이화여대 생명과학실험2 A+ 레포트_ 크로마틴 기본 구성 단위인 뉴클레오좀 DNA의 분리 및 확인

소개

A+ 받은 레포트 입니다.

목차

Ⅰ. Abstract
II. Introduction
III. Result
Ⅳ. Discussion
Ⅵ. References

본문내용

Ⅰ. Abstract
본 실험의 목적은 MNase를 이용해 크로마틴을 절단하여 뉴클레오좀 DNA를 분리하고 반응 시간 차이에 따라 생성되는 DNA 단편의 패턴을 비교하는 것이다. 이를 위해 HEK293T 세포 5×10⁶개를 수확한 뒤 digestion buffer를 처리하고 동일한 부피로 분주하여 uncut, 3분, 5분 조건에서 MNase 반응을 수행하였다. 이후 stop buffer로 효소 활성을 억제한 뒤 proteinase K와 SDS를 사용해 단백질을 제거하고, phenol/chloroform 추출과 ethanol 침전을 거쳐 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA pellet은 DW로 용해하여 Nanodrop으로 농도를 확인하였으며 각 시료에서 동일한 양인 1µg의 DNA를 loading하여 agarose gel 전기영동을 진행하였다. 본 과정을 통해 MNase 처리 시간 증가에 따라 nucleosome 단위 절단 양상이 어떻게 달라지는지를 확인하고 크로마틴의 구조적 특징을 평가하였다.

II. Introduction
① Phenol/chloroform extraction의 원리
Phenol/chloroform extraction은 용매의 극성 차이와 밀도 차이를 이용해 DNA와 단백질을 분리하는 방법이다. 우선 밀도가 더 높은 페놀은 아래층을, 물은 위층을 형성하여 두 층이 분리된다. 물의 경우 산소 원자의 전기음성도가 커서 수소로부터 전자를 끌어당기기 때문에 부분 음전하를 띠며 극성이 높은 용매이다. 그러나 phenol은 산소를 포함하고 있지만 phenyl ring의 전자 구조로 인해 그 효과가 상쇄되어 물보다 극성이 낮다. 보통 극성 물질은 극성 용매에, 비극성 물질은 비극성 용매에 잘 녹는데 DNA는 음전하를 띠는 phosphate backbone을 가지고 있어 극성이 강하므로 비극성 용매인 phenol로 이동하지 않고 극성 용매인 수용액층에 남는다. 그리고 단백질은 아미노산으로 구성되어 side chain에 따라 극성과 성질이 다르다. 일반적으로 비극성 side chain을 가진 단백질은 물과의 접촉을 피하기 위해 내부로 향하고 극성 side chain을 가진 단백질은 물과 상호작용하기 위해 외부로 향한다. 그러나 단백질이 phenol과 같은 덜 극성인 용매에 노출되면 구조가 뒤집히면서 내부에 있던 비극성 side chain이 외부로 노출되고, 극성 side chain은 안쪽으로 들어가게 된다. 이러한 구조 재배열로 인해 단백질은 변성이 되어 비극성 용매인 phenol층으로 이동하게 된다. 따라서 단백질은 phenol층으로, DNA는 수용액층으로 분리되어 정제할 수 있게 되는 것이다. 추가로 phenol은 물보다 밀도가 약간 높기 때문에 수용액층의 염 농도나 용질 조성에 따라 밀도 차이가 줄어들면 phase inversion이 일어나 수용액층이 아래로 가라앉는 현상이 발생할 수 있다. 이를 방지하기 위해 물보다 밀도가 훨씬 높은 chloroform을 함께 혼합하여 밀도를 높이는 것이다.

참고자료

· Bitesize Bio. How phenol extraction of DNA works. https://bitesizebio.com/384/the-basics-how-phenol-extraction-works/
· Bitesize Bio. Phenol/chloroform extraction. https://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenol-chloroform-extraction/
· Bitesize Bio. Acid phenol–chloroform extraction. https://bitesizebio.com/31609/acid-phenol-chloroform-extraction/
· Bitesize Bio. Ethanol precipitation of DNA/RNA. https://bitesizebio.com/253/the-basics-how-ethanol-precipitation-of-dna-and-rna-works/
· Thermo Fisher Scientific. Assessment of nucleic acid purity.
· https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/TN52646-E-0215M-NucleicAcid.pdf
· Wikipedia. MNase-seq. https://en.wikipedia.org/wiki/MNase-seq
· Hubei New Desheng Materials. Role of Tris-HCl in DNA extraction.
· https://www.hbdsbio.com/the-role-of-tris-hcl-buffer-in-dna-extraction.html
· Wikipedia. Lysis buffer. https://en.wikipedia.org/wiki/Lysis_buffer