설명하자면, 세포 내에서 G-actin, F-actin 두 형태의 액틴으로 구성된다. G-actin은 구형 액틴(globular actin)으로 미세섬유의 기본단위이자 단량체이다. F-actin은 섬유성 액틴(filamentous actin)으로 actin protein이 중합하여 형성된 선형 filament로, 두 가닥의 G-actin 단위체가 꼬여서 이중 나선을 형성한다. 미세섬유는 양성과 음성말단이 있는데, (+)말단이 (-)말단보다 합성 및 분해속도가 빠르다. G-actin에 ATP가 붙어있을 때 결합력이 높은 상태가 된다. G-actin의 농도가 높으면 미세섬유 말단에 붙어있는 G-actin의 ATP가 가수분해되기 전에 다른 G-actin이 와서 붙으므로 ATP가 분해되지 못하고, 동적 평형이 될 때까지 미세섬유가 신장된다. 그러므로 G-actin의 농도가 높을수록, ATP가 많을수록 미세섬유는 신장된다.Actin filament의 기능은 여러 가지가 있다.① 미세섬유와 여러 단백질들이 교차결합을 형성해서 탄력 있는 세포막 근처의 구조를 만든다.② 소장 상피세포의 미세융모를 지지: 표면적을 넓혀 물질이 잘 흡수되도록 세포막을 융기시켜 미세융모를 형성한다.③ 근육운동: 미세섬유의 운동단백질인 ‘미오신’은 ATP를 쓰면서 미세섬유를 활주시켜 근수축이이 아닌, 고분자 및 oligomer 형태의 F-actin에 특이적 선택적으로 강하게 결합한다. Phalloidin은 F-actin을 안정화시켜 미세섬유의 탈중합을 방지한다. 이로 인해 세포 내에서 미세섬유의 동적 재구성이 억제되고, 미세섬유가 고정된 상태로 유지된다. Phalloidin은 형광염료와 결합할 수 있는데, 형광 표지된 phalloidin은 세포 내 미세섬유를 시각화하는 데 사용되고, 이를 통해 형광현미경을 이용해서 세포의 전체적인 모양과 세포 골격 구조를 관찰할 수 있다.Formaldehyde의 역할Formaldehyde는 단백질의 아미노 그룹(-NH2)와 반응하여 메틸렌 브릿지(-CH2-)를 형성하는 교차결합을 만든다. 세포 구조를 보존하고 분해를 방지하여 조직 샘플의 형태를 유지하고, 세포 내 구성 요소를 안정화시킨다. 이 실험에서는 actin filament sample을 고정하는 역할이다.Triton X-100의 역할Triton X-100은 방향족 탄화수소 소수성 그룹을 갖는 비이온성 계면활성제로, 화학명은 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol이다. Triton X-100은 세포를 용해하여 단백질 또는 소기관을 추출하거나 살아있는 세포막을 투과시키는 데에 사용된다. 세포막을 용해시키고 세포막 투과성을 높여 세포 내 내용물(actin filament)를 추출하는 데에 사용된다.BSA의 역할알부민(Bovine Serum Albumin)은 소 혈청에서 추출된 66.5kDa 의 알부민 단백질로 수용성이다. 이 실험에서 BSA는 Blocking reagent로 사용되며, 단백질 비특이적 결합을 방지하는 역할을 한다. Sample의 표면에 BSA를 coating하여 actin filament의 비특이적 결합을 방지하여 background를 정돈(제거)해준다고 볼 수 있다.2. Materials & Methods-Materials: PBS, 3.5% Paraformaldehyde, 0.5% Triton찰하는 원리에 대해 설명하시오.DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)는 cell의 핵을 염색하며, 푸른색 형광detection하여 염색된 알 수 있다. DAPI는 intact cell membrane을 투과하여 DNA와 binding하게 되고, 이때 358nm(자외선,UV) 정도의 파장대 빛을 흡수하여 blue~cyan 계통의 형광을 발한다. DAPI가 DNA에 binding하는 원리는 크게 두 가지로 나뉘어지는데, 1)AT rich region에 작용하는 minor groove에 결합하거나 2)intercalative binding에 의해서 일어나며, DAPI의 주된 DNA binding 방식은 minor groove binding이다. 형광 현미경에서 DAPI의 관찰과정 중 세포를 고정하기 위해 포름알데히드와 같은 고정제가 사용되고, 세포막의 투과성을 높여 DAPI가 세포 내로 쉽게 들어가도록 Triton X-100과 같은 계면활성제가 사용될 수 있다. 그리고 형광 현미경을 사용하여 자외선 광원(약 358nm)을 통해 DAPI를 excitation시키고, DAPI가 형광을 방출하면 형광방출필터(약 461nm)를 통해 blue 형광을 검출하여 이미지를 형성한다.FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate)는 형광을 발현하는 fluorescein과 반응성화합물 isothiocyanate group으로 구성되어 있다. FITC는 자외선 또는 청색광(약 495nm)의 빛을 흡수하여 에너지를 얻고, 약 519nm의 빛을 방출(형광)한다. 