Lowry assay와 분광학적 정량법(A280)을 통한 단백질 농도 측정

소개

Lowry assay와 분광학적 정량법(A280)을 이용하여 단백질의 농도를 직,간접적으로 측정

목차

Introduction & Theory
Data & Result
DISCUSSION

본문내용

Lowry assay(Folin-Ciocalteau )

Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry 방법에서 사용하는Folin - Ciocalteau 시약에 의한 발색은 뷰렛 시험에서와 마찬가지로 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 포스포몰리브덴산 - 포스포텅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.
Lowry 방법은 단백질의 아마이드 결합에 의한 구리이온의 환원을 토대로 측정하는 방식으로 (Cu2+ --> Cu1+) 따라서 Bradford방법보다는 단백질간의 차이가 거의 없는 정확도를 보여준다. 단점으로는 여러 가지 준비시약이 많이 필요하고 절차가 복잡하다는 점 그리고 다른 화합물에 의해 간섭을 많이 받는 단점을 꼽을 수 있다.

분광학적 정량법(A280)

단백질에 있는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어서의 이 아미노산들의 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 된다. 물론 예외가 있기는 하지만 순수한 단백질의 경우 단백질의 농도가 1mg/ml이고 자외선이 통과하는 경로가 1cm 일 때 280nm에서의 흡광도는 1.0이다. 따라서 대부분의 순수한 단백질의 농도는 280nm 에서의 흡광도를 측장함으로써 신속히 결정할 수 있다. 이 방법은 정량하는 데 시간이 적게 들 뿐만 아니라 정량하고 난 후의 단백질을 완전히 회수하여 재 이용할 수 있는 이점이 있다. 자연물들에는 280nm에서 흡광을 나타내는 그 밖의 화합물들이 많이 있다. 특히 핵산은 260nm에서 최대 흡수를 가지고 있지만 280nm에서도 흡광도가 상당히 크다. 그러 A280/A260을 알면 280nm에서의 핵산의 흡광에 대한 보정을 할 수 있다

참고자료

· 없음