플라스미드 DNA의 정제

소개

분자생물학 <플라스미드 DNA의 정제> 레포트입니다.

목차

1. Title : tooth sticking, phenol cracking, plasmid purification
2. Date : 2007년 5월 17~19일
3. Co-worker : anybody
4. Introduction :
(1)플라스미드 DNA 의 정제
1) 크기에 기초한 분리
2)구조에 기초한 분리
(2)세포추출물에서DNA 의 정제
(3) DNA 침전
5. Method
1) tooth sticking
2) phenol cracking
3)plasmid purification
6. Result
7. Discuss

본문내용

4. Introduction
(1)플라스미드 DNA 의 정제
박테리아 배양액으로부터 플라스미드를 정제하는 것은 세포 저네 DNA 제법과 같은 일반적인 방법을 포함한다. 플라스미드를 함유한 세포를 액체배지에 키워서 세포추출물을 얻는다. 추출물에서 RNA 와 단백질을 제거하고 에탄올 침전법으로 DNA를 농축시킨다.
농축된 DAN 는 플라스미드와 염색체l DNA 가 모두 포함되어있으므로 세포에 존재하는 다량의 박테리아 염색체 DNA 로부터 분리시켜야만 한다. 두 가지 형태의 DNA를 분리시키는 것은 매우 어려운 일이지만 플라스미드를 클로닝 운반체로써 사용한다면 피할 수 없는 일이다.
플라스미드 DNA와 박테리아 DNA간의 물리적인 차이에 기초한 몇 가지 방법이 있는데, 이들 중 가장 정확한 방법은 크기로 분리하는 것이다. 가장 큰 플라스미드는 대장균의 염색체 크기의 8% 밖에 되지 않고 대체로 이보다 훨씬 작다.
크기 뿐 만 아니라 플라스미드와 박테리아 DNA 는 구조의 차이로도 분리 할 수 있는데, 플라스미드와 박테리아 염색체는 원형이지만 세포 추출물 제법 동안에 염색체는 항상 선형 단편으로만 쪼개지게 된다. 이들 선형분자로부터 원형분자를 분리해 냄으로써 순수한 플라스미들 확보할 수 있다.

1) 크기에 기초한 분리
세포를 철저하게 조절된 조건에서 용해 시켜서 DNA의 손상을 최소화해야 한다. 얻어진 DNA 단편은 여전히 플라스미드 보다 훨씬 더 크기 때문에 원심분리에 의해 세포 단편들과 함께 제거될 수 있다. 박테리아 염색체는 세포 외피에 물리적으로 붙어 있으며, 이러한 접착이 깨어지지 않으면 세포파편과 함께 침전되므로 이 과정에서 도움이 된다.
세포 파괴는 박테리아 DNA의 전체 파손을 막기 위해 매우 조심스럽게 수행되어야 한다. 대장균과 그와 관련된 종은 아주 조절된 상태에서 용해시킬 수 있다. sucrose 존재 하에 EDTA 와 lysozyme 처리를 해주면 세포가 직접 파손되는 것을 막는다. 그 대신 완전한 세포막을 유지하면서 세포벽이 없는 원형질체가 형성될 것이다. 거기에 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 세제를 첨가시킴으로써 세포가 용해된다.

참고자료

· 없음