Stenotrophomonas maltophilia 유래Oleate Hydratase와Alcohol dehydrogenase의Enzyme cascade reaction서 론Enzyme Reaction Mechanism지방산 hydratase는 unsaturated fatty acids의 C-C 이중결합을 산화한다. 그 중 oleic acid을 10-hydroxysteric acid로 hydroxylation을 촉매하는 oleate hydratase(Ohys)는 비록 낮은 전환율을 가지지만, 체계적인 protein engineering 및 substrate scope의 범위를 넓히고 conversion rate를 높다는 이점으로 최근 산업적으로 특별한 관심을 받고 있다.[1] 본 실험에서는 Ohys 효소 계열 중 하나인 Stenotrophomonas maltophilia oleate hydratase(SmOhyA)의 enzymatic reaction에 대한 kinetic 분석을 진행하였다. SmOhyA는 cofactor로 FAD를 필요로하는 FAD-dependent enzyme이며, unsaturated fatty acids의 9-cis 위치 이중결합에 대해서 선택적으로 수화반응을 일으키는 regioselective hydration을 촉매한다. SmOhy는 특히 oleic acid에 가장 높은 특정 활성을 지니며, polyunsaturated fatty acids(PUFAs)에 대해서는 낮은 활성을 보인다는 특징을 가지고 있다. 효소 단백질의 크기는 대략 68kDa로 측정되며, pH 6인 환경에서 최적의 반응을 보인다. SmOhy의 효소 반응 메커니즘은 아직 구체적으로 밝혀진 바는 없지만, 같은 효소 계열의 Elizabethkingia meningoseptica Oleate Hydratase(EmOhy)와 Staphylococcus aureus Oleate Hatratase(SaOhy)의 반응 메커니즘을 통해 유추할 수 있다. EmOhy의 경우, active hy의 효소반응 메커니즘 분석을 통해, SmOhy는 다음과 같이 9,10번 이중결합을 regioselective hydration 시켜서 10번 탄소 위치에 -OH가 형성되는 것을 예측할 수 있다. 생성된 10-hydroxystearic acid와 Micrococcus luteus Alcohol dehydrogenase(M.luteus ADH)가 반응하면 10번 탄소 위치의 -OH는 ketone기로 전환된다.Figure 2. Staphylococcus aureus Oleate Hydratase의 Active site(좌)와 reaction mechanism(우)Target enzyme인 SmOhyA의 경우, NAD+를 cofactor로 사용하지 않기 때문에 NADH의 흡광도 측정을 통한 기질의 농도 분석은 불가능하다. SmOhyA의 enzymatic reaction의 kinetic을 분석하기 위해서 SmOhyA와 M.lutues ADH와 함께 기질을 반응시켜서 기질인 oleic acid가 SmOhyA에 의해 10-hydroxystearic acid로 전환되고 이어서 ADH에 의해 keto-fatty acid로 전환되는 cascade reaction을 이용할 수 있다(Figure 3). SmOhyA의 반응의 최적 pH 조건인 pH 6.0에서는 ADH의 활성이 좋지 않기 때문에 SmOhyA의 최저 pH 조건인 8.0에서 kinetic 측정을 진행했다. 이때, 기질 ADH로 인한 기질 전환 속도보다 SmOhy로 인한 기질 전환 속도가 pH 환경으로 인해 더 낮기 때문에 ADH에 의해서 생성되는 NADH의 흡광도를 측정해서 SmOhyA의 kinetic을 측정할 수 있다.Figure 3. Stenotrophomonas maltophilia Oleate Hydratase와 Micrococcus luteus Alcohol Dehydratase를 이용한 cascade reaction mechanism재료 및 방법Cultivation and Protein PurificatioL e-tube에 채워 centrifuge(13000rpm, 4℃, 10min) 진행했다. 이후 10mL 주사기로 상층액을 모은 후 0.45μm filter로 filtration했다. 이때, Ni-NTA 500p도 같이 centrifuge(13000rpm, 4℃)를 3분동안 진행하고 상층액을 제거하여 filtration한 용액에 Ni-NTA를 넣고 200 rpm으로 1시간동안 mixing하여 Ni-NTA binding을 진행하였다. 이 상층액을 propylene column에 부어준 후 Flow through sample (column에서 처음 흘러나오는 용액)을 모으고 20 mM Imidazole Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole)로 3번 wash를 진행했다. 이후 Elution Buffer(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM Imidazole) 1mL를 넣고 10분간 정치시킨 후 30 kDa 필터 아미콘에 elution해준다. SmOhyA의 최적 pH 6.0의 조건에 맞게 buffer change(Citrate phosphate buffer pH 6.0) 3 회를 반복하며 농축시켰다. 