현대생물학실험2 4차 풀레 Site-directed Mutagenesis/DNA sequencing(A0)

소개

"현대생물학실험2 4차 풀레 Site-directed Mutagenesis/DNA sequencing(A0)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Meterial & Method
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 Site-directed mutagenesis를 통해 GFP에 두 가지 서열을 mutation 한 후 mutation 위치를 protein BLAST를 통해 확인한 후, 이전 실험에서 cloning에 사용한 target gene을 DNA sequencing website를 통해 알아내는 것에 그 목적이 있다. Site-directed mutagenesis는 DNA 염기서열에 인위적으로 mutation을 도입하는 방법으로 본 실험에서는 GFPuv에 Y66H, Y66H/Y145F mutation을 도입하였다. 이 방법을 사용한 후 PCR을 돌리면 original template DNA와 mutated DNA가 생성된다. mutated DNA만 확보하기 위해 메틸화된 DNA만 선택적으로 제거하는 DpnⅠ를 사용한다. DpnⅠ을 사용하기 위해서는 template DNA가 메틸화되어 있어야 하기 때문에 adenine(A) 부위에 메틸기를 붙이는 Dam methylase가 함유된 strain에서 template DNA를 확보한다. PCR에서 사용하는 Pfu polymerase는 Taq DNA polymerase에 비해 열 안정성이 뛰어나고 정확도가 높다. mutation을 도입한 GFP를 competent cell에 형질전환하고 ampicillin agar plate에 배양하였다. plate에서 형광녹색, 희미한 파란색, 선명한 파란색 colony가 발견되었고, double mutation이 일어난 Y66H/Y145F mutated GFP가 Y66H에 비해 형광을 강하게 발함을 알 수 있었다. wild type, Y66H, Y66H/Y145F plate에서 모두 wild type GFP의 colony가 발견되었는데, 이는 template DNA의 메틸화가 제대로 이루어지지 않아 생긴 오차로 예상한다. 이후 mutation 위치를 Clustal Omega를 통해 확인하였다. Finch TV, Nucleotide BLAST, Protein BLAST를 사용하여 한 학기 동안 사용한 target DNA의 서열을 통해 서열의 주인이 누구인지 확인한 결과 GFP superfamily의 SGFP2 임을 확인하였다. 서열이 완전히 일치하지는 않았는데 이는 실험 과정에서 생긴 오류로 인한 것이라 예상한다.

참고자료

· Giron, M. D., & Salto, R. (2011). From Green to Blue: Site-Directed Mutagenesis of the Green Fluorescent Protein to Teach Protein Structure-Function Relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education, 39(4), 309–315.
· Ong, J. L., & Potapov, V. (2017). Examining Sources of Error in PCR by Single-Molecule Sequencing. PLOS ONE, 12(1), e0169774. doi:10.1371/journal.pone.0169774
· Potapov, V., & Ong, J. L. (2017). Investigating polymerase base substitution errors and DNA damage induced by thermocycling. PLOS ONE, 12(1), e0169774.