서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 4차 풀레(A)-저온유도성 유전자 발현 조절

소개

"서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 4차 풀레(A)-저온유도성 유전자 발현 조절"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. References

본문내용

1. Abstract
본 실험은 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 애기장대에 저온 유도성 유전자인 CBF를 deletion 하고 그 결과를 확인하는 데 그 목적이 있다. 애기장대는 저온 스트레스에서 CBF1, CBF2, CBF3 유전자를 발현하는데, 이 세 유전자는 상호 보완적인 기능을 가진다. CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 세 유전자를 deletion 시키기 위해 cas9 gene과 sgRNA gene이 담긴 binary vector와 helper plasmid만 가지는 agrobacterium을 애기장대에 whole seedling infiltration 한다. 이후 식물 세포벽과 세포막을 lysis 하고 다당류와 결합하는 CTAB buffer와 DNA 손상을 방지하는 β-Mercaptoethanol를 사용해 cell lysis를 진행하고 chloroform과 isopropanol을 사용해 genomic DNA를 확보한다. 이후 general PCR과 nested PCR을 진행해 CBF가 제대로 deletion 되었는지 DNA 형태로 이를 확인한다. nested PCR은 1차, 2차 PCR로 진행되는데 1차 PCR product와 더 좁은 영역의 primer를 사용하여 deletion 된 DNA를 특이성 높게 검출할 수 있다. 실험 결과 sample 1, 3, 4에서 0.4 kb 부근의 band를 확보하여 CBF123의 deletion이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 또한 luminescence imaging을 통해 실제로 CBF gene의 기능이 사라졌는지 확인한 결과 WT가 CBF123 deletion sample보다 높은 형광 intensity를 보여 CRISPR/Cas9 시스템이 정상적으로 작동했음을 확인하였다. luminescence imaging은 CBF에 의해 발현되는 RD29A gene promoter 뒤에 luciferase reporter gene을 결합해 저온 스트레스에서 lumiferase의 luminescence를 통해 CBF123 발현을 시각화하는 방법이다.

2. Introduction
Agrobacterium의 Ti plasmid는 copy 수가 적고 크기가 커서 형질전환에 사용 시 효율이 떨어지는 단점이 있기 때문에 이를 Vir gene만 가진 helper plasmid와 T-DNA만 가진 Binary vector로 나눈 이원화 시스템을 사용한다. 본 실험에서 사용하는 Agrobacterium은 Ti plasmid 대신 Binary Vector에 있는 T-DNA를 식물체로 전이하는 Helper plasmid만을 가진다.

참고자료

· Shi, Y., Ding, Y., & Yang, S. (2018). Molecular regulation of CBF signaling in cold acclimation. Trends in Plant Science, 23(7), 623–637.
· Zhang, F., Lu, Q., Qian, X., Xing, Y., & Wang, W. (2025). Development of knockout cardiac muscle cell lines using integrase-deficient lentivirus-mediated CRISPR/Cas9 gene editing. Biochemical Genetics, 1–20. https://doi.org/10.1007/s10528-025-11300-2
· Cho, S., Yu, S., Park, J., Mao, Y., Zhu, J.-K., Yun, D.-J., & Lee, B. (2017). Accession-dependent CBF gene deletion by CRISPR/Cas system in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science, 8, 1910.