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[충남대] 분자생물, 생화학 실험 보고서1

Ⅰ. 실험목적과 원리(서론) 생명공학 연구에는 미생물 중 대장균(Escherichia coli, E. coli.)을 흔히 이용한다. 대장균은 정온동물의 창자에서 많이 볼 수 있는 박테리아로 단백질 발현에 대해 가장 일반적인 숙주이다. 대장균과 같은 많은 다른 박테리아에서 유전자 발현을 지배하는 조절서열은 잘 알려져 있고 높은 수준으로 클로닝된 단백질의 발현에 이용된다. (강서만 외 5명, 2014) 박테리아는 실험실에서 보관과 배양이 용이하다는 장점이 있어 주로 사용하는 원핵생물 모델이며, 자가복제를 하는 DNA 고리인 Plasmid DNA를 가지고 있다. 이는 DNA vector(운반체)로써 유전자 재조합 기술의 중요한 재료이다. 본 실험에서 사용되는 대장균은 Hi-control™ BL21(E. coli)로 재조합 단백질 생산을 위한 일반적인 실험실 균주이다. 대장균은 아미노산, 뉴클레오티드 전구체, 비타민 및 세포가 합성해야 하는 기타 대사 산물을 세포에게 제공하는 풍부한 배지에서 더 빠르게 자란다. ( Hyperlink "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=30412361" Curr Protoc Mol Biol, 24년 4월 확인) 여기서 배지(culture medium)란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것이다. (두산백과, 24년 4월 확인) 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나눌 수 있는데, 두 배지의 차이점은 고체배지에는 한천(Agar)을 넣는다는 것이다. 따라서 고체배지는 젤의 형태로 배양 중 관찰이 용이하고, 산소공급이 원활하다는 장점을 가지고 있다. 액체배지는 양분이용이 용이하고, 독성 물질 분산 희석, 배양 중 영양분의 공급과 교체가 용이하다는 장점이 있어 필요한 용도에 따라서 사용한다. 배지의 선택은 실 거품 진동에 의해 생기는 소용돌이 유동을 세포 파괴의 원인이라고 생각할 수 있다. 음파 처리 장치로는 막대모양 진동자를 시료에 담그는 유형과, 진동자를 설치한 욕조 같은 용기에 시료를 넣어 처리하는 유형이 있다. 이러한 초음파 처리를 하게 되면 물리적으로 세포막이 파괴되어 세포 내용물을 방출할 수 있다는 장점을 가지고 있지만, 열을 많이 발생한다는 단점 또한 가지고 있기 때문에 Sonication 주변 온도를 차갑게 해서 진행해야 한다. 단백질은 크기나 전하 그리고 친화력에 근거하여 분리할 수 있다. chromatography(크로마토그래피)란 고정상과 이동상을 이용하여 여러 가지 물질들이 섞여 있는 혼합물을 이동속도 차이에 따라 분리하는 방법이다. 고정상에 강하게 binding하는 성분일수록 고정상에 머무르는 시간이 길어질 것이고, 약하게 binding 하는 성분일수록 빠르게 통과하게 된다. 이처럼 이동 속도 차이, 즉 고정상과의 친화도에 따라 혼합물을 분리하는 것이 크로마토그래피의 기본 원리이다. 이동상이란 세포 파쇄액이나 배지 농축액 등의 단백질 혼합액, 즉 시료를 말하며 고정상은 column 안에 미세구슬로 이루어진 resin을 말한다. 이러한 미세구슬은 각기 다른 작용기를 가지고 있어 단백질을 크기나 전하, 친화력에 따라 분리할 수 있도록 한다. 이 수지는 column안에 차 있으면서 이 사이를 스쳐 지나가는 단백질 용액과 각각 특이한 반응을 일으킨다. 그결과 단백질은 각기 다른 특성을 가지게 되고 여러 속도로 elution되는데 이 차이를 이용해 특정 단백질을 분리할 수 있다. (남상욱 외2인. 2020) 크로마토그래피 기법은 여러 가지가 존재하지만 그 중 단백질 정제에 자주 사용되는 크로마토그래피 기법은 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)이다. 먼저 친화 크로or 1L (23.1g KH2PO4 monobasic, 125.4 K2HPO4 dibasic), 삼각 플라스크 2개, 작은 병, 파이펫 TB med ia for 1L Tryptone 12g Yeast extract 24g 100% Glycerol 4ml KPO4 salts solution 100ml 표1. TB media recipe. ① 1L를 기준으로 DW에 Tryptone 12g, Yeast extract 24g, 50% Glycerol을 8ml 추가하고 혼합물을 stirring해서 잘 섞일 수 있도록 녹여준다. ② KPO4 salts solution는 Autoclave가 끝난 이후에 넣어줄 것이기 때문에, KPO4 salts solution가 들어갈 용량을 제외한 나머지 용량을 맞추기 위해 900ml이 될 때까지 DW를 혼합하여 부피를 맞춘다. ③ 만든 용액을 삼각플라스크 2개와 작은 병에 나누어 담는다. 삼각 플라스크에는 용액을 360ml씩 넣고 작은 병에는 180ml을 넣는다. 