[생화학실험] his-tag 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 (Western Blot Analysis using His-Tag Antibody)

소개

생화학 실험

목차

1. 실험제목
2. 실험일자
3. 목적
4. 원리
5. 시약 및 기자재
6. 방법
7. 결과
8. 고찰
9. further study
antibody(항체)를 이용한 실험의 원리

본문내용

1. Western blot analysis
Western blotting은 protein을 분석하기 위한 중요하고 현대적인 방법이다. Antigen-Antibody reaction을 이용하여 여러 protein 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아낸다. 또한 antigen의 검출과 sterodid-hormone receptor의 검출등에 쓰일 수 있다. 소량의 protein도 검출할 수 있다는 장점이 있다. 이 방법은 protein을 polyacrylamide gel에서 membrane으로 옮기는 과정과 이렇게 옮겨진 protein을 probe하는 과정으로 이루어져 있다.
우선, protein 혼합물을 SDS-PAGE에 running한다. SDS-PAGE에서는 protein이 denature되어 linear상태가 되고 (-)charge로 변하므로 분자량에 따라 분리가 된다. 그다음 단계로 nitrocelluose, PVDF 및 nylone membrane같은 filter(membrane)에 transfer한다. polyacrylacmide gel에 깊숙이 박혀있는 protein은 반응이 일어나기 힘들기 때문에 transfer시킨다. transfer는 전기장을 걸어주어서 (+)전하가 걸리는 membrane쪽으로 (-) charge를 띈 단백질이 이동하는 것을 이용한다. Transfer되는 과정에서 분자량이 작은 단백질은 큰 단백질에 비해 transfer가 잘되지 않는다. 이러한 문제점은 메탄올을 처리하여 hydrophobic interaction을 강화시켜 membrane에 잘 결합하도록 한다.
그 후 원하는 단백질을 Fluorescence(FITC: Fluorescein isothiocyanate), Radioactivity, Enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidsase, glucose oxidase 등)을 이용하여 확인 할 수 있다.

참고자료

· -학부생화학실험(2) 후반부 교재
· -http://blog.naver.com/killer3br?Redirect=Log&logNo=45814630
· -Boyer, 2000. Modern experimental biochemistry.3rd edition. p.321-329, Benjamin Cummings press.
· -Lodish.2003. Molecular cell biology 5th edition p.614, p178-180, p187. Freeman