Gene Cloning

소개

자연계에 존재하는 미생물의 1%만이 실험실의 인공적인 조건에서 배양이 가능하며, 나머지 대다수의 많은 미생물은 실험실에서 배양되지 않는다. 하지만 배양 불가능한 미생물의 연구 필요성 증가하게 되었고 이에 Gene cloning이란 방법이 고안되게 되었다. 이에 Metagenome을 이용하여 다양한 자연환경의 microbial community structure와 diversity를 연구 할 수 있었다.

목차

Metagenome Extraction Method
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Transformation
Plasmid Miniprep kit

본문내용

Gene cloning
세포 실험을 하기 위해서는 동일한 세포의 집합이 필요하듯이, 유전자 연구를 하기 위해서는 동일한 유전자를 다량 가지고 있어야 한다. 이렇게 동일한 유전자의 집합을 만드는 과정이 바로 gene cloning이다. 그 과정은 아래와 같다.
1. Metagenome Extraction Method
2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
3. Transformation
4. Plasmid Miniprep kit

1. Metagenome Extraction Method
Metagenome: 자연계에 존재하는 수많은 미생물의 genome이 서로 섞여 있는 형태를 뜻한다. 토양과 해수, 갯벌, 하천, 대기, 가축의 대장 등 다양한 자연환경으로부터 채취한 미생물의 DNA가 그 종에 따라 분리된 것이 아니라 서로 혼재돼 섞여 있는 형태가 Metagenome이다.

Metagenome Extraction Method
1.1g(5g)의 soil을 2.5ml(12.5ml)의 SSP buffer에 넣고 37℃에서 1시간동안 incubate하면서 가끔 씩 shaking시켜준다.
2. 450ul(1875ul)의 5M NaCl을 넣고 조심스럽게 vortex 시켜준다.(5초)
3. 375ul(1875ul)ml 10% CTAB을 넣고 10초 정도 조심스럽게 vortex한 후에, 65℃에서 20분간 incubate시킨다.
4. chloroform을 one volume넣고 조심스럽게 vortex한다.(5초)
5. 새 tube에 옮겨 담고 9000g and 4℃에서 15분간 centrifuge한다.
6. 상층액을 건져 내고 isopropanol을 one volume넣어준 후 -20℃에서 1시간동안 incubate시 킨다.
7. 1000g and 4℃에서 15분간 centrifuge한다.
8. DNA pellet 생성
9. 80% EtOH washing.
10. TE 500ul에 녹임.

(시약의 효능)
SSP buffer : 120mM Na2HPO4 +1%SDS +proteinase K (Na2HPO4 는 dibsic으로 ph 를 조절하고 SDS는 계면활성제의 일종으로 지방분자를 제거시켜 핵막과 세포막등의의 용해과정을 도와준다. 또 proteinaseK는 단백질 분해효소로 세포추출물을 처리한다.)
5M NaCl: 핵산과 결합하여 DNA를 안정화 시킨다.
CTAB : CTAB 핵산과 불용성 복합체를 형성한다. CTAB이 핵산-CTAB 복합체가 침전되고, 단백질같은 불순물은 승등액에 남겨둔다.
Chloroform: 유기용매인 Chloroform은 DNA용액 중의 단백질을 변성시켜서 제거하고 지질제거에도 효과적이다. Chloroform은 유기용매이기 때문에 pipet으로 용액을 채취할 때 흐를 수 있으므로 천천히 용액을 다루어야 한다.
Isopropanol: Isopropanol은 단백질과 DNA를 분리해 주는 역할을 한다. Isopropanol을 넣고 원심분리 하게 되면 두 층으로 나뉘어 지는데 하나는 단백질이 들어있는 Chloroform 하나는 DNA가 있는 층이다.
EtOH: EtOH washing의 목적은 더욱 정제된 DNA를 얻기 위해서이다.
TE: DNA 는 이름 그대로 산(acid)이기 때문에 수용액에 있으면 조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상되므로 TE와 같이 pH 8.0인 buffer에 DNA를 넣어준다.

참고자료

· http://www.dynebio.co.kr/institute/institute01.asp
· http://biochemistry.yonsei.ac.kr/
· http://bio-rad.com/B2B/BioRad/
· 유전자 클로닝 입문/제4판