PCR, genotyping

소개

gDNA의 농도를 계산하고 genotyping한 레포트

목차

Abstract
Introduction
Material
Method
Results
Discussion
References

본문내용

Abstract
이 실험은 DNA isolation을 시킨 뒤 그 농도와 purity를 측정하는 것과, 특정 gene을 PCR을 통해 genotyping 하는 것이다. genomic DNA의 농도는 reference를 따라 OD260값을 이용하여 계산할 수 있다. purity는 OD260/OD280값이 1.75가 넘는 것은 오염되지 않은 것으로 판정한다. 농도와 purity는 어렵지 않게 구할 수 있다. genotyping에 사용한 gene은 p53이다. genotyping을 통해 -- genotype의 knockout mouse cell을 확인할 수 있는데, 이번 실험에서는 chimera의 crossbreeding을 통해 멘델의 법칙이 적용되었는지 정도만 확인하였다. 결과는 ‘++:+-:-- = 2:2:1‘로서 정확히 들어맞지 않았다.


Introduction
DNA isolation은 DNA를 모아 다음 단계의 실험으로 나아가기 위한 단계이다. 먼저 grinding이나 sonication을 통해 cell을 부수고 detergent를 처리하여 막의 지질을 제거한다. 그리고 proteinase의 사용, 혹은 sodium/ammonium acetate를 처리해 침전시키거나, phenol-chloroform extraction step을 통해 DNA에 붙어있는 histone이나 cellular protein을 제거해준다. DNA가 알코올에 녹지 않고 서로 엉기기 때문에 찬 에탄올이나 isopropanol에 넣어 DNA를 침전시킬 수 있다. 이 단계에서는 또한 salt가 제거된다. DNA pellet을 알코올로 다시 씻어준 뒤 약 알칼리성의 버퍼에 녹여주면 DNA isolation이 끝난다.
DNA 용액의 purity 측정을 위해 260, 280nm의 wavelength가 사용된다. DNA는 260nm의 UV, protein은 280nm의 UV를 흡수한다. pure DNA의 경우 ratio(OD260/OD280)가 1.75 가량으로서 protein contamination에서 상대적으로 자유로움을 보이는 기준 값이다. protein contamination이 있을 경우 1.75보다 작은 값을 나타낸다. DNA는 restriction enzyme으로 잘라 그 양을 측정할 수도 있다. agarose gel에 걸어 ethidium bromide 혹은 다른 염색약을 통해 염색 후 알려진 농도의 DNA marker와 강도를 비교하면 된다. 정량된 DNA

참고자료

· 없음