형광 현미경에서 FITC의 관찰과정 중 세포고정을 위한 포름알데히드와, 세포막 투과성을 높이기 위한 Triton X-100 계면활성제를 사용하여 FITC-conjugated phalloidin이 세포 내로 쉽게 들어가도록 한다. Excitation광원(약 495nm)을 통해 FITC를 excitation시키고, 방출필터(Emission filter; 약 519nm)를 통해 녹색 형광을 검출하 있다. Blue의 세포핵과 Green actin filament를 통해 세포의 형태와 골격구조 및 분포를 파악할 수 있다. 세포 내 actin filament가 세포 형태를 유지하고 지지하는 구조적 특징을 볼 수 있다.1,2,3 사진 모두에서 세포의 모양이 일정하고 고르게 분포되어서 나타나며, 세포핵과 세포질의 구조가 명확하게 관찰된다. Actin filament는 세포의 형태를 유지하고, 세포막 근처에서 더 뚜렷하게 나타난다. 이를 통해 actin filament는 세포의 외형을 지지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.5. Discussion형광현미경 관찰법과 과정: 세포를 관찰하기 위해 DAPI, FITC 등에 적절한 파장을 맞추고, 형광물질의 Excitation 및 Emission 파장에 맞는 filter를 선택하고, 또한 적절한 배율과 수치개구(Numerical Aperture;NA)의 대물렌즈를 선택한다. 세포를 현미경 스테이지에 놓고, 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞추고서 형광 신호가 잘 보이도록 조절한다. 이때, 대물렌즈 및 접안렌즈의 배율과 밝기를 맞춰가며 관찰하고픈 위치의 세포를 관찰한다. 그 뒤 노출 시간 등을 조절하여 형광 신호를 디지털 카메라를 이용해 최적의 이미지를 획득한다. 마지막으로 정량 및 구조분석을 할 수 있는데, actin filament의 형광 강도를 측정하여 특정 영역의 actin 농도를 정량적으로 분석할 수도 있고, actin filament의 배열과 길이, 분포 등을 분석하여 세포 골격의 구조적 특성을 볼 수도 있다.형광현미경의 분해능: 분해능이란 관찰할 수 있는 두 점 사이의 최소 거리로 정의되며, 현미경의 성능을 결정하는 중요한 요소이다. 분해능은 광원의 파장과 대물렌즈의 수치개구(NA)에 의해 결정되는데, Abbe 공식에 의해 근사적으로 계산할 수 있다.d: 분해능, λ: 빛의 파장, NA: 대물렌즈의 수치개구NA가 클수록, 파장이 짧을수록 분해능(d)는 작아지며, 이는 현미경의 성능 및 해상도가 높다는구성을 통해 방향을 바꾸고, 이동 속도를 조절한다.③ 세포분열: 세포질 분열(cytokinesis)동안 actin과 myosin이 함께 작용하여 수축환(contractile ring)을 형성하고, 이를 통해 두 딸세포로 분리한다.④ 물질운반: Actin filament는 세포 내 vesicle 및 organelle의 이동을 돕는다. myosin motor protein은 actin filament를 따라 이동하며, 이를 통해 세포 내 물질 운반을 조절한다.⑤ 신호전달: 세포표면수용체와 연결된 actin filament는 외부신호를 세포내부로 전달하는 역할을 한다.⑥ 세포 adhesion: Actin filament는 세포막을 통한 신호전달과 기계적 힘의 전달을 돕는다.FITC-Phalloidin 염색을 통해 세포질 내 actin filament의 분포와 배열을 명확하게 관찰함으로써, actin filament가 세포의 형태를 유지하고, 세포 외형을 지지하는 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 세포 밀도가 높아짐에 따라 actin filament의 배열이 더욱 뚜렷하게 관찰된 것을 바탕으로 actin filament가 세포 밀도가 높은 환경에서도 효과적으로 세포의 구조적 지지 역할을 하고 있음을 알 수 있다. DAPI 및 FITC-Phalloidin 염색기법은 세포핵과 세포골격을 동시에 관찰하는 데 매우 유용하며, 세포의 구조적 특성을 분석하는 데 중요하고 적합한 실험기법임을 알게 되었다. 이 실험을 하고서 향후 actin filament 외 microtubule(미세소관)과 intermediate filament(중간섬유) 세포골격(cytoskeleton)을 관찰하며 각 구성 요소의 형태와 기능 및 역할에 대해 알아가 보는 실험을 하고 싶다는 생각을 하였다.6. References Hyperlink "https://www.ksmcb.or.kr/file/webzine/2010_07_02.pdf" https://www.ksmcb.or.kr/fil233