이후 Nano drop을 이용하여 효소 농도를 측정하여 단백질이 잘 정제되었는 지를 확인하는 과정을 거쳤다.NAD(P)H-based assay[Substrate](mM)Buffer(mL)Cofactor(mL)Substrate(mL)Enzyme1(mL)Enzyme2(mL)DMSO 5%(mL)Total Volume(mL)0.10.1640.010.0020.008560.0050.010.20.50.1560.010.010.008560.0050.010.210.1460.010.020.008560.0050.010.21.50.1360.010.030.008560.0050.010.220.1260.010.040.008560.0050.010.22.50.1160.010.050.008560.0050.010.2Pipet과 e-tic kinetics를 계산하기 위해SmOhyA 효소의 최저조건인 pH8.00에서 M. luteus secondary alcohol dehydrogenase(ADH)보다 반응 속도가 느려, SmOhyA가 반응되는 만큼만 NAD+가 소모된다는 점을 이용하여 실험을 진행했었다. Substrate가 oleic acid일 때 효소 ADH의 농도에 따른 흡광도를 이용하여 NADH 농도를 계산했다.이 때, A는 absorbance, 는 extinction coefficient(, l은 width of the tube holding the sample(0.6cm), c는 molar concentration이다. Product 농도는 NADH 농도이며, 시간에 대한 NADH 농도 그래프 곡선에서 0-time일 때 접선 혹은 linear한 구간에서의 기울기를 통해 초기 속도 V0를 측정한 결과는 다음과 같다(Table 1). 기질의 농도가 증가하며 V0이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.기질농도 (mM)V0 (μmol/min•mg)000.10.31080.50.678210.87531.50.995421.10082.51.1254Table 1. 기질 농도에 따른 V01/[S]1/V000103.21821.47411.1420.6671.0050.50.9080.40.889Table 1을 바탕으로 1/[S], 1/V0을 계산한 결과는 다음과 같다(table 2).Table 2. 1/[기질]에 따른 1/V0고찰 및 결론Oleate hydratase는 oleic acid의 CC 이중 결합에 물을 첨가하여 (R)-10-hydroxystearic acid를 생성하는 촉매 작용을 한다. 효소는 활성 부위 구조를 최적화하는 기능을 가진 FAD 보조 인자를 필요로 한다. 다양한 불포화 지방산은 C10와 경우에 따라 C13 위치에서 수화한다.[1] 본 실험의 target enzyme인 SmOhyA는 NAD+를 cofactor로 사용하지 않기 때문에 단순히 NADH의 흡광도를 측정함으로써 기질의 농도와 e울기는 Km/Vmax이고, y절편은 1/Vmax가 된다. 따라서 y절편과 기울기로 부터 SmOhyA의 Vmax와 Km의 값을 최종적으로 구할 수 있다(Table 3).기질VmaxKmOleic acid4.878U/mg1.161mMTable 4. Vmax, Km 값보다 더 정확한 실험 결과분석을 위해 Oleate hydratase의 잠재적 biotechnological applications에 대해서 분석한 선행 논문(Peter L. H. et al. 2021)을 참고하였다. Ohys의 kinetic assay에 사용될 용액들은 정확한 assay condition을 고려하여 주의해서 사용되어야 하고, 선행 논문에서 제시된 도출된 값은 예외 없이 ‘비활성’ kinetics 조건이며, co-solvent와 같은 실험 조건들에 매우 의존적이다.[1] 논문의 table 1: Enzymatic properties oleate hydratases for which the isolated enzyme has been characterized(Figure 6)에 제시된 SmOhyA의 Km값과 비교해보면, 본 실험 결과에서는 1.161mM, 선행 논문에서는 0.0389mM으로 차이가 상당이 큰 것을 알 수 있다. 이는 선행논문에서 본 실험에서의 효소 활성보다 더 높은 효소 활성과 기질 친화도를 보였다는 것을 의미한다. 논문에서는 분석으로 QC 기계로 product 생성 속도 측정 방법으로 기질의 농도를 정량했고, 본 실험에서는 흡광도 값으로 NAD(P)+/NAD(P)H 변화 속도를 측정하였다는 것에 차이가 있다. 또한, 본 실험에서는 SmOhyA의 kinetics을 측정하기 위해 ADH의 효소를 활용한 cascade reaction의 mechanism이 활용되었다는 점과 사용된 assay condition에서도 Km 결과값의 significant한 차이를 야기할 수 있다고 추측할 수 있다. 뿐만 아니라 선행 논문에서는 SmOhyA의 효소 반응 최적 pH인 6.0에서 실험을 진행한16.
