[생물학실험]Protein Over-expression (단백질 과발현)

소개

서울대학교 생물학 실험에서 수강한
단백질 과발현에 대한 보고서 입니다.

목차

1. title
2. date
3. purpose
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본문내용

1. title
- Protein Over-expression (단백질 과발현)

2. date
- 2006. 5. 18.

3. purpose
- 특정 단백질을 재조합된 유전자를 이용하여 대장균을 형질전환 시키고, 대장균을 이용하여 유전자의 산물인 단백질을 과발현(Over-expression)시키고, 확인함으로써 유전공학의 기초적인 방법을 이해한다.

4. introduction
① 오페론(Operon)
② 과발현(Over-expression) 시키는 이유
③ SDS Page의 원리
④ IPTG 란 무엇인가?

5. material & method
* Pre-step
1. 40ml의 LA(LB+ampicillin)에 transformants 및 control을 각각 접종하여 pre-culture(o
ver-night)
2. 40ml의 LA에 transformants 및 control을 각각 접종하여 OD 600nm에서 0.5까지 키운다.
3. 0시간의 control과 IPTG를 넣고(1mM) 1시간, 3시간째 cell을 각각 4℃에서 induction을 정지시킨다.
4. Cell을 12,000rpm에서 1분간 원심분리 후 상등액을 버린다.

* SDS-PAGE Gel
1. IPTG induction 0(control),1,3시간에 sample buffer(2×) 100㎕와 DW 100㎕ 넣고 pipetting& vortexing.
2. 95℃에서 5분간 boiling
3. Spindown 후 10㎕만 loading, Marker(SeeBlue Plus2, Invitrogen)도 함께 loading
4. 125V로 2시간(1시간30분)이상 running.
5. Coomassie staining 후 Destaining
6. Gel에서 overexpression 된 protein band 확인

* Coomassie brilliant blue로 SDS-polyacrylamide gel의 염색방법
1. 0.25 g의 Coomassie brilliant blue R250을 10% acetic acid, 45% methanol 혼합용액
2. Gel을 적어도 5배 부피에 해당하는 염색액에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서히 흔든다.

3. 염색액을 제거한 후 염색약이 포함되지 않은 10% acetic acid, 45% methanol 용액(destaining solution)에 gel을 담가 두어 탈색시킨다.
4. 탈색용액을 여러차례 갈아 주면서 관찰한다. 보통 24시간 탈색을 하면 단일 띠로 0.01 mg의 단백질까지 찾아낼 수 있다.

참고자료

· ① 『hemicellulose 응용연구법-기능성 올리고당 생성 및 응용에 관한 미생물공학 실험서』, 박귀근 , 월드사이언스 , 2005년 , p64-p71
· ② 『생물유기화학』, 손기남 · 홍남주 , 미학사 , 2001년 , p337-p367
· ③ 『약품생화학실험』, 약품생화학분과위원회 저, 동명사 , 2000년 , p35-p37
· ④ 연세대학교 의과대학 생화학 - 분자생물학교실
· (http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/protein_purify_ep.php)
· ⑤ 연세대학교 생화학-분자생물학 교실 사이트
· (http://biochemistry.yonsei.ac.kr)
· ⑥ 네이버 백과사전
· (www.naver.com)