자연과학| 2024.07.02| 9페이지| 2,500원| 조회(106)

형광현미경, 세포염색, dapi, FITC, actin filament, Trit..

미리보기

닫기
면역시냅스 형성 및 관찰 A+ report

면역시냅스(Immunological system)의형성과 관찰이화여자대학교Introduction-Objective면역 시냅스 형성 과정을 이해하고 이를 관찰한다.부연설명) naïve-T cell과 APC의 만남 뿐 아니라 self-antigen 또는 nonself-antigen을 표지한 thymus의면역 시냅상피세포와 naïve-T cell 사이에 형성되어지는 면역 시냅스는 우리 몸의 면연관용, thymocyte 발달 및 면역조절에 관여한다. 그리고 effector T cell과 표적세포 사이에 형성되는 면역 시냅스는 표적세포의 치사에 관여하고, effector T cell과 macrophage 사이에 형성되는 면역 시냅스는 cytokine 분비를 통해 macrophage activation에 관여한다. 그 외, T cell과 B cell 사이의 면역시냅스는 체액성 면역반응을 매개한다. 이렇게 면역 시냅스의 조절은 외부 침입자에 대한 인체의 면역 활성이나 자가-항원에 대한 면역관용에 깊게 관여하므로 면역학 연구에 핵심적이자 기본적인 실험이라 볼 수 있다.-Principle 및 Theory가. immune synapse의 생물학적 의미면역세포들 간의 상호작용 목적으로 밀착결합을 한 결합복합체를 말한다. 대표적으로 T lymphocyte와 APC(Antigen Presenting Cell) 간의 상호작용을 두 세포 간의 밀착결합(면역 시냅스)을 예로 들 수 있다. 체내에 들어온 Antigen을 APC가 T cell에게 제시함으로써 APC와 T cell간 매우 tight하고 넓게 결합한 상호작용이 일어난다. 이렇게 세포와 세포 사이에 tight한 접합을 하고 있는 것을 ‘Immune synapse’라고 한다.나. Immune system의 F-actin의 역할F-actin은 면역세포의 dynamics에 관여하는 분자로 접합부위의 구조를 지지함으로써 시냅스 구조체 형성 및 유지에 중요한 역할을 한다. f-actin뿐만 아니라 세포부착에 관여하는 분자(LFA-1/ICA서 immunological synapse의 형성을 관찰하기 위해서는 actin polymer가 얼마나 많이 형성이 되었는가를 파악하면 된다.다. APC에 의한 항원제시와 T cell activation 과정우리 몸에 Antigen이 들어오면 APC(macrophage, B cell, Dendritic cell)이 이를 receptor 혹은 non-specific한 방법으로 인식하여 자기 세포 안으로 끌어들여서 antigen을 조각조각 잘게 쪼갠다. 그런 뒤 MHC class molecule을 통해 조각 난 antigen을 T cell에게 전달한다. T cell 표면에 있는 T cell receptor(TCR)가 을 인식해서 결합하면 T cell이 activation되어 effector T cell로 분화해 증식하게 된다.Materials and Methods-Materials◦ 35mm Petri Dish◦ 18mm Cover slip◦ 1000ul, 200ul, 20ul, 10ul pipette◦ 집게◦ Poly-L-lysine◦ trypan blue : 단백질에 강하게 결합하는 생체 염색용 색소이다. living cell은 ATP E를 이용한exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 배출하나, dead cell은 ATP E를 이용하지않기에 exocytosis가 이뤄지지 않아 trypan blue 입자가 세포 안으로 유입되어 청색으로 염색된다. 고로, dead cell이 염색되고 living cell은 염색되지 않기 때문에 살아있는 세포와 죽은 세포(apoptosis나 necrosis 상태)를 구분하여 산정할 수 있다.◦ Anti-CD3/CD28 conjugation Beads◦ 0.8*10^6 Jurkat T cell◦ 1X Phosphate-buffered saline (PBS)◦ 4% Paraformaldehyde (PFA) Solution in PBS◦ 0.1% Trition X-100 Solution in PBS◦ 3% B란 모양으로 균일한 형태여서 suspension에서 쉽게 성장하고 실험 사용에 쉽고 용이하다.나. CD28/C 나. CD28/CD3 Bead를 왜 사용하였는가MHC와 TCR만 conjugate될 때 synapse를 형성할 수 없고, 그 외에 receptor들이 동시에 접합해야 신호전달을 할 수 있다. 고로 T cell이 activation되려면 TCR로부터의 signal만이 아니라, CD28/CD3 등으로부터의 signal이 동시에 요구된다. 이때 T cell의 CD28/CD3 분자와 APC의 costimulatory CD80/CD86과의 결합도 이루어져 T cell 활성화 신호가 더욱 강하게 전달될 수 있다. 고로 CD28/CD3 Bead를 사용하여 T cell의 CD28/CD3에 대한 antibody 역할을 하여 APC에 의한 생체 내 자극을 모방해 T cell expansion과 activation을 유도한다.다. 