이후 플라스크에는 은박지를 씌우고 병은 뚜껑을 닫아 내부에 담긴 배지를 Autoclave(15psi 압력, 121℃)를 이용하여 멸균처리를 한다. ④ 삼각플라스크에는 TB배지를 총 volume 400ml로 맞추기 위해 멸균처리된 배지에 KPO4 salts solution을 40ml씩, 작은 병은 총 volume 200ml로 맞추기 위해 40ml 씩, 작은 병은 총 volume 200ml로 맞추기 위해 20ml을 넣는다. 2. Seed culture – Cell harvest 재료: pETite SUMO IBR5+G in Hicontrol BL21, 15ml test tube, TB배지, 알코올램프, Streaking tool, 카나마이신, Plate, 파이펫, IPTG, Conical tube 1) Seed culture (종균배양) ① 대장균 접종 전 pETite SUMO IBR5+G in Hicontrol BL21 단백질이 cloning되어있는 cell을 새로운 배지에 s), SDS, APS, TEMED, Filter paper, SDS-PAGE gel caster, Water saturated butanol, Tris, Glycine, SDS, MeOH, Acetic acid, Commassie Blue R250 1) SDS-PAGE gel 제작 SDS-PAGE gel caster에 12% Separating gel solution과 4% stacking gel solution을 부어 만든다 For two gels (X2) 12% Separating gel solution 4% stacking gel solution DW 4.014ml 2.4ml 1M Tris pH 8.8 3ml - 1M Tris pH 6.8 - 1.008ml 30% acrylamide (acrylamide:bis-acrylamide = 29:1) 4.8ml 0.528ml 10% SDS 120µl 40µl 10% APS 60µl 20µl TEMED 6µl 4µl X2 total 6µl 4ml 표5. Gel recipe. 전체 조성의 1.1배로 만든다. ① Gel Solution을 만들 때 DW-Tris-SDS-APS-Acrylamide-TEMED의 순서대로 혼합한다. (순서는 몸에 유해하지 않은 순서, TEMED를 넣은 수간부터 굳기 때문에 신속히 작업해주어야 한다.) ② Solution을 vortexing하고 6ml의 Separating gel solution을 gel caster에 넣는다. ③이후 기포를 200µl의 Water saturated butanol을 solution 위에 도포해 제거한다. ④ Gel solution이 굳으면 Water saturated butanol을 filter paper를 이용해 제거한 후 stacking gel solution을 Separating gel위에 2ml도포하고 Comb를 넣고 Gel을 굳혀 Well을 만든다. (다 만들어진 gel은 위에 휴지를 씌우고 물을 부어 labeling한 후 4℃에서 보관한다. 하지만 ℃로 3시간 동안 키워 main culture한 대장균의 OD값을 측정해주는데, 여기서 OD값을 측정하는 이유는 log phase의 세포를 대장균을 사용하기 위해서이다. Log phase의 cell을 이용해야 하는 이유는 첫번째 가장 짧은 시간이 소요되기 때문이다. 재조합 단백질을 발현시키는 과정에서는 에너지가 많이 사용되어진다. 그렇기 때문에 lag phase의 cell부터 이용을 하면 자라는 데 느려 시간이 오래 걸린다. 따라서 Activity한 cell을 접종해야 log phase가 짧아지므로 일부러 log phase의 cell을 사용하는 것이다. 두 번째 이유는 대장균이 거부 반응을 일으키지 않게 하기 위함이다. 식물의 protein을 삽입한 경우, 원래의 E.coli.의 protein이 아니기 때문에 cell이 거부반응을 일으킬 수 있다. 그렇게 되면 E.coli.가 재조합 protein을 degradation(저하) 시킬 수 있고, 만든 재조합 protein이 대장균에게 독성을 일으켜 대장균이 죽어버릴 수 있다. 따라서 세포를 어느정도 불려놓고 protein expression을 진행해야 한다. 이것은 매우 중요한 단계이다. 그렇게 OD값이 적정 단계인 0.6 ~ 1 사이의 값이 나오면 단백질 induction 과정을 진행한다. 단백질을 induction하는 과정에서 incubator에서 20℃로 overnight로 바꾸어 진행한다. 이렇게 해주는 이유는 단백질을 발현시킬 때는 최적 온도가 20℃일뿐더러 단백질을 천천히 만들어주기 위해 20℃의 온도에서 overnight해주는 것이다. 그렇게cell harvest까지 진행 후 세번째 단계인 Ni-NTA purification과정을 하기 전 sonication의 공동형산을 이용해 세포를 파쇄하는 과정을 거친다. 이때 주의해야 할 점이 몇 가지 존재한다. 출처: Hyperlink "https://www.sonicator.com/pages/faq" Sonicator FAQ | Qsonica 사진5. 잘못된보고서

자연과학| 2024.12.04| 23페이지| 2,000원| 조회(201)

분자생물학, 생화학, 충남대

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