[세포생물학]Digestion of DNA using restriction enzyme(제한효소를 이용한 DNA절단)

소개글

DNA의 절단

목차

DNA의 절단
Restriction Enzyme
Methylation
STAR활성
@ Restriction Enzyme의 이용
@ 제한효소를 이용한 DNA의 절단

본문내용

DNA는 plasmid 와 같이 일반적으로 Supercoiled의 형태를 이루고 있다. Electriphoresis 시, Agarose gel상에서 DNA를 전기영동할 때 작은 DNA는 쉽게 통과하여 빨리 내려가지만 큰 DNA는 쉽게 통과하지 못해 느리게 내려간다. DNA의 supercioiled 구조는 DNA의 부피를 작게 만들기 떄문에 빠르게 하강을 할 수가 있다. 제한효소를 처리하면 이러한 구조를 형성하지 못하고 Linear구조를 이루게 된다.

* 절단할 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 신경을 쓸 부분은 아니다.
* Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 간혹 있다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.
* DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 있으므로 DNA를 제외한 여분의 물질이 최대한 없도록 한다.
* 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으나, 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.
* 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 "star activity"라 불리는 현상이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.
STAR활성 이란, 제한효소 중에는 기질이 되는 DNA에 대하여 특정한 반응조건 하에서 사용하면 그 특이성이 저하하여 본래의 인식서열과 다른 염기서열을 절단하는 것을 말한다. STAR활성의 출현빈도는 효소, 기질DNA, 반응조건에 따라 다르나 거의 모든 제한 효소가 STAR활성을 갖는다고 볼 수 있다. 이러한 STAR활성을 억제하기 위해서는 낮은 글리세린 농도, 중성pH, 높은 염 농도 상태에서 실험하는 것이 좋다.

따라서 제한효소를 처리한 것(linear)은 그렇지 않은 것(Supercoil)에 비해 느리게 내려가게 되는 것이다.

참고 자료

없음