SDS - PAGE를 이용한 단백질 크기 측정

소개

SDS PAGE를 이용하여 단백질의 크기를 측정한다.

목차

Introduction & Theory
SDS - PAGE
Disc gel 전기영동의 원리
Data & Result
DISCUSSION

본문내용

SDS - PAGE
Acrylamide gel은 DNA 또는 단백질의 전기영동에 이용될 수 있는데, 특히 단백질의 경우는 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 포함한 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시한다. Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N, N`-methylenebisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 교차연결(cross-link)되어 형성된 polymer이다. SDS-PAGE의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide의 농도와 교차연결 정도에 의해 결정되며 교차 연결시키는 물질이 없는 상태에서 형성된 acrylamide polymer는 쓸모없는 점액성 용액을 이루게 된다.
Bisacrylamide에 의해 교차연결되어 생긴 gel은 gel 자체의 강도와 탄성을 유지하고 SDS-polypeptide가 통과할 작은구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 bisacrylamide acrylamide의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 SDS- polyacrylamide gel은 1:29의 몰 비율로 제조하며 이에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.
gel에서의 단백질의 이동 속도는 다음과 같은 공식을 따른다.

실험을 하는데 있어 각 단백질은 disulfide bond를 형성하고 있어 그 구조가 각기 다르다. 때문에 단백질의 분자량뿐만 아니라 단백질의 구조가 electrophoresis할 때에 영향을 미친다. 이런 구조에 의한 속도차이를 없애기 위해 각각의 단백질의 disulfide를 끊어 주는 β-mercaptoethanol을 넣어 준다. 또한 단백질은 각각의 pH에 따라 charge를 다르게 띄기 때문에 β-mercaptoethanol에 의해 denature 된 단백질에 SDS처리를 해서 negative charge를 띄게 해준다.

Disc gel 전기영동의 원리
보통 SDS-PAGE는 두 가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc(discontinuous pH 또는 disc) gel 전기영동으로 시행하게 된다. 이를 사용하면 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 되고, 그다음에 성질에 따라 분리되게 된다. 따라서 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다. 윗부분의 gel은 stacking gel이라 부르며, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 running gel보다 2 정도 낮은 6.5를 주로 쓰게된다. 아래의 gel은 running gel, resolving gel, separating gel 등으로 불리며, acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용한다.
위의 원리를 이용한 실험 과정은 다음과 같다.

참고자료

· 없음