왜 cover slip을 ICAM1 coating하지 않고 Poly-L-lysine으로 coating 하였는가Poly-L-lysine은 합성 양이온 아미노산 중합체로, 고체 표면에 대한 세포 접착을 촉진하는 데에 사용된다. Poly-L-lysine은 positive charge를 띄고 있고, cell의 lipid membrane은 negative charge를 띄고 있으므로, 정전기적 결합에 의해 slide에서 cell이 잘 떨어지지 않게 해준다.-Protocol (면역시냅스 형성 및 고정)① Coverslip에 poly-L-lysine을 coating한다.② Jurkat T cell 0.3*10^6 cell에 0.3*10^6개의 bead-anti hCD3, CD28을 넣는다.③ 37도 incubator에서 15min, 45min incubation 한다.④ Cover slip에 cell을 분주한다.⑤ 4도에서 10min incubation 한다. (떠있는 cell을 가라앉히고 cover slip에 붙이는 과정)⑥ 4% PFA 900ul를 넣고0ul로 Blocking –RT 15min⑨ 1:100으로 희석한 phalloidin으로 F-actin staining 함 –RT 30min⑩ Mounting solution 분주 후 mounting⑪ 현미경으로 Immunological synapse 관찰* Hemocytometer를 이용한 세포 수 산정3. Results 및 Discussion-ResultsControl15 min45 min-Discussion가. Phalloidin의 역할Phalloidin은 F-actin과 binding하는 toxin이다. 팔로이딘은 액틴 단량체보다 액틴 필라멘트와 훨씬 잘 결합하여, 팔로이딘이 존재하면 액틴은 단량체보다 필라멘트 형태가 더 많아지게 되고, 팔로이딘이 결합하면 액틴 필라멘트의 (-)쪽에서 액틴 단량체가 잘 떨어져나가지 않게 된다. 고로, 액틴 필라멘트가 단량체로 분해되는 것을 방지할 수 있게 된다.나. 면역 시냅스의 생물학적 의미우리 몸에 pathogen(virus나 bacteria)이 침입했을 때, APC의 MHC가 인식하여 pathogen을 APC의 antigen receptor(B cell의 경우엔 surface immunoglobulin 등등)을 통해 잡아먹는다. 이후에 pathogen 구성 단백질을 peptide로 잘게 쪼개 T cell로 내보내는 데, 이 과정을 antigen & presentation이라고 한다. APC의 MHC가 pathogen을 인식하는 순간, TCR과 가 동시에 매우 tight하게 conjugate하게 되어 immunological synapse를 형성하게 된다. 이때 이 둘 사이의 작용만으로 synapse를 형성하는 것이 아니라, 그 외의 receptor(ICAM1/LFA1, CD80(86)/CD28)들이 동시에 접합해야 신호전달을 할 수 있다. APC와 T cell이 만났을 때 F-actin의 경우 많이 발현되어 immunological synapse를 형성하는데, 이를 이용하여 F-actin과 binding하는 phamune synapse를 형성하고, 시간이 지날수록 immune synapse 수가 증가함을 관찰할 수 있다.4. References Hyperlink "https://www.ksmcb.or.kr/file/webzine/2012_03_03.pdf" https://www.ksmcb.or.kr/file/webzine/2012_03_03.pdf (과학 특별기고; 면역 시냅스 연구의 배경과 의의) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5930005&cid=61233&categoryId=61233" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5930005&cid=61233&categoryId=61233 (네이버 지식백과) Hyperlink "https://kr.acrobiosystems.com/P4836-ActiveMax%C2%AE-Human-T-cell-ActivationExpansion-CD3CD28-Beads-premium-grade.html" https://kr.acrobiosystems.com/P4836-ActiveMax%C2%AE-Human-T-cell-ActivationExpansion-CD3CD28-Beads-premium-grade.html (acrobiosystem) Hyperlink "https://tmalab.co.kr/product/polyl-lysine-hydrobromide-mw-125k-01-aq-soln/5323/category/770/display/1/" https://tmalab.co.kr/product/polyl-lysine-hydrobromide-mw-125k-01-aq-soln/5323/category/770/display/1/ (tmalab) Hyperlink "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5930314&cid=61233&categoryId=61233" https://terms.naver.comes)

자연과학| 2024.07.02| 8페이지| 2,500원| 조회(90)

APC, immune system, immune synapse, T cell ..

미리보기

닫기