생화학실험레포트_Bradford assay

목차

Ⅰ. Title

Ⅱ. Date

Ⅲ. Key-word

Ⅳ. Theory
1. Bradford reagent
2. 단백질을 정량하는 다른 방법

Ⅴ. Regent & Apparatus

Ⅵ. Procedure

Ⅶ. Observation

Ⅷ. Result
1. BSA로부터 얻은 교정 곡선
2. 측정한 흡광도 값으로부터 미지 시료에 포함된 protein 농도(mg/mL)

Ⅸ. Discussion
1. Bradford assay 원리 (Coomassie brilliant blue G-250, Beer-Larmbert law, 적용 가능 농도 범위 등)
2. Bradford reagent에 포함된 phosphoric acid의 역할

본문내용

Bradford assay은 용액 내 단백질 농도를 분광 광도계를 사용해 측정하는 방법이다. 이 방법은 특정 염료인 Coomassie Brilliant Blue G-250의 색 변화와 흡광도 차이를 이용해 단백질을 정량화하는 것이다. Bradford assay에서 염료는 산성 조건에서 적색을 띠며, 단백질과 결합하면 청색으로 변한다. 이러한 색 변화는 단백질과 염료가 상호작용 하여 단백질-염료 복합체를 형성하는 과정에서 발생한다. 아르기닌과 라이신 등과 같이 단백질의 양전하를 띠는 아미노 산 잔기와 비극성 부위는 염료와 비공유결합 및 이온 결합을 형성한다. 예를 들어, 단백질의 아민기와 염료의 음전하 영역이 이온 결합을 이루며, 소수성 상호작용과 반데르발스 힘도 복합체의 안정성을 증가시킨다. 이렇게 염료가 단백질 과 결합하면서 전자 구조가 변화해 더 안정적인 파란색 형태를 띠게 되며, 595nm 파장의 빛을 가장 잘 흡수한다. 반면, 단백질과 결합하지 않은 상태의 염료는 주로 적갈색을 띠며 465nm에서 최대 흡광도를 보인다. 단백질 농도가 높을수 록 더 많은 염료가 단백질과 결합하고, 595nm에서 측정되는 흡광도도 이에 비례하여 증가하게 된다. Bradford assay 는 실험 과정이 매우 간단하고, 다른 단백질 정량법과 비교해 가장 신속하게 진행할 수 있다는 장점이 있다. 또한 모든 과정이 실온에서 이루어지므로 특별한 온도 조절 장치를 필요로 하지 않는다. 민감도가 높기 때문에 1 ~ 20 μg 범위의 단백질의 농도가 낮은 시료에서도 정량이 가능하며, 단백질이 완충 용액이나 방부제와 같은 물질과 함께 있어도 간섭을 받지 않기 때문에 상대적으로 정확한 측정이 가능하다는 장점이 있다. 그러나 시료에 SDS와 같은 계면활성제가 포함되 어 있으면 측정 결과가 부정확할 수 있으며, 반응이 산성 조건에서 이루어지기 때문에, 지질 함량이 높은 시료에서는 침전물이 형성되어 흡광도 측정의 정확도가 떨어질 수 있다는 단점이 있다.

참고자료

· 부성희 외 4인, 생화학 실험, 제2판, 2019, 청문각, p.39~p.47
· Lehninger Principles of Biochemistry (Nelson 외 저, 5판, Freeman)
· Bradford, MM(1976) Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem 72: 248-254
· Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol. Chem. 193: 265-75